Artykuł metodologiczny

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64574

⸱

14 września 2022

 ,  , 
1Department of Neurology, Yale University, 2Department of Neuroscience, Yale University, 3Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Streszczenie

Zakończenia synaptyczne są głównymi miejscami komunikacji neuronalnej. Dysfunkcja synaps jest cechą charakterystyczną wielu zaburzeń neuropsychiatrycznych i neurologicznych. Charakterystyka podprzedziałów synaptycznych za pomocą izolacji biochemicznej jest zatem potężną metodą wyjaśniania molekularnych podstaw procesów synaptycznych, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Protokół ten opisuje izolację zakończeń synaptycznych i podprzedziałów synaptycznych z mózgów myszy poprzez frakcjonowanie subkomórkowe. Po pierwsze, uszczelnione struktury końcówek synaptycznych, znane jako synaptosomy, są izolowane po homogenizacji tkanki mózgowej. Synaptosomy to neuronalne przedziały pre- i postsynaptyczne z ściśniętymi i uszczelnionymi błonami. Struktury te zachowują metabolicznie aktywny stan i są cenne dla badania struktury i funkcji synapty. Synaptosomy są następnie poddawane hipotonicznej lizie i ultrawirowaniu w celu uzyskania podkompartmentów synaptycznych wzbogaconych o pęcherzyki synaptyczne, cytozol synaptyczny i błonę plazmatyczną synaptyczną. Czystość frakcji potwierdza mikroskopia elektronowa i analiza wzbogacenia biochemicznego białek specyficznych dla przedziałów subsynaptycznych. Przedstawiona metoda jest prostym i cennym narzędziem do badania cech strukturalnych i funkcjonalnych synapsy oraz etiologii molekularnej różnych zaburzeń mózgu.

Wprowadzenie

Synapsy są podstawowymi jednostkami obliczeniowymi mózgu, za pomocą których neurony komunikują się i wykonują różnorodne i niezwykle złożone funkcje. Synapsy mają zatem fundamentalne znaczenie dla zdrowia mózgu1; Dysfunkcja synaps jest uważana za źródło lub wynik wielu zaburzeń2. Synapsy składają się z zakończeń pre- i postsynaptycznych, przedłużeń dwóch różnych neuronów, które są ściśle przylegające i oddzielone szczeliną synaptyczną przeciętą przez cząsteczki adhezyjne synaptyczne. Informacja przepływa z przedziału pre- i postsynaptycznego w postaci przekaźników chemicznych zwanych neuroprzekaźnikami1. Procesy molekularne związane z neuroprzekaźnictwem są aktywnymi obszarami badań3,4,5. Zrozumienie procesów patogennych w obrębie zakończeń synaptycznych i odpowiedzi synaps na patologię w innych podprzedziałach neuronalnych jest kluczowym krokiem w leczeniu zaburzeń mózgu1,2. Kilka postępów metodologicznych, zastosowanych głównie do modeli mysich, posunęło naprzód to dążenie6. Izolacja frakcji synaptycznych za pomocą wirowania różnicowego jest jedną z takich metod zmieniających paradygmat, która umożliwiła szczegółową ocenę procesów synaptycznych w zdrowiu i chorobie.

Mózg dorosłego człowieka składa się z 80-90 miliardów neuronów7,8. Wśród gatunków mysich mózg szczura zawiera około ~200 milionów neuronów, podczas gdy myszy mają ~70 milionów9,10. Każdy neuron tworzy tysiące specyficznych połączeń synaptycznych z siecią wysoce spolaryzowanych neuronów zmieszanych z komórkami glejowymi i gęstym unaczynieniem. W tak złożonej i niejednorodnej tkance kiedyś nie do pomyślenia było izolowanie i badanie synaps jako niezależnego systemu. W latach sześćdziesiątych XX wieku Victor Whittaker, Catherine Hebb i inni umożliwili to, izolując nienaruszone zakończenia synaptyczne za pomocą subkomórkowego frakcjonowania11,12,13,14. Próbując wyizolować pęcherzyki synaptyczne (SV), homogenizowali mózgi za pomocą siły ścinającej ciecz w izoosmotycznej (0,32 M) sacharozy, a następnie ultrawirowania. Uzyskali ściśnięte, otoczone błoną plazmatyczną, nienaruszone zakończenia nerwowe lub żylaki, które nazwali cząstkami zakończeń nerwowych (NEPs)11,13. Ponieważ strukturalne i funkcjonalne cechy synapsy zostały zachowane w tych strukturach, NEP-y zostały później nazwane "synaptosomami" w celu zgodności z innymi organellami subkomórkowymi13,15. Warto zauważyć, że praca Eduardo de Robertisa i współpracowników, którzy ukuli termin "pęcherzyk synaptyczny", pokrywała się z pracami Whittakera i współpracowników i przyczyniła się do walidacji izolacji i charakterystyki "synaptosomu"16,17,18.

Synaptosomy to fizjologicznie aktywne struktury, które zawierają wszystkie właściwości komórkowe i molekularne niezbędne do przechowywania, uwalniania i wychwytu zwrotnego neuroprzekaźników13,18. Zachowanie kluczowych cech synaptycznych in vitro i brak składników niesynaptycznych również przyczynia się do użyteczności tej metody izolacji. Synaptosomy w ogromnym stopniu przyczyniły się do zrozumienia chemicznych i fizjologicznych właściwości neuroprzekaźnictwa, a obecnie są wykorzystywane do badania synaptycznych procesów molekularnych i ich zmian w chorobie19,20,21,22,23. Synaptosomy są również początkowym materiałem źródłowym do izolowania składników synaptycznych, takich jak SV, pęcherzyki pokryte klatryną (CCV), cytozol synaptyczny, błona plazmatyczna synaptyczna, mitochondria synaptyczne, cząsteczki adhezji synaptycznej i inne składniki będące przedmiotem zainteresowania, które mogą ułatwić zrozumienie molekularnych mechanizmów funkcji synaptycznej18,19,20,24,25,26,27,28. Te subsynaptyczne składniki można uzyskać przez osmotyczną lizę synaptosomów i ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy15,29. Chociaż oryginalna metoda frakcjonowania subkomórkowego opracowana przez grupę badawczą Whittakera jest znana z tego, że jest skuteczna w izolowaniu wysokiej jakości synaptosomów i SVs13,30, ostatnie optymalizacje zwiększają czystość frakcji subkomórkowych22,23,31,32. Ten artykuł zawiera bardzo szczegółową i przystępną wersję klasycznego protokołu subkomórkowego frakcjonowania mysiej tkanki mózgowej w celu wyizolowania synaptosomów, SV i innych składników subsynaptycznych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Yale (protokół 2021-11117) i przeprowadzone w placówce akredytowanej przez Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Opieka nad zwierzętami i ich zakwaterowanie były zgodne z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals33 i zapewniało je Yale Animal Resource Center (YARC). Zwierzęta utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Do poniższego protokołu wymagane jest od pięciu do ośmiu myszy lub od dwóch do czterech szczurów na genotyp lub warunek. Mniejsza liczba szczurów jest konieczna ze względu na większą objętość ich mózgów. Podobnie wiek zwierząt doświadczalnych może wpływać na wydajność frakcji; w przypadku zwierząt w wieku poniżej 2 miesięcy może być wymagana większa liczba myszy. W przeciwnym razie opisane procedury mają zastosowanie do obu gatunków gryzoni oraz zdrowych dorosłych zwierząt w każdym wieku. Reprezentatywne dane przedstawione w niniejszym badaniu uzyskano z myszy typu dzikiego (C57BL/6J) (wiek = 2 miesiące; cztery samce i cztery samice na powtórzenie), pochodzących z komercyjnego źródła (patrz Tabela materiałów).

1. Przygotowanie eksperymentalne

UWAGA: Wykonanie tego protokołu przez jednego badacza zajmuje ok. 11 h. Zdecydowanie zaleca się, aby w dniu poprzedzającym realizację protokołu, jeśli jest to możliwe, przygotować stanowisko pracy (Rycina 1), sporządzić bufory (Tabela 1), schłodzić wirówki i wirniki do 4 °C oraz zebrać i oznakować niezbędne materiały i sprzęt (patrz Tabela materiałów).

Układ eksperymentu biologii molekularnej; obejmuje kąpiel lodową, probówki do mikrocentryfugi, pęsetę i nożyczki.
Rycina 1: Organizacja stanowiska pracy. Przed przeprowadzeniem sekcji mózgu (A) szklane homogenizatory Dounce'a oraz (B) wszystkie bufory zostały schłodzone w lodzie. (C) Roztwory stokowe inhibitorów proteaz rozmrożono w lodzie. Przygotowano drugi pojemnik z kruszonym lodem na probówki do wirówki, naczynie Dewar z ciekłym azotem (nie pokazano) oraz (D) pojemnik z suchym lodem do krótkotrwałego przechowywania próbek gwałtownie zamrożonych w ciekłym azocie. (E) Probówki do mikrocentryfugi zostały wcześniej oznakowane dla wszystkich próbek, ponieważ podczas tej procedury pobrano cztery aliquoty każdej próbki frakcji subkomórkowej na genotyp lub warunek (wskazówka pozwalająca zaoszczędzić czas: należy dokładnie oznakować wszystkie probówki dzień przed wykonaniem eksperymentu). (F) Odpowiedni pojemnik na odpady biologiczne, (G) 70% etanol, (H) narzędzia chirurgiczne oraz (I) chłonny podkład na powierzchnię roboczą. Wymagane probówki do wirówki i materiały jednorazowe odstawiono w miejsce umożliwiające szybki dostęp podczas realizacji protokołu (nie pokazano). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Przygotować stanowisko do operacji i zgromadzić nożyczki oraz pincety niezbędne do wycięcia mózgu (patrz Tabela materiałów). Wcześniej oznakować probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL do biopsji ogonów myszy oraz po cztery probówki na każdą pobraną frakcję, zgodnie z opisem na Rysunku 2.
  2. Przygotować dwa pojemniki z mokrym lodem, jeden pojemnik z suchym lodem oraz laboratoryjny naczyniowy termos z ciekłym azotem.
  3. Rozmrozić na lodzie roztwory stokowe fenylometylosulfonylofluorku (PMSF), pepstatyny A, aprotininy i leupeptyny (patrz Tabela materiałów). Przygotować niezbędne bufory (Tabela 1).
    UWAGA: Roztwory sacharozy można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C. Jednakże inhibitory proteaz (rozmrożone stoki i tabletki) muszą być dodawane na świeżo do wszystkich buforów na początku eksperymentu ze względu na niestabilność tych odczynników w roztworach wodnych. Ponadto wszystkie bufory muszą być przygotowane w szklanych naczyniach i z użyciem wody wolnej od detergentów, aby umożliwić pozyskanie nienaruszonych synaptosomów.
  4. Schłodzić wszystkie bufory oraz szklane homogenizatory Dounce'a (patrz Tabela materiałów) na lodzie. Ustawić wirówki na 4 °C i schłodzić rotory do 4 °C.
  5. Dodać 14 mL Buforu A (Tabela 1) do homogenizatora Dounce'a znajdującego się na lodzie.

Tabela 1: Skład buforów do frakcjonowania subkomórkowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Schemat przygotowania synaptosomów; od wycięcia mózgu do izolacji pęcherzyków synaptycznych i błony plazmatycznej.
Rysunek 2: Przegląd protokołu frakcjonowania subkomórkowego. Schemat podsumowujący etapy frakcjonowania subkomórkowego oraz zebrane próbki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Wycięcie mózgu myszy

Schemat anatomii czaszki przedstawiający szwy, kości nosowe i potyliczne, widok boczny i grzbietowy.
Rycina 3: Anatomia kraniofacjalna. (A) Widok grzbietowy czaszki myszy z zaznaczonymi istotnymi strukturami czaszkowymi. (B) Lewy widok boczny czaszki i mózgu myszy z zaznaczonymi istotnymi strukturami czaszkowymi oraz kierunkami anatomicznymi. Linie przerywane reprezentują miejsca, w których należy wykonać nacięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Głęboko znieczuli każdą mysz 100% isofluranem w komorze anestezjologicznej umieszczonej w dygestorium lub komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując metodę otwartą (kapanie)34. Uśmierć każdą mysz poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych, a następnie niezwłocznie przeprowadź dekapitację. Podczas uboju i sekcji naprzemiennie wybieraj osobniki o różnych genotypach lub z różnych grup eksperymentalnych12. Po eutanazji pobierz biopsję ogona, wycinając 2 mm dystalnej końcówki ogona za pomocą drobnych nożyczek. Przechowuj tkankę do genotypowania.
  2. Spryskaj odciętą głowę 70% etanolem, aby zapobiec przywieraniu sierści do tkanek i narzędzi chirurgicznych podczas sekcji.
  3. Wsuń drobne nożyczki pod skórę w miejscu nacięcia dekapitacyjnego do głębokości okołoczepowej i wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej sagietanie aż do szwu międzynozowego (Rysunek 3A), aby odsunąć skórę głowy od czaszki.
  4. Pracując od okolicy potylicznej w stronę każdej z części skroniowych, przytnij powięź i mięśnie, aby odsłonić zewnętrzną powierzchnię czaszki poza każdym otworem słuchowym zewnętrznym (Rysunek 3B).
  5. Unieruchom skórę głowy i przednią część czaszki niedominującą ręką. Drugą ręką wsuń drobne nożyczki na 2 mm do strony ogonowej otworu wielkiego, w miejscu, gdzie widoczne jest wyjście rdzenia kręgowego. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aż nożyczki dotrą do wewnętrznej powierzchni kości ciemieniowej (Rysunek 3; linie przerywane).
    UWAGA: Podczas początkowego nacięcia nożyczki muszą być równoległe do rdzenia kręgowego, a nacisk należy kierować w stronę wewnętrznej powierzchni czaszki, aby zapobiec uszkodzeniu pnia mózgu i móżdżku.
  6. Zmień kąt nachylenia nożyczek tak, aby ostrza biegły równolegle do powierzchni grzbietowej czaszki. Kontynuuj prowadzenie nacięcia pośrodkowego sagietanie w kierunku rostralnym przez kości ciemieniowe i czołowe, posługując się szwami sagietlanymi i międzyczołowymi jako prowadnicą. Stosuj stały nacisk ku górze, aby uniknąć uszkodzenia kory. Zakończ nacięcie tuż za szwem międzynozowym (Rysunek 3A).
  7. Wykonaj małe nacięcie prostopadłe (~3 mm) do kości nosowej, rostralnie od szwu międzynozowego, ustawiając nożyczki prostopadle do czaszki z każdym ostrzem umieszczonym przy szwie nosowo-przedszczękowym i wykonując jedno równe cięcie (Rysunek 3; linie przerywane).
    UWAGA: Krok ten ułatwi odsunięcie czaszki i będzie krytyczny dla pobrania opuszki węchowej, jeśli obszar ten jest przedmiotem zainteresowania.
  8. Unieruchamiając przednią część czaszki, użyj jednej strony pęsety z rowkowaniem, aby delikatnie unieść czaszkę od mózgu, a następnie przesunąć ją bocznie i brzusznie. Powtórz czynność wzdłuż linii środkowej w razie potrzeby, a następnie dla drugiej półkuli, aż cała powierzchnia mózgu zostanie odsłoniła.
  9. Za pomocą pęsety zakrzywionej lub drobnej szpatułki delikatnie unieś przednią stronę mózgu. Przetnij nerwy wzrokowe i czaszkowe, aby zakończyć usuwanie mózgu z czaszki.
  10. Dla każdej grupy warunkowej zbierz od pięciu do ośmiu mózgów myszy do schłodzonego szklanego homogenizatora Dounce zawierającego 14 mL Buforu A (Tabela 1).

3. Przygotowanie synaptosomów

UWAGA: Schematy tej procedury przedstawiono na Rysunku 4.

Schemat przygotowania synaptosomów; etapy wirowania, etykiety probówek S1, S2, P2, P2, szczegółowy proces.
Rycina 4: Przygotowanie synaptosomów. Schemat kroku 3, generowania synaptosomów (P2'). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Homogenizować mózgi za pomocą szklanego homogenizatora Dounce, wykonując 12 cykli góra-dół przy 500 rpm (łącznie). Podczas każdego ruchu w dół należy zrobić krótką pauzę, aby zapewnić dokładną homogenizację tkanki. Homogenizację przeprowadzać najlepiej w łaźni lodowej, aby uniknąć nagrzania i denaturacji białek. Pobrać aliquoty 5 µL do oznaczenia stężenia białka metodą kwasu bicinchoninowego (BCA, patrz Tabela materiałów). Pobrać aliquoty 100 µL lizatu całego mózgu do analizy western blot (WB). W tym oraz we wszystkich kolejnych próbkach (Rysunek 2) pobrać dwa aliquoty do BCA i dwa aliquoty do WB. Wszystkie zebrane aliquoty zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze −80 °C.
  2. Wirować całkowity homogenizat mózgu w probówce wirówkowej o okrągłym dnie (14 mL) (patrz Tabela materiałów) przy 800 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać nadsącz (S1). Przenieść S1 do nowej probówki wirówkowej, pozostawiając osad (P1), który zawiera nieuszkodzone komórki i jądra. Unikać pipetowania puszystego, białego, luźnego osadu powierzchniowego. Pobrać 2 x 5 µL S1 do BCA oraz 2 x 100 µL S1 do WB.
  3. Wirować S1 przy 9 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać nadsącz synaptosomalny (S2) i surowy osad synaptosomów (P2). Pobrać 2 x 10 µL S2 do BCA oraz 2 x 500 µL S2 do WB. Po pobraniu aliquotów odrzucić nadsącz i przejść do następnego kroku z osadem.
  4. Resuspender P2 w 3 mL lodowatego Buforu A z inhibitorami proteaz i wirować przy 9 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać nadsącz (S2') i przemyte synaptosomy (P2'). Odrzucić nadsącz i zachować osad.
  5. Resuspender P2' w 3 mL Buforu A. Unikać resuspensji ciemnoczerwonej części na dnie osadu, która zawiera głównie mitochondria. Pobrać 2 x 20 µL P2' do BCA oraz 2 x 100 µL P2' do WB.
    UWAGA: Można to osiągnąć poprzez delikatne mieszanie pipetą krawędzi i powierzchni osadu w celu resuspensji białych przemytych synaptosomów, kierując końcówkę pipety z dala od czerwonego centrum osadu.

4. Liza hipotoniczna

UWAGA: Schematy tej procedury przedstawiono na Rysunku 5.

Schemat lizy hipotonicznej: P2’ + bufor B, ustawienie wirówki, 500 obr./min, separacja LS1 i LP1.
Rycina 5Liza hipotoniczna. Schemat kroku 4, lizy hipotonicznej synaptosomów w celu otrzymania nadsączu z lizy (LS1) i frakcji błon synaptosomalnych (LP1). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

  1. Aby przeprowadzić lizę hipotoniczną przemytych synaptosomów, do resuspenderowanej frakcji P2' (~27 mL) dodać 9 objętości schłodzonego Buforu B (Tabela 1). Homogenizować synaptosomy w szklanym homogenizatorze Dounce'a (trzykrotne ruchy góra-dół przy 500 obr./min).
  2. Przenieść próbki do zakręcanych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mL. Inkubować je na rotatorze do probówek w chłodni w temperaturze 4 °C przez 15 min.
  3. Wirować lizowaną frakcję P2' z prędkością 25 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C, aby otrzymać supernatant lizy (LS1) oraz osad z lizy zawierający błony synaptosomalne (LP1). Odobrać 2 x 50 µL LS1 do analizy BCA oraz 2 x 400 µL LS1 do analizy WB. Przenieść LS1 do zakręcanej probówki wirówkowej przeznaczonej do ultrawirowania (patrz Tabela materiałów).

5. Izolacja pęcherzyków synaptycznych

UWAGA: Schematy tej procedury przedstawiono na Rysunku 6.

Schemat izolacji pęcherzyków synaptycznych i błony plazmatycznej; wirowanie; metoda gradientu sacharozy.
Rysunek 6: Izolacja pęcherzyków synaptycznych i izolacja błony plazmatycznej synapsy. (A) Schemat kroku 5, izolacji frakcji cytozolu synaptycznego (LS2) i pęcherzyków synaptycznych (LP2), oraz (B) kroku 6, uzyskania frakcji mieliny (MF), błony plazmatycznej synapsy (SPM) i mitochondriów (Mito.) po ultrawirowaniu gradientów sacharozy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Odwirować LS1 w rotorze ultrawirówki o stałym kącie (patrz Tabela materiałów) przy 100,000 x g przez 60 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać supernatant cytozolu synaptycznego (LS2) oraz osad pęcherzyków synaptycznych (LP2). LP2 będzie mały, przezroczysty i silnie przylegający do ścianki probówki wirówkowej.
  2. Resuspender LP2 w 500 µL Buforu A. Używając igły 23 G i strzykawki 1 mL, poddać LP2 ścinaniu poprzez delikatną tryturację. Odprowadzić 2 x 10 µL LP2 do analizy BCA oraz 2 x 250 µL LP2 do analizy WB.
  3. Przenieść LS2 (~30 mL) do jednostek filtracyjnych do wirowania z progiem odcięcia 10 kDa (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Jeśli przedmiotem zainteresowania są białka mniejsze niż 10 kDa, dostępne są jednostki filtracyjne z progiem odcięcia 4 kDa, co jednak wydłuży czas wirowania.
  4. Skoncentrować LS2 do objętości około 0,5 mL poprzez wirowanie przy 5000 x g do 1 h w temperaturze 4 °C. Odprowadzić 2 x 10 µL skoncentrowanego LS2 do analizy BCA oraz 2 x 250 µL skoncentrowanego LS2 do analizy WB. Po rozpoczęciu wirowania przejść bezpośrednio do kroku 6.1.

6. Izolacja błony plazmatycznej synaps

  1. Resuspend LP1 (krok 4.3) w 1 mL Buforu B (Tabela 1). Odmień 2 x 10 µL LP1 do analizy BCA oraz 2 x 50 µL LP1 do WB. Doprowadź pozostałą część LP1 do objętości końcowej 7,5 mL i końcowego stężenia sacharozy 1,1 M za pomocą Buforu B i Buforu C (Tabela 1).
  2. Przenieś 7,5 mL resuspendowanego LP1 do probówki do ultrawirowania o pojemności 14 mL (patrz Tabela materiałów). Ostrożnie nałóż na LP1 3,75 mL Buforu D (Tabela 1), a następnie nałóż 1,25 mL Buforu A (lub większą objętość, aby wypełnić probówkę tuż poniżej krawędzi). Unikaj pipetowania po ściankach probówki, co mogłoby zaburzyć granice gradientu sacharozy. Po nałożeniu każdej frakcji sacharozy zaznacz górną granicę roztworu pisakiem. Zrównoważ probówki do ultrawirowania wagowo, a nie objętościowo, dodając Bufor A kroplami, aż do uzyskania dokładności 10 mg. Wirować przy 48 000 x g przez 2,5 h w temperaturze 4 °C w rotorze z koszyczkami kątowo-ruchomymi (patrz Tabela materiałów).
  3. Wykonaj zdjęcia nienaruszonych gradientów po ultrawirowaniu, aby udokumentować wyraźność poszczególnych granic sacharozy oraz powodzenie frakcjonowania.
  4. Ostrożnie usuń wierzchnią warstwę sacharozy 320 mM (Bufor A). Pobierz frakcję mieliny (MF) z granicy sacharozy 320 mM/855 mM w objętości 800 µL. Pobierz frakcję błony plazmatycznej synaptycznej (SPM) z granicy sacharozy 855 mM/1,1 M w objętości 1 000 µL. Każdą frakcję pobieraj pipetą od ścianki probówki ruchem okrężnym, aby zapewnić całkowite zebranie frakcji. Ostrożnie odessaj pozostałą sacharozę i odzyskaj osad mitochondrialny (Mito.), resuspendując go w 200 µL Buforu B. Odmień 2 x 100 µL MF do BCA oraz 2 x 10 µL Mito. do BCA; pozostałą część próbek MF i Mito. podziel na pół do WB.
  5. Rozcieńcz frakcję SPM dwiema objętościami Buforu B (~2 mL), a następnie wiruj w rotorze stałokątnym w probówce wirówkowej 3,5 mL (patrz Tabela materiałów) przy 25 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Odlej nadsącz i resuspenduj osad SPM w Buforze A do objętości końcowej 250 µL. Odmień 2 x 5 µL SPM do BCA i podziel pozostały SPM na pół do WB.
  6. Wykonaj test BCA, aby określić stężenie białka w każdej próbce, uwzględniając zmienną objętość alikwotów.
    UWAGA: Do analizy WB sugerowane robocze stężenie białka dla wszystkich frakcji subkomórkowych wynosi 2 µg/µL (lub najwyższe możliwe do uzyskania dla LS1 i MF).

Wyniki

Przedstawiona metoda pozwala na uzyskanie 11 frakcji subkomórkowych mózgu, które mogą zostać poddane dalszemu oczyszczaniu i różnym formom analizy końcowej35,36. Złotym standardem w ocenie jakości synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych (SVs)23 oraz innych komponentów jest mikroskopia elektronowa (EM) (Rysunek 7). W celu oceny markerów czystości frakcji można również przeprowadzić ilościowy immunoblotting białek obecnych w konkretnych frakcjach subkomórkowych (Rysunek 8). Przykładowo, analiza immunoblottingowa frakcji wykazuje wzbogacenie N-kadheryny (CDH2, nazwa UniProt) we frakcji błony plazmatycznej synaps (SPM), α-synukleiny (SYUA) w cytosolu synaptycznym (LS2), synaptofizyny (SYPH) we frakcji pęcherzyków synaptycznych (LP2) oraz podstawowego białka mieliny (MBP) we frakcji mieliny (MF) w porównaniu z poziomami białek w początkowym homogenacie całego mózgu (Total) (Rysunek 8). Po ustaleniu czystości frakcji (na przykład zauważając brak CDH2 we frakcji LS2 lub wielokrotny wzrost poziomu SYPH we frakcji LP2), ilościowy immunoblotting może zostać wykorzystany do określenia lokalizacji białek zainteresowania lub zbadania różnic w rozkładzie białek pomiędzy genotypami lub wariantami traktowania. Zrozumienie lokalizacji subkomórkowej białek synaptycznych może umożliwić opisanie wcześniej nieznanych funkcji białek. Ponadto metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu defektów transportu lub dysfunkcji synaptycznych w stanach chorobowych, zwłaszcza w połączeniu z testami funkcjonalnymi. Przykładowo, nasz zespół wykorzystał tę metodę do zidentyfikowania puli enzymatycznie aktywnej palmitoilowej białkowej tioesterazy 1, która jest wzbogacona w cytosolu synaptycznym19.

Struktura komórkowa na obrazach z mikroskopu elektronowego; wizualizacja organelli; analiza biologiczna.
Rysunek 7: Mikroskopia elektronowa (EM) synaptosomów. (A) Reprezentatywny obraz EM synaptosomu zawierającego pęcherzyki synaptyczne (strzałka). (B) Reprezentatywny obraz EM synaptosomu z elementami przedsynaptycznymi (strzałka) i postsynaptycznymi (podwójna strzałka). (C) Reprezentatywny obraz EM synaptosomu zawierającego pęcherzyki synaptyczne i mitochondrium (strzałka) (paski skali = 100 nm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Western blot i wykres słupkowy analizujący wzbogacenie markerów białkowych w frakcjach komórkowych.
Rycina 8: Analiza immunoblotting frakcji subkomórkowych. (A) Markery czystości frakcji subkomórkowych (oznaczone zgodnie z nomenklaturą UniProt) są odpowiednio zlokalizowane w porównaniu z homogenatem całego mózgu (total): N-kadheryna (CDH2) we frakcji błony plazmatycznej synaps (SPM), synaptofizyna 1 (SYPH) i synaptojanina 1 (SYNJ1) we frakcji wzbogaconej w pęcherzyki synaptyczne (LP2), α-synukleina (SYUA) w cytosolu synaptycznym (LS2) oraz białko zasadowe mieliny (MBP) we frakcji mieliny (MF). (B) Ilościowa analiza immunoblottingu wykazuje wzbogacenie (zmiana krotności względem total) markerów czystości frakcji. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe w skali log10. Linia przerywana wskazuje 1,5-krotną zmianę (y = 0,176) (n = 3 powtórzone eksperymenty z 8 myszami typu dzikiego; wiek = 2 miesiące; n = 4-5 blotów dla SYPH, SYUA, MBP, z n = 3 wartościami naniesionymi na wykres, opublikowanymi wcześniej przez Gorenberga i wsp.19; n = 5 dla SYNJ1; n = 1 dla CDH2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

W swoich przełomowych badaniach Whittaker i współpracownicy wykorzystali cztery kryteria morfologiczne do identyfikacji synaptosomów: (1) struktury mają uszczelnioną błonę plazmatyczną; (2) struktury zawierają SV przypominające te w zakończeniach nerwowych i żylaki in situ pod względem wielkości i liczby; (3) struktury posiadają jedno lub więcej małych mitochondriów; oraz (4) błona presynaptyczna jest często przylegająca do komponentu postsynaptycznego 11,12,13. Chociaż pierwsze dwa kryteria generalnie mają zastosowanie do każdej metody izolacji, w najnowszych protokołach opisanych w tym artykule nie wszystkie powstałe synaptosomy będą miały mitochondria i przyłączone zakończenia postsynaptyczne. Około 60% synaptosomów będzie miało mitochondria, a szacuje się, że tylko do 15% ma przyłączone zakończenia postsynaptyczne37. Jeśli składniki postsynaptyczne są szczególnie interesujące, wiadomo, że zastosowanie izotonicznego buforu homogenizacyjnego podobnego do Krebsa i filtracji ciśnieniowej w celu wzbogacenia daje wysokie stężenia synaptosomów z zakończeniami postsynaptycznymi (zwanymi również synaptoneurosomami)22,38.

Metoda składania w ofierze zwierzęcia może wpływać na jakość synaptosomów i podfrakcji synaptycznych. Dorosłe zwierzęta uśmiercone metodą eutanazji, która nie wymaga znieczulenia, uzyskają najlepszą jakość frakcji. Co więcej, mózgi powinny być świeżo wypreparowane, nie zamrożone i homogenizowane przy użyciu stosunku bufora homogenizacyjnego 1:10 (waga/objętość) dla najbardziej żywotnych frakcji synaptycznych22. Mózg ma niejednorodną populację synaps, które można różnicować ze względu na rodzaj przenoszonych przez nie neuroprzekaźników. Na tworzenie synaptosomów na ogół nie ma wpływu typ synapsy ani zawartość neuroprzekaźników13. Wyjątkiem są omszałe włókna w móżdżku, o których wiadomo, że są zaburzone w optymalnych warunkach do pozyskiwania synaptosomów z reszty mózgu39,40. Dlatego zaleca się usunięcie móżdżku przed homogenizacją mózgu, jeśli wykluczenie tego regionu nie wpływa na cel eksperymentalny. Jeśli jesteś zainteresowany izolacją synaptosomów o określonym charakterze neuroprzekaźnika, obszary mózgu, które są wzbogacone o neurony zawierające interesujący nas neuroprzekaźnik, mogą być najpierw wyizolowane. Podejście to będzie jednak nakładać ograniczenia na końcowy plon frakcji, w zależności od wielkości regionu zainteresowania (w związku z tym wiek zwierząt jest również brany pod uwagę). Istnieją immunochemiczne metody izolacji synaptosomów specyficznych dla neuroprzekaźników, ale żywotność i wydajność będą znacznie zagrożone22. Jeśli ocena żywotności metabolicznej synaptosomów jest ważna, można zastosować pomiar uwalniania neuroprzekaźników41,42 lub niektóre testy enzymatyczne43.

Typowe zanieczyszczenia w preparatach synaptosomów obejmują mikrosomy, wolne mitochondria, SV oraz błony neuronalne i glejowe. Zanieczyszczenie można zmniejszyć, zwiększając liczbę płukań przy frakcjach P1 i P222 i unikając ponownego zawieszania czerwonego osadu mitochondrialnego w kolejnych etapach. W eksperymentach, w których żywotność metaboliczna i czas mają kluczowe znaczenie, pomocne będzie zmniejszenie liczby prań i zastosowanie gradientów Ficoll lub Percoll zamiast gradientów sacharozy 44,45,46. Metody te również znacznie zmniejszają zanieczyszczenie. Oryginalny protokół Whittakera zaowocował wysokiej jakości SV. Dalsza optymalizacja dokonana przez Nagya i wsp.23, zawarta w tej metodzie, pozwala uzyskać SV o niezwykłej jednorodności i czystości bez znacznego uszczerbku dla plonu36. Jeśli interesujące są określone podtypy SV, takie jak SV glutaminergiczne (zawierające VGLUT-1) lub GABA-ergiczne (zawierające VGAT-1), można przeprowadzić immunoizolację przy użyciu swoistych przeciwciał47,48. Dostępne są również alternatywne metody izolowania CCV od synaptosomów, które ze względu na różną gęstość mogą nie występować na tym samym interfejsie, co SV otrzymane tą metodą 20,49,50.

Ogólnie rzecz biorąc, obecny protokół izolacji składników synaptycznych można dodatkowo zoptymalizować w celu uzyskania frakcji o zwiększonej jednorodności i żywotności w oparciu o jakość i ilość źródłowej tkanki mózgowej oraz cele eksperymentalne. Aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów, należy zapoznać się z rozdziałami książek Dunkleya i Robinsona22 oraz Ganzella i wsp.36.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować P. Colosi za przygotowanie obrazu EM. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), Departament Obrony Stanów Zjednoczonych (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), Aligning Science across Parkinson's (ASAP) Collaborative Research Network (SSC) oraz Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC & VDJ). Ilustracje graficzne tworzyliśmy z wykorzystaniem BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml TB StrzykawkaBD309649
1,5 ml Eppendorf TubesUSA Scientific1415-2500
14 mL, otwarta cienkościenna ultraprzezroczysta rurkaBeckman Coulter344060Kompatybilna z
igłą podskórną SW 40 Ti 23 Gauge Precision GlideBD305145
26,3 mL, butelka z poliwęglanu z zespołem nakrętkiBeckman Coulter355618Kompatybilna z
grubościenną rurką polipropylenową Ti70 3,5 mL z otwartymBeckman Coulter349623Kompatybilna z TLA-100.3
50 ml Falcon TubesFisher Scientific14-432-22
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 Millipore Sigma UFC901024
AprotininSigma-AldrichA62791 mg / ml w diH2O
Wirówka Avanti J-26 XPBeckman CoulterB22984< 26 000 obr./min
Stołowa kolba Dewara HDPEThermo Scientific5028U19
C57BL/6J MyszyWirówka Jackson Labs000664
5810REppendorfEP022628168< 14 000 obr./min
kompletne, mini, wolne od EDTA tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazyRoche11873580001Dodaj 1 tabletkę na 50 ml roztworu
Zakrzywione kleszczeNarzędzia do naukiprecyzyjnej 11273-20
Cienkie nożyczki chirurgiczneFine Science Tools8r
System homogenizacji tkanek Glas-ColCole-ParmerUX-04369-15
Kleszcze GraefeFine Science Tools11650-10
Szybkoobrotowe probówki wirówkowe z okrągłym dnem z poliwęglanuThermoFisher3117-0500Kompatybilny z izofluoranem JA20
Henry Schein Zdrowie zwierzątNDC 11695-6776-2
JA-20 RotorBeckman Coulter334831
LeupeptinAmerican BioAB011081 mg / ml w diH2O
Kwas N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[2-etanosulfonowy] (HEPES)American BioAB00892
Optima L-80 XP UltrawirówkaBeckman Coulter< 100 000 obr./min
Ultrawirówka Optima TLXBeckman Coulter< 120 000 obr./min
Pepstatyna AThermo Scientific784361 mg / ml w
DMSO Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)American BioAB01620
Pierce Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Scientific23335Do oznaczania stężenia białka
Końcówki
Pipety
SacharozaSigma-AldrichS0389
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14002-12
SW 40 Ti Rotor z łyżką wahadłowąBeckman Coulter331301
teflonowy tłuczek i moździerz Młynek do tkanekThomas Scientific3431D94
Ti70 RotorBeckman Coulter337922
TLA-100.3 RotorBeckman Coulter349490
Rewolwer rurowyDot ScientificDTR-02VS
wierzchem do pipet serologiczne

Bibliografia

  1. Synaptic Transmission. Principles of Neural Science, Fifth Edition. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J., Education, A. J. , McGraw-Hill Education. New York, NY. (2014).
  2. Lepeta, K., et al. Synaptopathies: synaptic dysfunction in neurological disorders - A review from students to students. Journal of Neurochemistry. 138 (6), 785-805 (2016).
  3. Südhof, T. C., Malenka, R. C. Understanding synapses: Past, present, and future. Neuron. 60 (3), 469-476 (2008).
  4. Südhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12696-12717 (2014).
  5. Jahn, R., Boyken, J. Molecular Regulation of Synaptic Release. Neuroscience in the 21st Century: From Basic to Clinical. Pfaff, D. W. , Springer. New York. New York, NY. 351-401 (2013).
  6. Xiong, H., Gendelman, H. E. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York. New York, NY. (2014).
  7. Azevedo, F. A., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  8. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 10661-10668 (2012).
  9. Herculano-Houzel, S., Lent, R. Isotropic fractionator: A simple, rapid method for the quantification of total cell and neuron numbers in the brain. Journal of Neuroscience. 25 (10), 2518-2521 (2005).
  10. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  11. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. Journal of Anatomy. 96, 79-88 (1962).
  12. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of synaptic vesicles from the central nervous system. Journal of Physiology. 153, 35-37 (1960).
  13. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. Journal of Neurocytology. 22 (9), 735-742 (1993).
  14. Jahn, R., Fasshauer, D. Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles. Nature. 490, 201-207 (2012).
  15. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes). Biochemical Journal. 90 (2), 293-303 (1964).
  16. De Robertis, E., Rodriguez De Lores Arnaiz, G., Pellegrino De Iraldi, A. Isolation of synaptic vesicles from nerve endings of the rat brain. Nature. 194, 794-795 (1962).
  17. De Robertis, E., Pellegrino De Iraldi, A., Rodriguez, G., Gomez, C. J. On the isolation of nerve endings and synaptic vesicles. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (1), 229-235 (1961).
  18. Zimmermann, H., Whittaker, V. P. The Discovery of the Synaptosome and Its Implications. Synaptosomes. Murphy, K. M. , Springer. New York. New York, NY. 9-26 (2018).
  19. Gorenberg, E. L., et al. Identification of substrates of palmitoyl protein thioesterase 1 highlights roles of depalmitoylation in disulfide bond formation and synaptic function. PLoS Biology. 20 (3), 3001590(2022).
  20. Vidyadhara, D. J., et al. Dopamine transporter and synaptic vesicle sorting defects initiate auxilin-linked Parkinson's disease. bioRxiv. , (2022).
  21. Schrimpf, S. P., et al. Proteomic analysis of synaptosomes using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Proteomics. 5 (10), 2531-2541 (2005).
  22. Dunkley, P. R., Robinson, P. J. Synaptosome Preparations: Which Procedure Should I Use. Synaptosomes. Murphy, K. M. , Springer. New York. New York, NY. 27-53 (2018).
  23. Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Research. 109 (2), 285-309 (1976).
  24. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  25. Wagner, J. A., Kelly, R. B. Topological organization of proteins in an intracellular secretory organelle: the synaptic vesicle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (8), 4126-4130 (1979).
  26. Jahn, R., Schiebler, W., Ouimet, C., Greengard, P. A 38,000-dalton membrane protein (p38) present in synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (12), 4137-4141 (1985).
  27. Binotti, B., Jahn, R., Pérez-Lara, Á An overview of the synaptic vesicle lipid composition. Archives of Biochemistry and Biophysics. 709, 108966(2021).
  28. Siegel, D. P., Ware, B. R. Electrokinetic properties of synaptic vesicles and synaptosomal membranes. Biophysical Journal. 30 (1), 159-172 (1980).
  29. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from disrupted nervending particles. Biochemical Pharmacology. 12 (3), 300-302 (1963).
  30. Clementi, F., Whittaker, V. P., Sheridan, M. N. The yield of synaptosomes from the cerebral cortex of guinea pigs estimated by a polystyrene bead "tagging" procedure. Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 72, 126-138 (1966).
  31. Carlson, S. S., Wagner, J. A., Kelly, R. B. Purification of synaptic vesicles from elasmobranch electric organ and the use of biophysical criteria to demonstrate purity. Biochemistry. 17 (7), 1188-1199 (1978).
  32. Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. Journal of Cell Biology. 96 (5), 1374-1388 (1983).
  33. Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals. 45 (1), 1-13 (2011).
  34. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Canadian Veterinary Journal. 53 (3), 299-302 (2012).
  35. Deutsch, C., Drown, C., Rafalowska, U., Silver, I. A. Synaptosomes from rat brain: Morphology, compartmentation, and transmembrane pH and electrical gradients. Journal of Neurochemistry. 36 (6), 2063-2072 (1981).
  36. Ganzella, M., Ninov, M., Riedel, D., Jahn, R. Isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Methods in Molecular Biology. 2417, 131-145 (2022).
  37. Dunkley, P. R., et al. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Research. 441 (1-2), 59-71 (1988).
  38. Schwartz, R. D., Skolnick, P., Hollingsworth, E. B., Paul, S. M. Barbiturate and picrotoxin-sensitive chloride efflux in rat cerebral cortical synaptoneurosomes. FEBS Letters. 175 (1), 193-196 (1984).
  39. Pittaluga, A., Thellung, S., Maura, G., Raiteri, M. Characterization of two central AMPA-preferring receptors having distinct location, function and pharmacology. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 349 (6), 555-558 (1994).
  40. Israël, M., Whittaker, V. P. The isolation of mossy fibre endings from the granular layer of the cerebellar cortex. Experientia. 21 (6), 325-326 (1965).
  41. Khvotchev, M., Lonart, G., Südhof, T. C. Role of calcium in neurotransmitter release evoked by alpha-latrotoxin or hypertonic sucrose. Neuroscience. 101 (3), 793-802 (2000).
  42. Lonart, G., Janz, R., Johnson, K. M., Südhof, T. C. Mechanism of action of rab3A in mossy fiber LTP. Neuron. 21 (5), 1141-1150 (1998).
  43. Nicholls, D. G., Sihra, T. S. Synaptosomes possess an exocytotic pool of glutamate. Nature. 321 (6072), 772-773 (1986).
  44. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nature Protocols. 3 (11), 1718-1728 (2008).
  45. Cotman, C. W., Matthews, D. A. Synaptic plasma membranes from rat brain synaptosomes: Isolation and partial characterization. Biochimica et Biophysica Acta. 249 (2), 380-394 (1971).
  46. Booth, R. F., Clark, J. B. A rapid method for the preparation of relatively pure metabolically competent synaptosomes from rat brain. Biochemical Journal. 176 (2), 365-370 (1978).
  47. Takamori, S., Riedel, D., Jahn, R. Immunoisolation of GABA-specific synaptic vesicles defines a functionally distinct subset of synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 20 (3), 4904-4911 (2000).
  48. Burger, P. M., et al. Synaptic vesicles immunoisolated from rat cerebral cortex contain high levels of glutamate. Neuron. 3 (6), 715-720 (1989).
  49. Blondeau, F., et al. Tandem MS analysis of brain clathrin-coated vesicles reveals their critical involvement in synaptic vesicle recycling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3833-3838 (2004).
  50. Maycox, P. R., Link, E., Reetz, A., Morris, S. A., Jahn, R. Clathrin-coated vesicles in nervous tissue are involved primarily in synaptic vesicle recycling. Journal of Cell Biology. 118 (6), 1379-1388 (1992).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja synaptosom wzako czenia synaptycznep cherzyki synaptyczneb ona plazmatyczna synapsymikroskopia elektronowaWestern blotgradient sacharozy
Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.