Method Article

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

DOI:

10.3791/64574

⸱

September 14th, 2022

 ,  , 
1Department of Neurology, Yale University, 2Department of Neuroscience, Yale University, 3Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakończenia synaptyczne są głównymi miejscami komunikacji neuronalnej. Dysfunkcja synaps jest cechą charakterystyczną wielu zaburzeń neuropsychiatrycznych i neurologicznych. Charakterystyka podprzedziałów synaptycznych za pomocą izolacji biochemicznej jest zatem potężną metodą wyjaśniania molekularnych podstaw procesów synaptycznych, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Protokół ten opisuje izolację zakończeń synaptycznych i podprzedziałów synaptycznych z mózgów myszy poprzez frakcjonowanie subkomórkowe. Po pierwsze, uszczelnione struktury końcówek synaptycznych, znane jako synaptosomy, są izolowane po homogenizacji tkanki mózgowej. Synaptosomy to neuronalne przedziały pre- i postsynaptyczne z ściśniętymi i uszczelnionymi błonami. Struktury te zachowują metabolicznie aktywny stan i są cenne dla badania struktury i funkcji synapty. Synaptosomy są następnie poddawane hipotonicznej lizie i ultrawirowaniu w celu uzyskania podkompartmentów synaptycznych wzbogaconych o pęcherzyki synaptyczne, cytozol synaptyczny i błonę plazmatyczną synaptyczną. Czystość frakcji potwierdza mikroskopia elektronowa i analiza wzbogacenia biochemicznego białek specyficznych dla przedziałów subsynaptycznych. Przedstawiona metoda jest prostym i cennym narzędziem do badania cech strukturalnych i funkcjonalnych synapsy oraz etiologii molekularnej różnych zaburzeń mózgu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synapsy są podstawowymi jednostkami obliczeniowymi mózgu, za pomocą których neurony komunikują się i wykonują różnorodne i niezwykle złożone funkcje. Synapsy mają zatem fundamentalne znaczenie dla zdrowia mózgu1; Dysfunkcja synaps jest uważana za źródło lub wynik wielu zaburzeń2. Synapsy składają się z zakończeń pre- i postsynaptycznych, przedłużeń dwóch różnych neuronów, które są ściśle przylegające i oddzielone szczeliną synaptyczną przeciętą przez cząsteczki adhezyjne synaptyczne. Informacja przepływa z przedziału pre- i postsynaptycznego w postaci przekaźników chemicznych zwanych neuroprzekaźnikami1. Procesy molekularne związane z neuroprzekaźnictwem są aktywnymi obszarami badań3,4,5. Zrozumienie procesów patogennych w obrębie zakończeń synaptycznych i odpowiedzi synaps na patologię w innych podprzedziałach neuronalnych jest kluczowym krokiem w leczeniu zaburzeń mózgu1,2. Kilka postępów metodologicznych, zastosowanych głównie do modeli mysich, posunęło naprzód to dążenie6. Izolacja frakcji synaptycznych za pomocą wirowania różnicowego jest jedną z takich metod zmieniających paradygmat, która umożliwiła szczegółową ocenę procesów synaptycznych w zdrowiu i chorobie.

Mózg dorosłego człowieka składa się z 80-90 miliardów neuronów7,8. Wśród gatunków mysich mózg szczura zawiera około ~200 milionów neuronów, podczas gdy myszy mają ~70 milionów9,10. Każdy neuron tworzy tysiące specyficznych połączeń synaptycznych z siecią wysoce spolaryzowanych neuronów zmieszanych z komórkami glejowymi i gęstym unaczynieniem. W tak złożonej i niejednorodnej tkance kiedyś nie do pomyślenia było izolowanie i badanie synaps jako niezależnego systemu. W latach sześćdziesiątych XX wieku Victor Whittaker, Catherine Hebb i inni umożliwili to, izolując nienaruszone zakończenia synaptyczne za pomocą subkomórkowego frakcjonowania11,12,13,14. Próbując wyizolować pęcherzyki synaptyczne (SV), homogenizowali mózgi za pomocą siły ścinającej ciecz w izoosmotycznej (0,32 M) sacharozy, a następnie ultrawirowania. Uzyskali ściśnięte, otoczone błoną plazmatyczną, nienaruszone zakończenia nerwowe lub żylaki, które nazwali cząstkami zakończeń nerwowych (NEPs)11,13. Ponieważ strukturalne i funkcjonalne cechy synapsy zostały zachowane w tych strukturach, NEP-y zostały później nazwane "synaptosomami" w celu zgodności z innymi organellami subkomórkowymi13,15. Warto zauważyć, że praca Eduardo de Robertisa i współpracowników, którzy ukuli termin "pęcherzyk synaptyczny", pokrywała się z pracami Whittakera i współpracowników i przyczyniła się do walidacji izolacji i charakterystyki "synaptosomu"16,17,18.

Synaptosomy to fizjologicznie aktywne struktury, które zawierają wszystkie właściwości komórkowe i molekularne niezbędne do przechowywania, uwalniania i wychwytu zwrotnego neuroprzekaźników13,18. Zachowanie kluczowych cech synaptycznych in vitro i brak składników niesynaptycznych również przyczynia się do użyteczności tej metody izolacji. Synaptosomy w ogromnym stopniu przyczyniły się do zrozumienia chemicznych i fizjologicznych właściwości neuroprzekaźnictwa, a obecnie są wykorzystywane do badania synaptycznych procesów molekularnych i ich zmian w chorobie19,20,21,22,23. Synaptosomy są również początkowym materiałem źródłowym do izolowania składników synaptycznych, takich jak SV, pęcherzyki pokryte klatryną (CCV), cytozol synaptyczny, błona plazmatyczna synaptyczna, mitochondria synaptyczne, cząsteczki adhezji synaptycznej i inne składniki będące przedmiotem zainteresowania, które mogą ułatwić zrozumienie molekularnych mechanizmów funkcji synaptycznej18,19,20,24,25,26,27,28. Te subsynaptyczne składniki można uzyskać przez osmotyczną lizę synaptosomów i ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy15,29. Chociaż oryginalna metoda frakcjonowania subkomórkowego opracowana przez grupę badawczą Whittakera jest znana z tego, że jest skuteczna w izolowaniu wysokiej jakości synaptosomów i SVs13,30, ostatnie optymalizacje zwiększają czystość frakcji subkomórkowych22,23,31,32. Ten artykuł zawiera bardzo szczegółową i przystępną wersję klasycznego protokołu subkomórkowego frakcjonowania mysiej tkanki mózgowej w celu wyizolowania synaptosomów, SV i innych składników subsynaptycznych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Yale (Protokół 2021-11117) i przeprowadzone w placówce akredytowanej przez Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Opieka nad zwierzętami i ich trzymanie były zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych33 i były zapewniane przez Yale Animal Resource Center (YARC). Zwierzęta utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Do poniższego protokołu wymagane jest pięć do ośmiu myszy lub od dwóch do czterech szczurów na genotyp lub stan. Potrzeba mniej szczurów ze względu na większą objętość mózgu. Podobnie, wiek zwierząt doświadczalnych może mieć wpływ na plon frakcji; Dodatkowe myszy mogą być wymagane w wieku poniżej 2 miesięcy. W przeciwnym razie przedstawione procedury dotyczą zarówno gatunków mysich, jak i zdrowych dorosłych zwierząt w każdym wieku. Reprezentatywne dane przedstawione w tym badaniu dotyczyły myszy typu dzikiego (C57BL/6J) (wiek = 2 miesiące; cztery samce i cztery samice na powtórzenie) uzyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie eksperymentalne

UWAGA: Ten protokół wymaga ~11 godzin na ukończenie przez jednego badacza. Zdecydowanie zaleca się zakończenie konfiguracji stołowej (Rysunek 1), przygotowanie buforu (Tabela 1), wstępne schłodzenie wirówek i wirników do 4 °C oraz pobranie i oznakowanie niezbędnych materiałów i sprzętu (patrz Tabela materiałów) dzień przed podpisaniem protokołu, jeśli ma to zastosowanie.

Stanowisko laboratoryjne do ekstrakcji DNA; zawiera kąpiel lodową, mikrorurki, narzędzia; przygotowanie procesu.
Rysunek 1: Konfiguracja stołowa. Przed sekcją mózgu, (A) homogenizatory ze szkła do odbić i (B) wszystkie zostały schłodzone na lodzie. (C) Roztwory podstawowe inhibitorów proteazy rozmrażano na lodzie. Uzyskano drugi pojemnik mokrego lodu do probówek wirówkowych, Dewara ciekłego azotu (nie pokazano) oraz (D) pojemnik z suchym lodem do krótkotrwałego przechowywania próbek zamrożonych w ciekłym azocie. (E) Probówki do mikrowirówek zostały wstępnie znakowane dla wszystkich próbek, ponieważ podczas tej procedury pobrano cztery porcje każdej próbki frakcji subkomórkowej na genotyp lub warunek (wskazówka oszczędzająca czas: dokładnie oznacz wszystkie probówki na dzień przed przeprowadzeniem eksperymentu). (F) Odpowiedni pojemnik na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne, (G) 70% etanolu, (H) narzędzia chirurgiczne oraz (I) chłonna podkładka powierzchniowa. Wymagane probówki wirówkowe i materiały jednorazowego użytku zostały odłożone na bok w celu zapewnienia sprawnego dostępu podczas wdrażania protokołu (nie pokazano). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotuj blat stołu do operacji i zbierz nożyczki i kleszcze potrzebne do wycięcia mózgu (patrz Tabela materiałów). Wstępnie oznacz probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml do biopsji ogona myszy i cztery probówki na pobraną frakcję, jak opisano w Rysunek 2.
  2. Zaopatrzyć się w dwa pojemniki z mokrym lodem, jeden pojemnik z suchym lodem i stołową kolbę Dewara z ciekłym azotem.
  3. Rozmrozić roztwory podstawowe fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), pepstatyny A, aprotyniny i leupeptyny na lodzie (patrz tabela materiałów). Przygotować niezbędne (tabela 1).
    UWAGA: Roztwory sacharozy można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Jednakże inhibitory proteazy (rozmrożone wywary i tabletki) muszą być dodawane świeże do wszystkich na początku doświadczenia ze względu na niestabilność tych odczynników w roztworach wodnych. Ponadto wszystkie muszą być przygotowane z naczyń szklanych bez detergentów i wody bez detergentów, aby umożliwić zebranie nienaruszonych synaptosomów.
  4. Schłodzić wszystkie i homogenizatory szklane (patrz tabela materiałów) na lodzie. Ustawić wirówki na 4 °C i schłodzić wirniki do 4 °C.
  5. Dodać 14 ml buforu A (Tabela 1) do homogenizatora Dounce na lodzie.

Tabela 1: Skład subkomórkowych frakcjonujących. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Diagram frakcjonowania mózgu myszy; synaptosom, izolacja pęcherzyków, proces błony synaptycznej.
Rysunek 2: Przegląd protokołu frakcjonowania subkomórkowego. Schemat podsumowujący etapy frakcjonowania subkomórkowego i pobrane próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wycięcie mózgu myszy

Diagram anatomiczny porównujący szwy czaszki gryzoni i cechy czaszki do badań edukacyjnych.
Rysunek 3: Anatomia twarzoczaszki. (A) Widok grzbietowy czaszki myszy z zaznaczonymi istotnymi strukturami czaszki. (B) Widok z lewej strony czaszki i mózgu myszy ze wskazaniami odpowiednich struktur czaszki i kierunków anatomicznych. Linie przerywane reprezentują miejsca, w których należy wykonać nacięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Głęboko znieczulij każdą mysz 100% izofluoranem w komorze anestezjologicznej znajdującej się w dygestorii lub komorze bezpieczeństwa biologicznego, stosując metodę otwartego kropli34. Każdą mysz należy złożyć w ofierze przez zwichnięcie kręgosłupa szyjnego, a następnie szybko ścięcie głowy. Zmieniaj genotypy lub grupy eksperymentalne dla każdej ofiary i sekcji12. Uzyskaj biopsje ogona po eutanazji, wycinając 2 mm dystalnego końca ogona cienkimi nożyczkami. Przechowuj tkankę do genotypowania.
  2. Spryskaj odciętą głowę 70% etanolem, aby zapobiec przywieraniu włosów do tkanki i narzędzi chirurgicznych podczas sekcji.
  3. Włóż cienkie nożyczki pod skórę w miejscu nacięcia dekapitacji na głębokość okołoczaszkową i wykonaj nacięcie śródstrzałkowe aż do szwu międzynosowego (Ryc. 3A), aby cofnąć skórę głowy od czaszki.
  4. Pracując od obszaru potylicznego w kierunku każdego aspektu skroniowego, przytnij powięź i mięsień, aby odsłonić zewnętrzną powierzchnię czaszki poza każdy zewnętrzny przewód akustyczny (Rysunek 3B).
  5. Zabezpiecz skórę głowy i rostralną część czaszki ręką niedominującą. Drugim włóż cienkie nożyczki 2 mm w ogonową stronę otworu wielkiego, z którego widoczny jest rdzeń kręgowy. Wykonaj nacięcie linii środkowej, aż nożyczki dotrą do wewnętrznej powierzchni kości śródciemieniowej (Rysunek 3; linie przerywane).
    UWAGA: Podczas początkowego nacięcia nożyczki muszą być równoległe do rdzenia kręgowego z naciskiem wywieranym w kierunku wewnętrznej powierzchni czaszki, aby zapobiec uszkodzeniu pnia mózgu i móżdżku.
  6. Zmień kąt nożyczek tak, aby ostrza biegły równolegle do grzbietowej powierzchni czaszki. Kontynuuj przesuwanie nacięcia środkowego strzałkowo przez kości ciemieniowe i czołowe, używając szwów strzałkowych i międzyczołowych jako przewodnika. Używaj stałego nacisku w górę, aby uniknąć uszkodzenia kory. Zakończ nacięcie tuż za szwem międzynosowym (Ryc. 3A).
  7. Wykonaj małe prostopadłe nacięcie (~3 mm) do kości nosowej, rostralnie do szwu międzynosowego, umieszczając nożyczki prostopadle do czaszki z każdym ostrzem umieszczonym na szwie nosowo-przedszczękowym i wykonując jedno równe cięcie (Rysunek 3; linie przerywane).
    UWAGA: Ten krok zwiększy łatwość chowania czaszki i będzie miał kluczowe znaczenie dla zebrania opuszki węchowej, jeśli ten obszar jest interesujący
    8. .
  8. Zabezpieczając aspekt rostralny, użyj jednej strony pary teksturowanych kleszczy, aby delikatnie podnieść czaszkę z mózgu, a następnie na boki i brzusznie. W razie potrzeby powtórz wzdłuż linii środkowej, a następnie dla drugiej półkuli, aż cała powierzchnia mózgu zostanie odsłonięta.
  9. Za pomocą zakrzywionych kleszczy lub cienkiej szpatułki delikatnie unieś rostralną stronę mózgu. Przetnij nerwy wzrokowe i czaszkowe, aby zakończyć wycięcie z czaszki.
  10. Dla każdego warunku zbierz od pięciu do ośmiu mózgów myszy razem w schłodzonym szklanym homogenizatorze Dounce zawierającym 14 ml buforu A (Tabela 1).

3. Przygotowanie synaptosomów

UWAGA: Schematy tej procedury są pokazane w Rysunek 4.

Proces przygotowania synaptosomów, schemat wirowania, metoda separacji biochemicznej, krok po kroku.
Rysunek 4: Przygotowanie synaptosomu. Schemat kroku 3, wytwarzanie synaptosomów (P2'). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Homogenizuj mózgi za pomocą szklanego homogenizatora Dounce w 12 przejściach góra-dół przy 500 obr./min (łącznie). Zatrzymaj się na chwilę przy każdym pociągnięciu w dół, aby zapewnić dokładną homogenizację tkanki. Homogenizuj preferencyjnie w łaźni lodowej, aby uniknąć ocieplenia i denaturacji białka. Pobrać 5 μl podwielokrotności do oznaczania stężenia białka za pomocą testu kwasu bicynkowego (BCA, patrz tabela materiałów). Weź 100 μl całych porcji lizatu mózgu dla western blot (WB). Dla tej i wszystkich kolejnych próbek (Rysunek 2) weź dwie podwielokrotności dla BCA i dwie podwielokrotności dla WB. Błyskawiczne zamrożenie wszystkich zebranych podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  2. Obracać całkowity homogenat mózgu w probówce wirówkowej z okrągłym dnem o dużej prędkości (14 ml) (patrz tabela materiałów) przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby otrzymać supernatant (S1). Przenieś S1 do nowej probówki wirówkowej, pozostawiając osad (P1), który zawiera nienaruszone komórki i jądra. Unikać pipetowania puszystych, białych, sypkich, powierzchownych osadów. Weź 2 x 5 μl S1 dla BCA i 2 x 100 μl S1 dla WB.
  3. Wirować S1 w temperaturze 9 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać supernatant synaptosomalny (S2) i surowy osad synapsomów (P2). Weź 2 x 10 μl S2 dla BCA i 2 x 500 μl S2 dla WB. Po uzyskaniu podwielokrotności należy odrzucić supernatant i przejść do następnego kroku ze osadem.
  4. Zawiesić P2 w 3 ml lodowatego buforu A z inhibitorami proteazy i odwirować przy 9 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania supernatantu (S2') i przemytych synaptosomów (P2'). Odrzucić supernatant i zachować osad.
  5. Ponownie zawiesić P2' w 3 ml buforu A. Unikaj ponownego zawieszania ciemnoczerwonej części na dnie osadu, który zawiera głównie mitochondria. Weź 2 x 20 μL P2' dla BCA i 2 x 100 μL P2' dla WB.
    UWAGA: Można to osiągnąć, delikatnie mieszając pipetą krawędzie i powierzchnię osadu w celu ponownego zawieszenia białych przemytych synaptosomów, jednocześnie kierując końcówkę pipety z dala od czerwonego środka osadu.

4. Hipotoniczna liza

UWAGA: Schematy tej procedury są pokazane w Rysunek 5.

Schemat etapu lizy hipotonicznej; Konfiguracja wirówki do rozbijania komórek, separacji, oczyszczania.
Rysunek 5: Hipotoniczna liza. Schemat kroku 4, hipotoniczna liza synaptosomów w celu wytworzenia supernatantu do lizy (LS1) i frakcji błony synaptosomalnej (LP1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. W celu hipotonicznej lizy przemytych synaptosomów dodać 9 objętości schłodzonego buforu B (Tabela 1) do zawieszonego P2' (~27 ml). Homogenizuj synaptosomy w szklanym homogenizatorze Dounce (trzy przejścia góra-dół przy 500 obr./min).
  2. Przenieść próbki do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Obracaj je na rewolwerze rurowym w chłodni o temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  3. Wirować lizę P2' przy 25 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania supernatantu do lizy (LS1) i osadu do lizy zawierającego błony synaptosomalne (LP1). Weź 2 x 50 μl LS1 dla BCA i 2 x 400 μl LS1 dla WB. Przenieś LS1 do zakorkowanej probówki wirówkowej w celu ultrawirowania (patrz Tabela materiałów).

5. Izolacja pęcherzyków synaptycznych

UWAGA: Schematy tej procedury są pokazane w Rysunek 6.

Schemat izolacji pęcherzyków synaptycznych i błony plazmatycznej, wirowanie i proces gradientowy.
Rysunek 6: Izolacja pęcherzyków synaptycznych i izolacja błony plazmatycznej synaptycznej. (A) Schemat kroku 5, izolacja cytozolu synaptycznego (LS2) i frakcji pęcherzyków synaptycznych (LP2), oraz (B) etap 6, wytwarzanie mieliny (MF), błony plazmatycznej synaps (SPM) i frakcji mitochondrialnej (Mito.) po ultrawirowaniu gradientów sacharozy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Odwirować LS1 w wirniku ultrawirówki o stałym kącie nachylenia (patrz tabela materiałów) przy 100 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania supernatantu cytozolu synaptycznego (LS2) i osadu pęcherzyków synaptycznych (LP2). LP2 będzie mały, półprzezroczysty i silnie przylegający do boku probówki wirówkowej.
  2. Zawiesić LP2 w 500 μl buforu A. Za pomocą igły 23 G i strzykawki o pojemności 1 ml ścinać LP2 z delikatnym rozcieraniem. Weź 2 x 10 μl LP2 dla BCA i 2 x 250 μl LP2 dla WB.
  3. Przenieść LS2 (~30 ml) do odśrodkowych jednostek filtrujących z odcięciem 10 kDa (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Jeśli interesujące są białka mniejsze niż 10 kDa, dostępne są odśrodkowe jednostki filtrujące o masie odcięcia 4 kDa, które spowodują dłuższe czasy wirowania.
  4. Zagęścić LS2 do około 0,5 ml, wirując w temperaturze 5000 x g przez maksymalnie 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Weź 2 x 10 μl stężonego LS2 dla BCA i 2 x 250 μl stężonego LS2 dla WB. Po rozpoczęciu wirowania przejdź bezpośrednio do kroku 6.1.

6. Izolacja błony plazmatycznej synaps

  1. Zawiesić LP1 (krok 4.3) w 1 ml buforu B (Tabela 1). Weź 2 x 10 μl LP1 dla BCA i 2 x 50 μl LP1 dla WB. Dostosować pozostałą ilość LP1 do końcowej objętości 7,5 ml i końcowego stężenia sacharozy 1,1 M za pomocą buforu B i buforu C (Tabela 1).
  2. Przenieść 7,5 ml zawieszonego LP1 do probówki ultrawirówki o pojemności 14 ml (patrz tabela materiałów). Ostrożnie nałożyć na LP1 3,75 ml buforu D (Tabela 1), a następnie nałożyć 1,25 ml buforu A (lub większą objętość do napełnienia tuż poniżej górnej części probówki wirówkowej). Należy unikać pipetowania wzdłuż boku probówki, ponieważ może to zakłócić pasma gradientu sacharozy. Po nałożeniu każdej frakcji sacharozy zaznacz górną część roztworu pisakiem. Zrównoważyć probówki do ultrawirowania wagowo, a nie objętościowo, dodając kroplami bufor A z dokładnością do 10 mg. Wirować przy 48 000 x g przez 2,5 h w temperaturze 4 °C w wirniku ultrawirówki z odchylanym wiadrem (patrz tabela materiałów).
  3. Zdobądź obrazy nienaruszonych gradientów po ultrawirowaniu, aby udokumentować odrębność każdego granicy faz sacharozy i sukces frakcjonowania.
  4. Ostrożnie usunąć powierzchowną warstwę 320 mM sacharozy (bufor A). Odzyskaj frakcję mielinową (MF) na granicy faz sacharozy 320 mM/855 mM w objętości 800 μl. Odzyskaj frakcję synaptycznej błony plazmatycznej (SPM) na granicy faz sacharozy 855 mM/1,1 M w objętości 1,000 μl. Odpipetować każdą frakcję w górę od ścianki probówki w sposób okrężny, aby upewnić się, że cała frakcja została zebrana. Ostrożnie odessać pozostałą sacharozę i odzyskać osad mitochondrialny (Mito.) poprzez ponowne zawieszenie w 200 μl buforu B. Weź 2 x 100 μL MF dla BCA i 2 x 10 μL Mito. dla BCA; podzielić pozostałą część MF i Mito. próbki na pół dla WB.
  5. Rozcieńczyć frakcję SPM 2 objętościami buforu B (~2 ml), a następnie odwirować w wirniku o stałym kącie w probówce wirówkowej o pojemności 3,5 ml (patrz tabela materiałów) przy 25 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad SPM w buforze A do końcowej objętości 250 μl. Weź 2 x 5 μl SPM dla BCA i podziel pozostały SPM na pół dla WB.
  6. Wykonać BCA, aby określić stężenie białka w każdej próbce, biorąc pod uwagę zmienną objętość podwielokrotności.
    UWAGA: W przypadku analizy WB sugerowane stężenie białka roboczego dla wszystkich frakcji subkomórkowych wynosi 2 μg/μL (lub tak wysokie, jak jest osiągalne dla LS1 i MF).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metoda daje w wyniku 11 subkomórkowych frakcji mózgu, które mogą być poddane dalszemu oczyszczaniu i różnym formom dalszej analizy35,36. Złotym standardem metody oceny jakości synaptosomów, SVs23 i innych składników jest mikroskopia elektronowa (EM) (Rysunek 7). Ilościowe immunoblotting dla białek, które są obecne w określonych frakcjach subkomórkowych, można również przeprowadzić w celu oceny markerów czystości frakcji (Rysunek 8). Na przykład analiza frakcji immunoblot ujawnia wzbogacenie N-kadheryny (CDH2, nazwa UniProt) we frakcji błony synaptycznej plazmatycznej (SPM), α-synukleiny (SYUA) w cytozolu synaptycznym (LS2), synaptofizyny (SYPH) we frakcji pęcherzyków synaptycznych (LP2) i zasadowego białka mieliny (MBP) we frakcji mieliny (MF) w porównaniu z poziomami białka w początkowym homogenacie całego mózgu (ogółem) (Rysunek 8). Po ustaleniu czystości frakcji (na przykład należy zwrócić uwagę na brak CDH2 we frakcji LS2 lub wielokrotny wzrost SYPH we frakcji LP2), ilościowe immunoblotty można zastosować do określenia lokalizacji białek będących przedmiotem zainteresowania lub zbadania różnic w dystrybucji białek między genotypami lub leczeniem. Zrozumienie subkomórkowej lokalizacji białek synaptycznych może umożliwić analizę wcześniej nieopisanych funkcji białek. Co więcej, metoda ta może wyjaśnić defekty transportu lub dysfunkcję synaps w stanach chorobowych, zwłaszcza w połączeniu z testami funkcjonalnymi. Na przykład nasz zespół wykorzystał tę metodę do zidentyfikowania puli enzymatycznie aktywnej tioesterazy białka palmitoilu 1, która jest wzbogacona w cytozol synaptyczny 19.

Analiza ultrastruktury komórek; mikrografie elektronów organelli, badania biologii komórki, badania strukturalne.
Rysunek 7: Mikroskopia elektronowa (EM) synaptosomów. (A) Reprezentatywny obraz EM synaptosomu zawierającego pęcherzyki synaptyczne (strzałka). (B) Reprezentatywny obraz EM synaptosmu z komponentami pre-(strzałka), jak i postsynaptycznymi (podwójna strzałka). (C) Reprezentatywny obraz EM synaptosmu zawierającego pęcherzyki synaptyczne i mitochondrium (strzałka) (podziałka skali = 100 nm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Frakcjonowanie białek; CDH2, analiza MBP; Wykres żelowy i słupkowy; wzbogacanie markerów; Porównanie danych.
Rysunek 8: Analiza immunoblot frakcji subkomórkowych. (A) Markery czystości frakcji subkomórkowej (oznaczone nomenklaturą UniProt ) są odpowiednio zlokalizowane w porównaniu do homogenatu całego mózgu (ogółem): N-kadheryna (CDH2) we frakcji błony plazmatycznej synaptycznej (SPM), synaptofizyna 1 (SYPH) i synaptonina 1 (SYNJ1) we frakcji wzbogaconej pęcherzykami synaptycznymi (LP2), α-synukleina (SYUA) w cytozolu synaptycznym (LS2), i zasadowe białko mielinowe (MBP) we frakcji mielinowej (MF). (B) Analiza ilościowa immunoblot ujawnia wzbogacenie (krotną zmianę w stosunku do całkowitej) markerów czystości frakcji. Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe w skali log10. Linia przerywana wskazuje 1,5-krotną zmianę (y = 0,176) (n = 3 powtórzone eksperymenty z 8 myszami typu dzikiego; wiek = 2 miesiące; n = 4-5 blot dla SYPH, SYUA, MBP, przy czym n = 3 wykreślone wartości wcześniej opublikowane przez Gorenberg et al.19; n = 5 dla SYNJ1; n = 1 dla CDH2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W swoich przełomowych badaniach Whittaker i współpracownicy wykorzystali cztery kryteria morfologiczne do identyfikacji synaptosomów: (1) struktury mają uszczelnioną błonę plazmatyczną; (2) struktury zawierają SV przypominające te w zakończeniach nerwowych i żylaki in situ pod względem wielkości i liczby; (3) struktury posiadają jedno lub więcej małych mitochondriów; oraz (4) błona presynaptyczna jest często przylegająca do komponentu postsynaptycznego 11,12,13. Chociaż pierwsze dwa kryteria generalnie mają zastosowanie do każdej metody izolacji, w najnowszych protokołach opisanych w tym artykule nie wszystkie powstałe synaptosomy będą miały mitochondria i przyłączone zakończenia postsynaptyczne. Około 60% synaptosomów będzie miało mitochondria, a szacuje się, że tylko do 15% ma przyłączone zakończenia postsynaptyczne37. Jeśli składniki postsynaptyczne są szczególnie interesujące, wiadomo, że zastosowanie izotonicznego buforu homogenizacyjnego podobnego do Krebsa i filtracji ciśnieniowej w celu wzbogacenia daje wysokie stężenia synaptosomów z zakończeniami postsynaptycznymi (zwanymi również synaptoneurosomami)22,38.

Metoda składania w ofierze zwierzęcia może wpływać na jakość synaptosomów i podfrakcji synaptycznych. Dorosłe zwierzęta uśmiercone metodą eutanazji, która nie wymaga znieczulenia, uzyskają najlepszą jakość frakcji. Co więcej, mózgi powinny być świeżo wypreparowane, nie zamrożone i homogenizowane przy użyciu stosunku bufora homogenizacyjnego 1:10 (waga/objętość) dla najbardziej żywotnych frakcji synaptycznych22. Mózg ma niejednorodną populację synaps, które można różnicować ze względu na rodzaj przenoszonych przez nie neuroprzekaźników. Na tworzenie synaptosomów na ogół nie ma wpływu typ synapsy ani zawartość neuroprzekaźników13. Wyjątkiem są omszałe włókna w móżdżku, o których wiadomo, że są zaburzone w optymalnych warunkach do pozyskiwania synaptosomów z reszty mózgu39,40. Dlatego zaleca się usunięcie móżdżku przed homogenizacją mózgu, jeśli wykluczenie tego regionu nie wpływa na cel eksperymentalny. Jeśli jesteś zainteresowany izolacją synaptosomów o określonym charakterze neuroprzekaźnika, obszary mózgu, które są wzbogacone o neurony zawierające interesujący nas neuroprzekaźnik, mogą być najpierw wyizolowane. Podejście to będzie jednak nakładać ograniczenia na końcowy plon frakcji, w zależności od wielkości regionu zainteresowania (w związku z tym wiek zwierząt jest również brany pod uwagę). Istnieją immunochemiczne metody izolacji synaptosomów specyficznych dla neuroprzekaźników, ale żywotność i wydajność będą znacznie zagrożone22. Jeśli ocena żywotności metabolicznej synaptosomów jest ważna, można zastosować pomiar uwalniania neuroprzekaźników41,42 lub niektóre testy enzymatyczne43.

Typowe zanieczyszczenia w preparatach synaptosomów obejmują mikrosomy, wolne mitochondria, SV oraz błony neuronalne i glejowe. Zanieczyszczenie można zmniejszyć, zwiększając liczbę płukań przy frakcjach P1 i P222 i unikając ponownego zawieszania czerwonego osadu mitochondrialnego w kolejnych etapach. W eksperymentach, w których żywotność metaboliczna i czas mają kluczowe znaczenie, pomocne będzie zmniejszenie liczby prań i zastosowanie gradientów Ficoll lub Percoll zamiast gradientów sacharozy 44,45,46. Metody te również znacznie zmniejszają zanieczyszczenie. Oryginalny protokół Whittakera zaowocował wysokiej jakości SV. Dalsza optymalizacja dokonana przez Nagya i wsp.23, zawarta w tej metodzie, pozwala uzyskać SV o niezwykłej jednorodności i czystości bez znacznego uszczerbku dla plonu36. Jeśli interesujące są określone podtypy SV, takie jak SV glutaminergiczne (zawierające VGLUT-1) lub GABA-ergiczne (zawierające VGAT-1), można przeprowadzić immunoizolację przy użyciu swoistych przeciwciał47,48. Dostępne są również alternatywne metody izolowania CCV od synaptosomów, które ze względu na różną gęstość mogą nie występować na tym samym interfejsie, co SV otrzymane tą metodą 20,49,50.

Ogólnie rzecz biorąc, obecny protokół izolacji składników synaptycznych można dodatkowo zoptymalizować w celu uzyskania frakcji o zwiększonej jednorodności i żywotności w oparciu o jakość i ilość źródłowej tkanki mózgowej oraz cele eksperymentalne. Aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów, należy zapoznać się z rozdziałami książek Dunkleya i Robinsona22 oraz Ganzella i wsp.36.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować P. Colosi za przygotowanie obrazu EM. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), Departament Obrony Stanów Zjednoczonych (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), Aligning Science across Parkinson's (ASAP) Collaborative Research Network (SSC) oraz Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC & VDJ). Ilustracje graficzne tworzyliśmy z wykorzystaniem BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml TB StrzykawkaBD309649
1,5 ml Eppendorf TubesUSA Scientific1415-2500
14 mL, otwarta cienkościenna ultraprzezroczysta rurkaBeckman Coulter344060Kompatybilna z
igłą podskórną SW 40 Ti 23 Gauge Precision GlideBD305145
26,3 mL, butelka z poliwęglanu z zespołem nakrętkiBeckman Coulter355618Kompatybilna z
grubościenną rurką polipropylenową Ti70 3,5 mL z otwartymBeckman Coulter349623Kompatybilna z TLA-100.3
50 ml Falcon TubesFisher Scientific14-432-22
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 Millipore Sigma UFC901024
AprotininSigma-AldrichA62791 mg / ml w diH2O
Wirówka Avanti J-26 XPBeckman CoulterB22984< 26 000 obr./min
Stołowa kolba Dewara HDPEThermo Scientific5028U19
C57BL/6J MyszyWirówka Jackson Labs000664
5810REppendorfEP022628168< 14 000 obr./min
kompletne, mini, wolne od EDTA tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazyRoche11873580001Dodaj 1 tabletkę na 50 ml roztworu
Zakrzywione kleszczeNarzędzia do naukiprecyzyjnej 11273-20
Cienkie nożyczki chirurgiczneFine Science Tools8r
System homogenizacji tkanek Glas-ColCole-ParmerUX-04369-15
Kleszcze GraefeFine Science Tools11650-10
Szybkoobrotowe probówki wirówkowe z okrągłym dnem z poliwęglanuThermoFisher3117-0500Kompatybilny z izofluoranem JA20
Henry Schein Zdrowie zwierzątNDC 11695-6776-2
JA-20 RotorBeckman Coulter334831
LeupeptinAmerican BioAB011081 mg / ml w diH2O
Kwas N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[2-etanosulfonowy] (HEPES)American BioAB00892
Optima L-80 XP UltrawirówkaBeckman Coulter< 100 000 obr./min
Ultrawirówka Optima TLXBeckman Coulter< 120 000 obr./min
Pepstatyna AThermo Scientific784361 mg / ml w
DMSO Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)American BioAB01620
Pierce Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Scientific23335Do oznaczania stężenia białka
Końcówki
Pipety
SacharozaSigma-AldrichS0389
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14002-12
SW 40 Ti Rotor z łyżką wahadłowąBeckman Coulter331301
teflonowy tłuczek i moździerz Młynek do tkanekThomas Scientific3431D94
Ti70 RotorBeckman Coulter337922
TLA-100.3 RotorBeckman Coulter349490
Rewolwer rurowyDot ScientificDTR-02VS
wierzchem do pipet serologiczne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Synaptic Transmission. Principles of Neural Science, Fifth Edition. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J., Education, A. J. , McGraw-Hill Education. New York, NY. (2014).
  2. Lepeta, K., et al. Synaptopathies: synaptic dysfunction in neurological disorders - A review from students to students. Journal of Neurochemistry. 138 (6), 785-805 (2016).
  3. Südhof, T. C., Malenka, R. C. Understanding synapses: Past, present, and future. Neuron. 60 (3), 469-476 (2008).
  4. Südhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12696-12717 (2014).
  5. Jahn, R., Boyken, J. Molecular Regulation of Synaptic Release. Neuroscience in the 21st Century: From Basic to Clinical. Pfaff, D. W. , Springer. New York. New York, NY. 351-401 (2013).
  6. Xiong, H., Gendelman, H. E. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York. New York, NY. (2014).
  7. Azevedo, F. A., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  8. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 10661-10668 (2012).
  9. Herculano-Houzel, S., Lent, R. Isotropic fractionator: A simple, rapid method for the quantification of total cell and neuron numbers in the brain. Journal of Neuroscience. 25 (10), 2518-2521 (2005).
  10. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  11. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. Journal of Anatomy. 96, 79-88 (1962).
  12. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of synaptic vesicles from the central nervous system. Journal of Physiology. 153, 35-37 (1960).
  13. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. Journal of Neurocytology. 22 (9), 735-742 (1993).
  14. Jahn, R., Fasshauer, D. Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles. Nature. 490, 201-207 (2012).
  15. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes). Biochemical Journal. 90 (2), 293-303 (1964).
  16. De Robertis, E., Rodriguez De Lores Arnaiz, G., Pellegrino De Iraldi, A. Isolation of synaptic vesicles from nerve endings of the rat brain. Nature. 194, 794-795 (1962).
  17. De Robertis, E., Pellegrino De Iraldi, A., Rodriguez, G., Gomez, C. J. On the isolation of nerve endings and synaptic vesicles. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (1), 229-235 (1961).
  18. Zimmermann, H., Whittaker, V. P. The Discovery of the Synaptosome and Its Implications. Synaptosomes. Murphy, K. M. , Springer. New York. New York, NY. 9-26 (2018).
  19. Gorenberg, E. L., et al. Identification of substrates of palmitoyl protein thioesterase 1 highlights roles of depalmitoylation in disulfide bond formation and synaptic function. PLoS Biology. 20 (3), 3001590(2022).
  20. Vidyadhara, D. J., et al. Dopamine transporter and synaptic vesicle sorting defects initiate auxilin-linked Parkinson's disease. bioRxiv. , (2022).
  21. Schrimpf, S. P., et al. Proteomic analysis of synaptosomes using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Proteomics. 5 (10), 2531-2541 (2005).
  22. Dunkley, P. R., Robinson, P. J. Synaptosome Preparations: Which Procedure Should I Use. Synaptosomes. Murphy, K. M. , Springer. New York. New York, NY. 27-53 (2018).
  23. Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Research. 109 (2), 285-309 (1976).
  24. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  25. Wagner, J. A., Kelly, R. B. Topological organization of proteins in an intracellular secretory organelle: the synaptic vesicle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (8), 4126-4130 (1979).
  26. Jahn, R., Schiebler, W., Ouimet, C., Greengard, P. A 38,000-dalton membrane protein (p38) present in synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (12), 4137-4141 (1985).
  27. Binotti, B., Jahn, R., Pérez-Lara, Á An overview of the synaptic vesicle lipid composition. Archives of Biochemistry and Biophysics. 709, 108966(2021).
  28. Siegel, D. P., Ware, B. R. Electrokinetic properties of synaptic vesicles and synaptosomal membranes. Biophysical Journal. 30 (1), 159-172 (1980).
  29. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from disrupted nervending particles. Biochemical Pharmacology. 12 (3), 300-302 (1963).
  30. Clementi, F., Whittaker, V. P., Sheridan, M. N. The yield of synaptosomes from the cerebral cortex of guinea pigs estimated by a polystyrene bead "tagging" procedure. Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 72, 126-138 (1966).
  31. Carlson, S. S., Wagner, J. A., Kelly, R. B. Purification of synaptic vesicles from elasmobranch electric organ and the use of biophysical criteria to demonstrate purity. Biochemistry. 17 (7), 1188-1199 (1978).
  32. Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. Journal of Cell Biology. 96 (5), 1374-1388 (1983).
  33. Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals. 45 (1), 1-13 (2011).
  34. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Canadian Veterinary Journal. 53 (3), 299-302 (2012).
  35. Deutsch, C., Drown, C., Rafalowska, U., Silver, I. A. Synaptosomes from rat brain: Morphology, compartmentation, and transmembrane pH and electrical gradients. Journal of Neurochemistry. 36 (6), 2063-2072 (1981).
  36. Ganzella, M., Ninov, M., Riedel, D., Jahn, R. Isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Methods in Molecular Biology. 2417, 131-145 (2022).
  37. Dunkley, P. R., et al. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Research. 441 (1-2), 59-71 (1988).
  38. Schwartz, R. D., Skolnick, P., Hollingsworth, E. B., Paul, S. M. Barbiturate and picrotoxin-sensitive chloride efflux in rat cerebral cortical synaptoneurosomes. FEBS Letters. 175 (1), 193-196 (1984).
  39. Pittaluga, A., Thellung, S., Maura, G., Raiteri, M. Characterization of two central AMPA-preferring receptors having distinct location, function and pharmacology. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 349 (6), 555-558 (1994).
  40. Israël, M., Whittaker, V. P. The isolation of mossy fibre endings from the granular layer of the cerebellar cortex. Experientia. 21 (6), 325-326 (1965).
  41. Khvotchev, M., Lonart, G., Südhof, T. C. Role of calcium in neurotransmitter release evoked by alpha-latrotoxin or hypertonic sucrose. Neuroscience. 101 (3), 793-802 (2000).
  42. Lonart, G., Janz, R., Johnson, K. M., Südhof, T. C. Mechanism of action of rab3A in mossy fiber LTP. Neuron. 21 (5), 1141-1150 (1998).
  43. Nicholls, D. G., Sihra, T. S. Synaptosomes possess an exocytotic pool of glutamate. Nature. 321 (6072), 772-773 (1986).
  44. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nature Protocols. 3 (11), 1718-1728 (2008).
  45. Cotman, C. W., Matthews, D. A. Synaptic plasma membranes from rat brain synaptosomes: Isolation and partial characterization. Biochimica et Biophysica Acta. 249 (2), 380-394 (1971).
  46. Booth, R. F., Clark, J. B. A rapid method for the preparation of relatively pure metabolically competent synaptosomes from rat brain. Biochemical Journal. 176 (2), 365-370 (1978).
  47. Takamori, S., Riedel, D., Jahn, R. Immunoisolation of GABA-specific synaptic vesicles defines a functionally distinct subset of synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 20 (3), 4904-4911 (2000).
  48. Burger, P. M., et al. Synaptic vesicles immunoisolated from rat cerebral cortex contain high levels of glutamate. Neuron. 3 (6), 715-720 (1989).
  49. Blondeau, F., et al. Tandem MS analysis of brain clathrin-coated vesicles reveals their critical involvement in synaptic vesicle recycling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3833-3838 (2004).
  50. Maycox, P. R., Link, E., Reetz, A., Morris, S. A., Jahn, R. Clathrin-coated vesicles in nervous tissue are involved primarily in synaptic vesicle recycling. Journal of Cell Biology. 118 (6), 1379-1388 (1992).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Subcellular FractionationSynaptic ComponentsSynaptosome IsolationMurine BrainSynaptic TerminalsSynaptic VesiclesSynaptic Plasma MembraneElectron MicroscopyWestern BlotSucrose Gradient

Related Articles