Method Article

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

DOI:

10.3791/64578

⸱

April 7th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus Zika (ZIKV) to wirus przenoszony przez komary należący do rodzaju Flavivirus. Zakażenie wirusem ZIKV wiąże się z wrodzonymi nieprawidłowościami mózgu i potencjalnie zespołem Guillaina-Barrégo u dorosłych. Badania nad ZIKV w celu zrozumienia mechanizmów choroby są ważne dla ułatwienia opracowania szczepionek i leczenia. Metoda ilościowego oznaczania wirusów jest kluczowa i fundamentalna w dziedzinie wirusologii. Test tworzenia ostrości (FFA) to test ilościowy wirusa, który wykrywa antygen wirusowy za pomocą przeciwciał i identyfikuje ogniska infekcji komórek za pomocą techniki barwienia immunologicznego peroksydazy. Obecne badanie opisuje protokół propagacji i kwantyfikacji wirusa przy użyciu formatów zarówno 24-dołkowych, jak i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości). W porównaniu z innymi podobnymi badaniami, protokół ten dodatkowo opisał optymalizację wielkości ognisk, co może służyć jako przewodnik do rozszerzenia zastosowania tego testu dla innych wirusów. Po pierwsze, namnażanie ZIKV odbywa się w komórkach Vero przez 3 dni. Supernatant hodowli zawierający ZIKV jest zbierany i oznaczany ilościowo przy użyciu FFA. Krótko mówiąc, kultura wirusa jest inokulowana na komórkach Vero i inkubowana przez 2-3 dni. Tworzenie ognisk jest następnie określane po zoptymalizowanych procesach barwienia, w tym utrwalaniu komórek, przepuszczalności, blokowaniu, wiązaniu przeciwciał i inkubacji z substratem peroksydazy. Barwione ogniska wirusowe są wizualizowane za pomocą mikroskopu stereoskopowego (ręczne liczenie w formacie 24-dołkowym) lub analizatora programowego (automatyczne liczenie w formacie 96-dołkowym). FFA zapewnia powtarzalne, stosunkowo szybkie wyniki (3-4 dni) i nadaje się do stosowania w przypadku różnych wirusów, w tym wirusów nietworzących płytki nazębnej. Następnie protokół ten jest przydatny do badania infekcji ZIKV i może być wykorzystany do wykrywania innych klinicznie ważnych wirusów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie wirusem Zika (ZIKV) jest nową chorobą wirusową przenoszoną przez komary. Pierwsza izolacja ZIKV miała miejsce w Ugandzie w 1947 roku1,2; Od 1947 do 2007 r. pozostawała zaniedbana, ponieważ objawy kliniczne są najczęściej bezobjawowe i charakteryzują się samoograniczającą się chorobą gorączkową. W 2007 roku epidemia wirusa Zika rozpoczęła się na wyspach Yap3,4, po czym nastąpiły większe epidemie w regionach Pacyfiku (Polinezja Francuska, Wyspa Wielkanocna, Wyspy Cooka i Nowa Kaledonia) od 2013 do 2014 roku5,6,7,8, gdzie po raz pierwszy u dorosłych zgłoszono ciężkie powikłanie neurologiczne zespół Guillaina-Barrégo (GBS)9. W latach 2015 i 2016 pierwsza szeroko zakrojona epidemia ZIKV przetoczyła się przez obie Ameryki po pojawieniu się azjatyckiego genotypu ZIKV w Brazylii już w 2013 roku10. Podczas tej epidemii zgłoszono od 440 000 do 1,3 miliona przypadków małogłowia i innych zaburzeń neurologicznych u noworodków11. Obecnie nie ma specyficznego lekarstwa ani leczenia zakażenia ZIKV; W związku z tym istnieje pilna potrzeba medyczna szczepionek przeciwko ZIKV, które mogą zapobiegać zakażeniom, szczególnie w czasie ciąży.

Kwantyfikacja wirusów to proces mający na celu określenie liczby wirusów obecnych w próbce. Odgrywa ważną rolę w badaniach, a laboratoria akademickie obejmują wiele dziedzin, takich jak medycyna i nauki przyrodnicze. Proces ten jest również ważny w sektorach komercyjnych, takich jak produkcja szczepionek wirusowych, białek rekombinowanych, antygenów wirusowych lub środków przeciwwirusowych. Do ilościowego oznaczania wirusa można użyć wielu metod lub testów12. Wybór metod lub testów zwykle zależy od charakterystyki wirusa, pożądanego poziomu dokładności oraz charakteru eksperymentu lub badania. Ogólnie rzecz biorąc, metody ilościowego oznaczania wirusów można podzielić na dwie kategorie: testy molekularne, które wykrywają obecność wirusowego kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) oraz testy, które mierzą zakaźność wirusa in vitro12. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR, dla DNA) lub ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR, dla RNA)13 i cyfrowa kropelka PCR14 to przykłady typowych technik molekularnych stosowanych do ilościowego oznaczania wirusowego kwasu nukleinowego w danej próbce15. Jednak te bardzo czułe techniki molekularne nie są w stanie odróżnić wirusów żywotnych od nieżywotnych15. W związku z tym badania, które wymagają informacji na temat cech biologicznych, takich jak zakaźność wirusa na komórkach, nie mogą być przeprowadzone przy użyciu wyżej wymienionych technik molekularnych; Potrzebne są testy, które mogą zmierzyć i określić obecność żywych wirusów. Testy, które mierzą zakaźność wirusa, obejmują test tworzenia płytki nazębnej (PFA), 50% dawkę zakaźną kultury tkankowej (TCID50), test ogniskowania fluorescencyjnego i transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM)12.

PFA, opracowany przez Renato Dulbecco w 1952 roku, jest jedną z najczęściej używanych metod miareczkowania wirusów, w tym dla klasy ZIKV16. Służy do bezpośredniego oznaczania stężeń wirusów dla zakaźnych wirionów litycznych. Metoda opiera się na zdolności wirusa litycznego do wywoływania efektów cytopatycznych (CPE; strefy śmierci komórki lub blaszki miażdżycowe, obszar infekcji otoczony niezakażonymi komórkami) w zaszczepionej monowarstwie komórek po zakażeniu wirusowym. Istnieje jednak kilka wad testu, które wpływają na jego użyteczność. Test jest czasochłonny (trwa około 7-10 dni, w zależności od wirusów), zależny od CPE i podatny na błędy. W niniejszym badaniu przedstawiono technikę immunokolorymetryczną, test formowania ostrości (FFA), do wykrywania i ilościowego oznaczania ZIKV w formatach płytek 24-dołkowych i 96-dołkowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rozprzestrzenianie się wirusa

  1. Przygotowanie komórek
    1. Hoduj komórki Vero w kolbie hodowlanej o średnicy 75cm2 zawierającej 12 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 2 mM L-glutaminą (patrz tabela materiałów). Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. Monitoruj komórki pod mikroskopem; gdy komórki osiągną zbieżność 70%-90%, są gotowe do użycia (Rysunek 1A) .
      UWAGA: Komórki Vero podwajają się mniej więcej co 24 h17. Rozcieńczenia w stosunku 1:10 powinny zająć od 3 do 4 dni, aby osiągnąć 80%-90% zlewności w kolbie o średnicy75 cm2. Monitoruj komórki codziennie lub co drugi dzień.
  2. Zakażenie monowarstwy komórkowej
    1. Usunąć pożywkę wzrostową z kolby do hodowli komórkowych za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Przepłukać kolbę 3 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (dPBS) firmy Dulbecco 2x za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
      UWAGA: Należy przygotować zlewkę z 10% podchlorynem sodu w celu dezynfekcji wszelkich wyrzuconych zakaźnych odpadów płynnych z kolb/talerzy.
    2. Dodać 2 ml DMEM bez surowicy (DMEM uzupełnione o 2 mM L-glutaminy bez FBS) i 20 μl inokulum ZIKV do kolby do hodowli komórkowych. Inkubować kolbę, delikatnie kołysząc przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję wirusa.
      UWAGA: Miareczkowanie początkowego zapasu ZIKV będzie pomocne w określeniu objętości dodatku inokulum ZIKV (krok 2).
      UWAGA: ZIKV jest klasyfikowany jako patogen o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Wszystkie procedury z użyciem materiałów zawierających ZIKV muszą być przeprowadzane w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego i muszą być zgodne ze wszystkimi standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP) przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.
  3. Dodanie nośnika nakładki
    1. Po 1 godzinnej inkubacji usunąć i wyrzucić rozcieńczony inokulum wirusa za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Przepłukać kolbę hodowli komórkowych 3 ml dPBS 2x.
    2. Dodać 12 ml pożywki podtrzymującej (DMEM uzupełnionej o 2% FBS, 2 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny) do kolby do hodowli komórkowych, aby utrzymać zakażone komórki.
    3. Inkubować zakażone komórki Vero przez 3 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Codziennie monitoruj pod mikroskopem pod kątem CPE zakażonych komórek Vero.
  4. Pobieranie supernatantu do hodowli komórkowych zawierającego ZIKV
    1. W 3 dniu po zakażeniu można zaobserwować zaokrąglanie i odwarstwianie komórek (CPE) (Rysunek 1B-D). Zebrać supernatant hodowli komórkowej zawierający ZIKV do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
    2. Użyj filtra strzykawkowego z polieterosulfonu 0,22 μm (patrz tabela materiałów), aby przefiltrować supernatant hodowli komórkowej. Porcję 500 μl przefiltrowanego supernatantu z hodowli komórkowej rozlać do probówek z nakrętką o pojemności 2,0 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia><. UWAGA: Zebrany ZIKV może być przechowywany w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
      UWAGA: W przypadku użycia igły strzykawkowej należy podjąć dodatkowe środki ostrożności, ponieważ igła może przebić skórę. Należy ustanowić laboratoryjne standardowe procedury operacyjne.

2. Kwantyfikacja wirusa

  1. Przygotowanie komórek
    1. Wysiewać komórki Vero na wyznaczonych płytkach (płytka 24-dołkowa: 0,5 ml/basenik, 7,5 x 104 komórki/dołek; płytka 96-dołkowa: 0,1 ml/dołek, 1,5 x 104 komórki/basenik) i inkubować płytkę przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Istnieje pięć różnych punktów czasowych do przetestowania (płytka 24-dołkowa: 48 godzin, 60 godzin, 72 godziny, 84 godziny i 96 godzin po zakażeniu; płytka 96-dołkowa: 24 godziny, 36 godzin, 48 godzin, 60 godzin i 72 godziny po zakażeniu); Dlatego przygotuj jedną płytkę dla każdego punktu czasowego.
    2. Po 24 godzinnej inkubacji i gdy komórki osiągną zbieżność 70%-90% (Rysunek 1E), płytka jest gotowa do infekcji. Przystąpić do przygotowania rozcieńczonego wywaru wirusa (krok 2.2) przed zakażeniem monowarstwy komórki.
  2. Rozcieńczenie wirusa
    1. W przypadku płytek 24- i 96-dołkowych należy przygotować sześć sterylnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dla każdej płytki, aby przeprowadzić dziesięciokrotne rozcieńczenie (10-1 do 10-5), w tym kontrolę ujemną. W przypadku konfiguracji eksperymentalnej dla płytki 24-dołkowej dodaj 450 μl DMEM bez surowicy do wszystkich sześciu probówek mikrowirówek. W przypadku konfiguracji eksperymentalnej dla płytki 96-dołkowej dodaj 135 μl DMEM bez surowicy do sześciu probówek.
      UWAGA: Oznacz wyraźnie każdą probówkę, aby wskazać rozcieńczenie jej zawartości przed wykonaniem dziesięciokrotnego rozcieńczania szeregowego.
    2. Aby przeprowadzić rozcieńczanie seryjne, w konfiguracji eksperymentalnej z 24-dołkową płytką, dodaj 50 μl bulionu ZIKV, który został zebrany z kroku 1, do probówki 10-1 zawierającej 450 μl DMEM bez surowicy. W przypadku eksperymentu z 96-dołkową płytką dodaj 15 μl bulionu ZIKV do probówki 10-1 zawierającej 135 μl DMEM bez surowicy.
    3. Wiruj każdą probówkę, aby wymieszać wirusa i pożywkę. Jest to pierwsze dziesięciokrotne rozcieńczenie.
      UWAGA: Wymagane jest właściwe wymieszanie wirusa i pożywki hodowlanej w każdej probówce do rozcieńczania, aby zapewnić dokładne rozcieńczenie seryjne.
    4. W przypadku eksperymentu z płytką 24-dołkową należy użyć świeżej końcówki pipety, aby ponownie zawiesić probówkę 10-1 i przenieść 50 μl rozcieńczonego ZIKV do probówki 10-2 jako drugie dziesięciokrotne rozcieńczenie. W przypadku eksperymentu z płytką 96-dołkową należy użyć świeżej końcówki pipety, aby ponownie zawiesić probówkę 10-1 i przenieść 15 μl rozcieńczonego ZIKV do probówki 10-2 jako drugie dziesięciokrotne rozcieńczenie.
    5. Powtórzyć krok 2.2.4 cztery razy, aż do piątej probówki (z wyłączeniem kontroli ujemnej).
      UWAGA: Po każdym etapie pipetowania należy używać nowej końcówki do pipetowania, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
  3. Zakażenie monowarstwy komórkowej
    1. Wyjmij i wyrzuć kondycjonowaną pożywkę z każdej studzienki (płytka 24-dołkowa: 0,5 ml/dołek; płytka 96-dołkowa: 0,1 ml/dołek).
    2. Przepłukać każdą studzienkę dPBS 2x (płytka 24-dołkowa: 300 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 60 μl/basenik).
    3. Pracując od najwyższego do najniższego rozcieńczenia, dodać każdy seryjnie rozcieńczony inokulum wirusa do studzienki (płytka 24-dołkowa: 200 μL/basenik; płytka 96-dołkowa: 40 μL/basenik).
      UWAGA: Infekcja każdego rozcieńczenia zostanie przeprowadzona w zduplikowanych studzienkach. Utrzymuj dwie niezainfekowane studzienki jako kontrolę negatywną. Oznacz płytkę i studzienki wyraźnie, aby uniknąć nieporozumień. Wymieniaj końcówki pipet po każdym etapie pipetowania, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    4. Inkubować płytkę, delikatnie kołysząc przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję wirusa.
  4. Dodanie pożywki do hodowli komórkowych nakładki
    1. Po 1 godzinie inkubacji usunąć i wyrzucić zawiesinę wirusa od najniższego do najwyższego stężenia.
    2. Przemyć zakażone komórki dPBS 2x (płytka 24-dołkowa: 300 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 60 μl/dołek).
    3. Pokryj studzienkę DMEM (uzupełnionym 2% FBS, 2 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny) i 1,5% karboksymetylocelulozy o niskiej lepkości (CMC; patrz tabela materiałów) (płytka 24-dołkowa: 1 ml / dołek; płytka 96-dołkowa: 0,2 ml / dołek).
    4. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Nie naruszaj płytki podczas tego okresu inkubacji.
    5. Wyjąć płytkę z inkubatora do hodowli komórkowych w celu barwienia w różnych punktach czasowych (płytka 24-dołkowa: 48 godzin, 60 godzin, 72 godziny, 84 godziny i 96 godziny po zakażeniu; płytka 96-dołkowa: 24 godziny, 36 godzin, 48 godzin, 60 godzin i 72 godziny po zakażeniu).

3. Barwienie

  1. Utrwalanie komórek
    1. Po określonych godzinach inkubacji (płytka 24-dołkowa: 48 godzin, 60 godzin, 72 godziny, 84 godziny i 96 godziny po zakażeniu; płytka 96-dołkowa: 24 godziny, 36 godzin, 48 godzin, 60 godzin i 72 godziny po zakażeniu) należy usunąć i wyrzucić pożywkę nakładkową i przemyć komórki 3x 1x PBS. W przypadku płytki 96-dołkowej wyjąć i wyrzucić pożywkę nakładkową, a następnie przemyć komórki 3x 60 μL/basenik 1x PBS za pomocą pipety wielokanałowej.
    2. Dodaj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki (płytka 24-dołkowa: 300 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 60 μl/dołek). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 min.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest stałym spolimeryzowanym formaldehydem. Jest to łatwopalny, stały, biały, krystaliczny proszek, który po zmieszaniu z wodą lub podgrzaniu uwalnia gazowy formaldehyd. Wszystkie procedury związane z użyciem paraformaldehydu muszą być przeprowadzane w certyfikowanym dygestoriach chemicznych lub zatwierdzonych obudowach z wywiewem, zgodnie z laboratoryjnymi procedurami SOP specyficznymi dla substancji chemicznych zawierających formaldehyd.
    3. Po 20 minutach wyrzuć paraformaldehyd i przemyj komórki 3x 1x PBS. Wykonaj permeabilizację, blokowanie i inkubację przeciwciał, wykonując kroki 3.2-3.5.
      UWAGA: Wyrzucając 4% paraformaldehydu, postępuj zgodnie z procedurą usuwania odpadów uniwersytetu lub instytutu.
  2. Przenikanie komórek
    1. Dodać 1% oktylofenoksyetanolu poli(etylenoksy)etanolu (patrz tabela materiałów), aby przeniknąć komórki (płytka 24-dołkowa: 200 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 40 μl/dołek). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    2. Po 15 minutach wyrzuć oktylofenoksy poli(etylenoksy)etanol i umyj komórki 3x 1x PBS.
  3. Blokowanie
    1. Dodać 3% odtłuszczonego mleka, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie w próbce (płytka 24-dołkowa: 500 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 100 μl/basenik). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    2. Po 2 godzinach wyrzuć 3% odtłuszczone mleko i umyj komórki 3x 1x PBS.
      UWAGA: To jest punkt zatrzymania. Po dodaniu 3% odtłuszczonego mleka płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 dni przed wprowadzeniem przeciwciał pierwotnych.
  4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Dodać przeciwciało monoklonalne przeciwko flawiwirusowi, 4G2 (klon D1-4G2-4-15; przeciwciało pierwszorzędowe, patrz tabela materiałów) rozcieńczone w 1% odtłuszczonym mleku (stosunek 1:1,000) (płytka 24-dołkowa: 200 μl/basenik; płytka 96-dołkowa: 40 μL/basenik). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Po 1 godzinie usunąć roztwór zawierający przeciwciało monoklonalne i przemyć komórki 3x 1x PBS.
  5. Inkubacja przeciwciał wtórnych
    1. Dodać kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (patrz tabela materiałów) rozcieńczone w 1% odtłuszczonym mleku (stosunek 1:1,000) (płytka 24-dołkowa: 200 μl/dołek; płytka 96-dołkowa: 40 μl/dołek). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Po 1 godzinie usunąć roztwór zawierający przeciwciało drugorzędowe i przemyć komórki 3x 1x PBS.
  6. Inkubacja substratu
    1. Dodać substrat peroksydazy 3,3'diaminobenzydyny (DAB) (patrz tabela materiałów) i inkubować płytkę przez 30 minut w ciemności (płytka 24-dołkowa: 200 μl/basenik; płytka 96-dołkowa: 40 μl/basenik). Po 30 minutach zatrzymaj reakcję, myjąc studzienki wodą.
    2. Wysuszyć płytki na powietrzu przez noc i przystąpić do oznaczania ognisk po całkowitym wyschnięciu płytek.

4. Określenie miana wirusa

  1. Ręczny proces zliczania ognisk (format 24-dołkowy)
    1. Ogniska można uwidocznić pod mikroskopem stereoskopowym. Wybierz rozcieńczenie, które wytwarza 50-200 ognisk.
    2. Policz ogniska dla każdej kontrpróby wybranego rozcieńczenia. Obliczyć średnią liczbę ognisk dla każdego z wybranych rozcieńczeń.
    3. Obliczyć jednostkę tworzącą ogniska na ml (FFU/ml) dla każdej próbki, postępując według poniższego wzoru: FFU/ml = średnia liczba zliczonych ognisk/(rozcieńczenie x objętość dodanego rozcieńczonego wirusa).
  2. Zautomatyzowany proces zliczania ognisk (format 96-dołkowy)
    1. Zeskanuj 96-dołkową płytkę w komercyjnym analizatorze oprogramowania.
      1. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie (patrz Spis materiałów), aby otworzyć.
      2. Kliknij Przełącz pakiety i upewnij się, że pakiet jest przełączony na dowolny, który ma zastosowanie (Rysunek uzupełniający 1A). Kliknij przycisk OK.
      3. Rozpocznij skanowanie, klikając przycisk Skanuj > Skanowanie pełnej płyty (Rysunek uzupełniający 1B).
      4. Kliknij Dashboard (Pulpit nawigacyjny), aby upewnić się, że format przechwytywania to format 96-dołkowy (rysunek uzupełniający 2A).
      5. Wybierz tryb centrowania jako "Automatyczne wyrównanie wstępne zweryfikowane przez użytkownika" (Rysunek uzupełniający 2B).
      6. Kliknij Wysuń, aby załadować płytę.
        UWAGA: Otwórz pokrywę talerza i umieść ją do góry tak, aby rząd A znajdował się u góry (Rysunek uzupełniający 3A).
      7. Wprowadź nazwę tablicy rejestracyjnej i kliknij OK. Kliknij Załaduj, aby załadować płytę.
      8. Kliknij Start, aby rozpocząć skanowanie. Następnie skalibruj pozycje dla A1, A12 i H1 za pomocą przycisków "Góra, Dół, Lewo, Prawo" i kliknij Potwierdź (Rysunek uzupełniający 3B).
        UWAGA: Oprogramowanie rozpocznie skanowanie każdej studni.
      9. Po zakończeniu skanowania pojawi się obraz poglądowy. Kliknij Zamknij.
      10. Wyjdź ze skanowania, klikając Powrót do centrali.
    2. Policz 96-dołkową płytkę za pomocą oprogramowania.
      1. Kliknij opcję Count (Liczba> Smart Count (Inteligentne liczenie).
      2. W oprogramowaniu pokaże się "Krok 1 z 5: Wybierz płytki do policzenia". Kliknij Load plate(s) (Płyty obciążeniowe). Zaznacz cały folder i kliknij Wybierz, aby zaimportować zeskanowaną płytę (Rysunek uzupełniający 4A).
      3. W oprogramowaniu pokaże się "Krok 2 z 5: Zdefiniuj parametry zliczania". Kliknij Dostosuj parametry, a parametry zostaną wyświetlone (proces dyfuzji; mały/normalny/duży/największy/największy +1; separacja punktowa; zliczony obszar; równowaga tła; usuwanie włókien; bramkowanie).
        UWAGA: Zacznij od jednego dołka i sprawdzaj tam iz powrotem, aby znaleźć najlepsze ustawienia dla wszystkich dołków.
      4. Po zakończeniu kliknij Dalej (Rysunek uzupełniający 4B).
      5. W oprogramowaniu pokaże się "Krok 3 z 5: Wybierz/odznacz studnie". Po zakończeniu wyboru studni do policzenia kliknij Dalej, aby kontynuować.
        UWAGA: Studzienki wybrane do zliczenia pojawią się z literą "C" w prawym górnym rogu każdej studni (rysunek uzupełniający 5A).
      6. W oprogramowaniu pokaże się "Krok 4 z 5: Ustawienia wyjściowe". Kliknij Wyświetl/Modyfikuj ustawienia wyjściowe, aby sprawdzić, czy ustawienia (takie jak format obrazu) są odpowiednie. Kliknij Zapisz i wyjdź > Dalej (Rysunek uzupełniający 5B).
      7. W oprogramowaniu pokaże się "Krok 5 z 5: Rozpocznij automatyczne liczenie". Kliknij przycisk Rozpocznij automatyczne liczenie (rysunek uzupełniający 6A).
      8. Po zakończeniu kliknij Wyjdź z automatycznego liczenia.
  3. Przeprowadzanie kontroli jakości (QC) w komercyjnym analizatorze oprogramowania.
    1. Na stronie panelu sterowania kliknij Kontrola jakości > Dodaj tabliczkę(i). Zaznacz cały folder, aby zaimportować zliczoną płytę, kliknij Wybierz > rozpocznij kontrolę jakości (rysunek uzupełniający 6B).
    2. Kliknij dwukrotnie każdą studzienkę, aby sprawdzić miejsca. Kliknij Liczba, aby usunąć wszystkie plamy. Oprogramowanie zacznie liczyć.
      UWAGA: Upewnij się, że opcja "Plamy: Usuń" jest zaznaczona. Zakończenie liczenia może być wskazywane przez zliczoną liczbę ognisk, na przykład "30" (Rysunek Uzupełniający 7A).
    3. Po zakończeniu liczenia (wskazywanym przez zliczoną liczbę ognisk, na przykład "30"), kliknij "Tak", aby usunąć plamy (rysunek uzupełniający 7B). Trzykrotnie kliknij lewym przyciskiem myszy miejsce, które chcesz usunąć. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć, a następnie kliknij Tak.
    4. Kliknij Finish Plate (Płyta zakończenia) i przejdź do przeglądu projektu po zakończeniu kontroli jakości.
  4. Wykonaj obrazowanie za pomocą analizatora oprogramowania.
    1. Sprawdź zeskanowany, zliczony i kontrolowany obraz płytki (Rysunek 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ZIKV można określić ilościowo za pomocą FFA, jak to opisano schematycznie w Rysunek 3. W przypadku płytki 24-dołkowej zakażone komórki Vero utrwalono po 48 godzinach, 60 godzinach, 72 godzinach, 84 godzinach i 96 godzinach od zakażenia. Wyniki wykazały, że komórki pozostały nienaruszone (nie zaobserwowano oderwania komórek) po 96 godzinach (4 dni) po zakażeniu (Rysunek 4 i Rysunek uzupełniający 8A-E). Pojawienie się ognisk wirusa po raz pierwszy zaobserwo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka testów w celu określenia miana wirusa; PFA ma podobny protokół oznaczania ilościowego wirusa jak FFA, w którym inokulum wirusa jest rozcieńczane, aby umożliwić rozróżnienie poszczególnych blaszek lub ognisk. Po barwieniu, każda płytka lub ognisko wskazuje na pojedynczą zakaźną cząstkę w inokulum19. PFA jest barwiony fioletem krystalicznym w celu uwidocznienia tworzenia się płytki nazębnej spowodowanej lizą lub śmiercią komórki. W związku z tym PFA jest bardziej czasochłonny, poniewa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie otrzymało wsparcie od Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego Malezji w ramach Programu Grantów Długoterminowych na Badania (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) oraz dofinansowania dla programu Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). Rysunek 3 w tym badaniu, który pokazuje przebieg barwienia w teście tworzenia ognisk, został zaadaptowany z "DAB Immunohistochemistry" przez BioRender.com (2022). Pobrane z https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy z polieterosulfonuSartoriusS6534-FMOSK
1,5 ml probówka do mikrowirówekNest615601
10 ml sterylna pipeta serologicznaLabserv14955156
1x Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (dPBS)Gibco14190-136
2,0 ml Rurka z nakrętką AxygenSCT-200-SS-C-S
płytkaCorning3526
25 mL Sterylne pipety serologiczneLabserv14955157
Podłoże peroksydazy 3,3'diaminobenzydyny (DAB)Thermo Scientific34065
37 ° Inkubator C z 5% CO2SanyoMCO-18AIC
5 mL sterylna pipeta serologicznaLabserv14955155
50 mL probówka wirówkowaFalconLAB352070
75 cm2 kolba do hodowli tkankowych Corning430725U
96-dołkowa płytkaFalcon353072
Przeciwciało monoklonalne przeciw flawiwirusowi, 4G2 (klon D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
Autoklawizowana 20x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)N/AN/A22,8 g 8 mM Na2HPO4, 4,0 g 1,5 mM KH2PO4, 160 g 0,14 M NaCl, 4,0 g 2,7 mM KCl, 1 l MilliQ H2O
Komora bezpieczeństwa biologicznego, klasa IIHoltenHB2448
CTL S6 Uniwersalny analizator ELISpot/FluoroSpotImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12Komercyjny analizator oprogramowania
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-017
Bydło płodowe surowica (FBS)BovogenSFBS Kozie przeciwciało
anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP)MiliporeSigma12-349
HemacytometrLaboroptik LTDNeubauer ulepszony
detergent IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896Oktylofenoksy poli(etylenoksy)etanolIGEPAL 
Mikroskop odwróconyZEISSTELAVAL 31
Laboratoryjny wahaczFINEPCRCR300
L-GlutaminaGibco25030-081
Karboksymetyloceluloza o niskiej lepkości (CMC)Sigma-AldrichC5678
Mikropipeta wielokanałowa (10 - 100 &mikro; L)Eppendorf3125000036
Mikropipeta wielokanałowa (30 - 300 &mikro; L)Eppendorf3125000052
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Penicylina-streptomycynaGibco15140-122
Pipety jednokanałowe (10 - 100 &mikro; L)Eppendorf3123000047
Pipety jednokanałowe (100 - 1000 &mikro; L)Eppendorf3123000063
Pipety jednokanałowe (20 - 200 &mikro; L)Eppendorf3123000055
Odtłuszczone mlekoSunlac Low FatN/APrzygotuj 3% odtłuszczone mleko w 1x PBS do etapu blokowania barwienia
Podchloryn soduCloroxN/ADo dezynfekcji wszelkich wyrzuconych zakaźnych odpadów płynnych z kolb/płytek
Stereomikroskop NikonSMZ1000
Strzykawka jednorazowa, Luer Lock, 10 ml z igłą 21 GTerumo
Komórki nerkowe afrykańskiej zielonej małpy Vero -ECACC 88020401Otrzymane od współpracownika. Jednak ogniwa Vero uzyskane od innych dostawców powinny być w stanie być używane z pewną optymalizacją.
24-dołkowa SS10L21G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929(2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720(2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183(2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314(2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960(2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632(2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880(2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544(2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika VirusVirus QuantificationFocus Forming AssayVero CellsColorimetric QuantificationPeroxidase ImmunostainingSerial DilutionCell FixationAntibody DetectionHigh Throughput Assay

Related Articles