Method Article

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

DOI:

10.3791/64578

⸱

April 7th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus Zika (ZIKV) to wirus przenoszony przez komary należący do rodzaju Flavivirus. Zakażenie wirusem ZIKV wiąże się z wrodzonymi nieprawidłowościami mózgu i potencjalnie zespołem Guillaina-Barrégo u dorosłych. Badania nad ZIKV w celu zrozumienia mechanizmów choroby są ważne dla ułatwienia opracowania szczepionek i leczenia. Metoda ilościowego oznaczania wirusów jest kluczowa i fundamentalna w dziedzinie wirusologii. Test tworzenia ostrości (FFA) to test ilościowy wirusa, który wykrywa antygen wirusowy za pomocą przeciwciał i identyfikuje ogniska infekcji komórek za pomocą techniki barwienia immunologicznego peroksydazy. Obecne badanie opisuje protokół propagacji i kwantyfikacji wirusa przy użyciu formatów zarówno 24-dołkowych, jak i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości). W porównaniu z innymi podobnymi badaniami, protokół ten dodatkowo opisał optymalizację wielkości ognisk, co może służyć jako przewodnik do rozszerzenia zastosowania tego testu dla innych wirusów. Po pierwsze, namnażanie ZIKV odbywa się w komórkach Vero przez 3 dni. Supernatant hodowli zawierający ZIKV jest zbierany i oznaczany ilościowo przy użyciu FFA. Krótko mówiąc, kultura wirusa jest inokulowana na komórkach Vero i inkubowana przez 2-3 dni. Tworzenie ognisk jest następnie określane po zoptymalizowanych procesach barwienia, w tym utrwalaniu komórek, przepuszczalności, blokowaniu, wiązaniu przeciwciał i inkubacji z substratem peroksydazy. Barwione ogniska wirusowe są wizualizowane za pomocą mikroskopu stereoskopowego (ręczne liczenie w formacie 24-dołkowym) lub analizatora programowego (automatyczne liczenie w formacie 96-dołkowym). FFA zapewnia powtarzalne, stosunkowo szybkie wyniki (3-4 dni) i nadaje się do stosowania w przypadku różnych wirusów, w tym wirusów nietworzących płytki nazębnej. Następnie protokół ten jest przydatny do badania infekcji ZIKV i może być wykorzystany do wykrywania innych klinicznie ważnych wirusów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie wirusem Zika (ZIKV) jest nową chorobą wirusową przenoszoną przez komary. Pierwsza izolacja ZIKV miała miejsce w Ugandzie w 1947 roku1,2; Od 1947 do 2007 r. pozostawała zaniedbana, ponieważ objawy kliniczne są najczęściej bezobjawowe i charakteryzują się samoograniczającą się chorobą gorączkową. W 2007 roku epidemia wirusa Zika rozpoczęła się na wyspach Yap3,4, po czym nastąpiły większe epidemie w regionach Pacyfiku (Polinezja Francuska, Wyspa Wielkanocna, Wyspy Cooka i Nowa Kaledonia) od 2013 do 2014 roku5,<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rozprzestrzenianie się wirusa

  1. Przygotowanie komórek
    1. Hoduj komórki Vero w kolbie hodowlanej o średnicy 75cm2 zawierającej 12 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 2 mM L-glutaminą (patrz tabela materiałów). Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. Monitoruj komórki pod mikroskopem; gdy komórki osiągną zbieżność 70%-90%, są gotowe do użycia (Rysunek 1A) .
      UWAGA: Komórki Vero podwajają się mniej więcej co 24 h

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ZIKV można określić ilościowo za pomocą FFA, jak to opisano schematycznie w Rysunek 3. W przypadku płytki 24-dołkowej zakażone komórki Vero utrwalono po 48 godzinach, 60 godzinach, 72 godzinach, 84 godzinach i 96 godzinach od zakażenia. Wyniki wykazały, że komórki pozostały nienaruszone (nie zaobserwowano oderwania komórek) po 96 godzinach (4 dni) po zakażeniu (Rysunek 4 i Rysunek uzupełniający 8A-E). Pojawienie się ognisk wirusa po raz pierwszy zaobserwo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka testów w celu określenia miana wirusa; PFA ma podobny protokół oznaczania ilościowego wirusa jak FFA, w którym inokulum wirusa jest rozcieńczane, aby umożliwić rozróżnienie poszczególnych blaszek lub ognisk. Po barwieniu, każda płytka lub ognisko wskazuje na pojedynczą zakaźną cząstkę w inokulum19. PFA jest barwiony fioletem krystalicznym w celu uwidocznienia tworzenia się płytki nazębnej spowodowanej lizą lub śmiercią komórki. W związku z tym PFA jest bardziej czasochłonny, poniewa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie otrzymało wsparcie od Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego Malezji w ramach Programu Grantów Długoterminowych na Badania (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) oraz dofinansowania dla programu Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). Rysunek 3 w tym badaniu, który pokazuje przebieg barwienia w teście tworzenia ognisk, został zaadaptowany z "DAB Immunohistochemistry" przez BioRender.com (2022). Pobrane z https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy z polieterosulfonuSartoriusS6534-FMOSK
1,5 ml probówka do mikrowirówekNest615601
10 ml sterylna pipeta serologicznaLabserv14955156
1x Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (dPBS)Gibco14190-136
2,0 ml Rurka z nakrętką AxygenSCT-200-SS-C-S
płytkaCorning3526
25 mL Sterylne pipety serologiczneLabserv14955157
Podłoże peroksydazy 3,3'diaminobenzydyny (DAB)Thermo Scientific34065
37 ° Inkubator C z 5% CO2SanyoMCO-18AIC
5 mL sterylna pipeta serologicznaLabserv14955155
50 mL probówka wirówkowaFalconLAB352070
75 cm2 kolba do hodowli tkankowych Corning430725U
96-dołkowa płytkaFalcon353072
Przeciwciało monoklonalne przeciw flawiwirusowi, 4G2 (klon D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
Autoklawizowana 20x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)N/AN/A22,8 g 8 mM Na2HPO4, 4,0 g 1,5 mM KH2PO4, 160 g 0,14 M NaCl, 4,0 g 2,7 mM KCl, 1 l MilliQ H2O
Komora bezpieczeństwa biologicznego, klasa IIHoltenHB2448
CTL S6 Uniwersalny analizator ELISpot/FluoroSpotImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12Komercyjny analizator oprogramowania
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-017
Bydło płodowe surowica (FBS)BovogenSFBS Kozie przeciwciało
anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP)MiliporeSigma12-349
HemacytometrLaboroptik LTDNeubauer ulepszony
detergent IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896Oktylofenoksy poli(etylenoksy)etanolIGEPAL 
Mikroskop odwróconyZEISSTELAVAL 31
Laboratoryjny wahaczFINEPCRCR300
L-GlutaminaGibco25030-081
Karboksymetyloceluloza o niskiej lepkości (CMC)Sigma-AldrichC5678
Mikropipeta wielokanałowa (10 - 100 &mikro; L)Eppendorf3125000036
Mikropipeta wielokanałowa (30 - 300 &mikro; L)Eppendorf3125000052
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Penicylina-streptomycynaGibco15140-122
Pipety jednokanałowe (10 - 100 &mikro; L)Eppendorf3123000047
Pipety jednokanałowe (100 - 1000 &mikro; L)Eppendorf3123000063
Pipety jednokanałowe (20 - 200 &mikro; L)Eppendorf3123000055
Odtłuszczone mlekoSunlac Low FatN/APrzygotuj 3% odtłuszczone mleko w 1x PBS do etapu blokowania barwienia
Podchloryn soduCloroxN/ADo dezynfekcji wszelkich wyrzuconych zakaźnych odpadów płynnych z kolb/płytek
Stereomikroskop NikonSMZ1000
Strzykawka jednorazowa, Luer Lock, 10 ml z igłą 21 GTerumo
Komórki nerkowe afrykańskiej zielonej małpy Vero -ECACC 88020401Otrzymane od współpracownika. Jednak ogniwa Vero uzyskane od innych dostawców powinny być w stanie być używane z pewną optymalizacją.
24-dołkowa SS10L21G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika VirusVirus QuantificationFocus Forming AssayVero CellsColorimetric QuantificationPeroxidase ImmunostainingSerial DilutionCell FixationAntibody DetectionHigh Throughput Assay

Related Articles