Artykuł metodologiczny

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64579

⸱

3 listopada 2023

 ,  , 
1Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Streszczenie

Trójwymiarowa (3D) organizacja chromosomów jest głównym czynnikiem regulacji genomu i specyfikacji typu komórki. Na przykład uważa się, że elementy cis-regulatorowe, znane jako wzmacniacze, regulują aktywność dystalnych promotorów poprzez interakcję w przestrzeni 3D. Technologie wychwytywania konformacji chromosomów w całym genomie (3C), takie jak Hi-C, zmieniły nasze rozumienie organizacji genomów w komórkach. Obecne zrozumienie organizacji genomu 3D jest ograniczone rozdzielczością, z jaką można rozwiązać topologiczną organizację chromosomów w przestrzeni 3D. Micro-C-XL mierzy fałdowanie chromosomów z rozdzielczością na poziomie nukleosomu, podstawowej jednostki chromatyny, wykorzystując nukleazę mikrokokową (MNazę) do fragmentacji genomów podczas protokołu wychwytywania konformacji chromosomów. Skutkuje to lepszym stosunkiem sygnału do szumu w pomiarach, ułatwiając w ten sposób lepsze wykrywanie miejsc izolacji i pętli chromosomowych w porównaniu z innymi technologiami 3D obejmującymi cały genom. W artykule przedstawiono wizualnie, szczegółowy protokół krok po kroku do przygotowania wysokiej jakości próbek Micro-C-XL z komórek ssaków.

Wprowadzenie

Micro-C-XL to technika pomiaru konformacji genomu 3D z rozdzielczością nukleosomów. Micro-C-XL opiera się na szeroko stosowanej technologii Hi-C opartej na ligacji zbliżeniowej, która zmieniła nasze rozumienie organizacji genomów 3D1. Micro-C-XL i jego pierwsza wersja, Micro-C, zostały początkowo opracowane w Saccharomyces cerevisiae2,3, a następnie dostosowane do systemów komórkowych ssaków, dla których protokół wykazał swój pełny potencjał w wykrywaniu cech krótkiego zasięgu genomu 3D, takich jak pętle chromosomów i miejsca izolacji. Ta wersja jest oparta na najnowszych publikacjach Micro-C-XL dotyczących ssaków4,5. Ponieważ Micro-C-XL zastępuje Micro-C, Micro-C-XL jest odtąd określany w manuskrypcie jako Micro-C.

Główne różnice między Micro-C i Hi-C6 są następujące: 1) fragmentacja genomu za pomocą nukleazy mikrokokowej (MNazy) w porównaniu z enzymami restrykcyjnymi i 2) dodatkowe środki sieciujące z większymi odstępami atomowymi między grupami reaktywnymi w porównaniu tylko z formaldehydem. Oba etapy w znacznym stopniu przyczyniają się do poprawy stosunku sygnału do szumu Micro-C w porównaniu z konwencjonalnym Hi-C. Rozmiar fragmentacji ogranicza rozdzielczość, do której organizacja genomu 3D może zostać rozwiązana podczas protokołu ligacji zbliżeniowej. MNaza to nukleaza, która preferencyjnie trawi dostępne DNA i pozostawia nienaruszone DNA chronione nukleosomami. Ślad nukleosomów za pomocą sekwencjonowania MNazy wykazał, że nukleosomy w pełni pokrywają większość genomów eukariotycznych7. Ponieważ nukleosomy są rozmieszczone w całym genomie ze średnimi odstępami 160-220 pz, w zależności od gatunku i typu komórki, MNaza jest idealnym enzymem do mapowania architektury genomu w wysokiej rozdzielczości.

Użycie dodatkowego środka sieciującego w połączeniu z formaldehydem (FA) w metodzie Micro-C dodatkowo poprawia stosunek sygnału do szumu2,8. Specyficzne dla amin środki sieciujące z dłuższymi odstępami atomowymi między grupami reaktywnymi ułatwiają wiązanie białko-białko. Są to zazwyczaj glutaran disuccinimidylu (DSG) lub bursztynian bis-sukcynimidylowy glikolu etylenowego (EGS) o odstępach odpowiednio 7,7 A i 16,1 A. Redukcja szumu za pomocą EGS lub DSG jest szczególnie widoczna w eksperymentach o wysokim współczynniku fragmentacji, takich jak Micro-C, i przypuszczalnie występuje z powodu zmniejszenia częstości losowych zdarzeń ligacji8.

Niedawno opracowany protokół Hi-C 3.0, który wykorzystuje sieciowanie ESG/DSG i wiele kombinacji enzymów restrykcyjnych, redukuje szum w eksperymentach Hi-C i znacznie poprawia wykrywanie pętli chromosomowych i miejsc izolacji8,9. Mimo to, porównanie różnych cech danych o interakcjach w poszczególnych lokalizacjach wykazało, że Micro-C miał lepsze wykrywanie cech krótkiego zasięgu, takich jak pętle chromosomowe i miejsca izolacji, w porównaniu zarówno z Hi-C 3.0, jak i konwencjonalnym Hi-C8. Jednak Hi-C 3.0 poprawia wykrywanie cech krótkiego zasięgu i utrzymuje silną detekcję przedziałów genomu w porównaniu z konwencjonalnym Hi-C. Podsumowując, wybór metody wychwytywania konformacji chromosomów powinien być podyktowany kwestią obiektywną i biologiczną.

Tutaj udostępniamy krok po kroku protokół dla udanych eksperymentów Micro-C, które mogą rozwikłać organizację genomu 3D.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i sieciowanie

  1. Hodowla komórek zgodnie z doświadczeniem musi uzyskać minimum 1 x 107 komórek. Tutaj komórki hodowano w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w pożywce E14 (DMEM z pirogronianem i L-glutaminą, 15% FBS, 1x LIF, 1x NEAA, 1% paciorkowcem piórowym, 0,1 mM β-merkaptoetanolem [patrz tabela materiałów]) i pasażowano co drugi dzień.
    UWAGA: Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do różnych typów komórek z wielu gatunków, takich jak Homo sapiens i Mus musculus. W tym przykładzie wykorzystano mysie embrionalne komórki macierzyste (ES).
  2. Zbierz komórki przy zbieganiu 70%-80%, zasysając pożywkę. Umyć raz 5 ml DPBS i inkubować komórki z 3 ml podgrzanej 0,25% trypsyny na 10 cm naczynie przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C.
  3. Ugasić trypsynę 7 ml wstępnie podgrzanej pożywki E14 i przenieść oderwane komórki do probówki o pojemności 50 ml.
  4. Granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce. Policz komórki za pomocą licznika komórek.
    UWAGA Protokół jest odporny na pewne zmiany w stężeniach komórek, a do ilościowego określenia liczby komórek użyto różnych liczników komórek; Należy jednak pamiętać o zakresie dynamicznym używanego licznika komórek. Zwykle jest to między 1 x 105-1 x 107 komórek/ml. Chociaż szybkość i czas trwania wirowania zostały przetestowane dla tego typu komórek, inne, mniejsze komórki mogą wymagać większej prędkości wirowania lub dłuższego czasu wirowania, a wirowanie należy odpowiednio dostosować.
  5. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić komórki w DPBS w końcowym stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 107 komórek, ponownie zawieś komórki w 10 ml DPBS.
  6. W pierwszym etapie sieciowania dodaj 37% formaldehydu (FA) do końcowego stężenia 1% do zawiesiny komórek i inkubuj zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej z rotacją (15-20 obr./min); na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 107 komórek, dodaj 270 μl FA do 10 ml zawiesiny komórek.
    UWAGA: Roztwór FA jest zwykle stabilny w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy po otwarciu.
  7. Ugasić reakcję, dodając 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 0,25 M i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z rotacją (15-20 obr./min). Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 107 komórek, dodaj 1,027 ml 2,5 M glicyny do zawiesiny komórek.
  8. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml DPBS. Powtórz etap wirowania raz i ponownie zawieś granulowane komórki w DPBS do 4 x 106 komórek/ml. Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 107 komórek, ponownie zawieś komórki w 2,5 ml DPBS.
  9. Do drugiego etapu sieciowania należy przygotować 0,3 M roztwór podstawowy bursztynianu bis-sukcynimidylu glikolu etylenowego (EGS) w DMSO (13,6 mg EGS w 100 μl DMSO). Dodać EGS w końcowym stężeniu 3 mM do zawiesiny komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut z rotacją (15-20 obr./min). Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 107 komórek, dodaj 25 μl 0,3 M roztworu podstawowego EGS do 2,5 ml zawiesiny komórek.
    UWAGA: Równoważyć EGS z RT przez co najmniej 20 minut przed ważeniem w celu przygotowania roztworu podstawowego.
  10. Ugasić reakcję, dodając 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 0,4 M i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z rotacją (15-20 obr./min). Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 107 komórek, dodaj 400 μl 2,5 M glicyny do zawiesiny komórek.
  11. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić granulowane komórki w DPBS do 5 x 106 komórek/ml. Rozprowadzać 5 x 106 komórek/probówkę dla bibliotek preparatywnych i 1 x 106 komórek/probówkę do miareczkowania do trawienia MNazy.
    UWAGA: Sugeruje się miareczkowanie optymalnego stopnia trawienia dla każdej partii usieciowanych komórek. Najlepiej zebrać dwie do trzech porcji po 1 x 106 komórek do eksperymentów miareczkowania MNazy (krok 2) i od dwóch do czterech podwielokrotności po 5 x 106 komórek do eksperymentów preparatywnych (krok 3).
  12. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Zamroź granulki komórek w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Udane biblioteki Micro-C można przygotować z próbek przechowywanych przez okres do 3 miesięcy.

2. Miareczkowanie MNazy

UWAGA: Przeprowadzenie miareczkowania MNazy jest konieczne do określenia optymalnego stężenia MNazy przed przetworzeniem biblioteki preparatywnej komórek podwójnie usieciowanych.

  1. Aby przeprowadzić miareczkowanie MNazy, rozmrozić jedną osadkę 1 x 106 komórek na lodzie przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w 500 μl DPBS (dodać 1x BSA, jeśli komórki przyklejają się do ścianki). Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 20 minut.
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 500 μL buforu MB#1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,2% NP-40, 1x inhibitor proteazy [patrz tabela materiałów], pH 7,4).
  3. Zebrać komórki przez odwirowanie w sile 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu MB#1 i podzielić próbkę na cztery probówki.
  4. Rozmrozić jedną fiolkę MNazy (20 U/μL) i rozcieńczyć 10 mM Tris, pH 7,4, w serii 1:2, 1:4, 1:4 i 1:4, aby osiągnąć stężenia odpowiednio 10 U/μL, 2,5 U/μL, 0,625 U/μL i 0,1256 U/μL (po jednym dla każdego warunku trawienia). W odpowiednich odstępach czasu (10-20 s) dodać 1 μl roztworu MNazy do jednej z czterech próbek, odwirować i inkubować na termomikserze w temperaturze 37 °C przez 10 minut (wytrząsanie 800 obr./min). Kontynuuj dodawanie 1 μl z pozostałych rozcieńczeń MNazy do pozostałych porcji komórek.
  5. Zatrzymaj trawienie Mnase, dodając 200 μl świeżo przygotowanego buforu STOP (150 μl 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μL 10 % SDS, 25 μL 20 mg/ml proteinazy K, 2 μL 0,5 M EGTA) do każdej probówki w tej samej kolejności i w tym samym odstępie czasu, w którym dodano MNazę. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
  6. Dodać 500 μl alkoholu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego (PCI) do każdej próbki i dokładnie wymieszać przez wirowanie. Wirować przy 19 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia faz i przeniesienia fazy wodnej do nowych probówek (około 200 μl/próbkę).
    UWAGA: PCI zawiera wiele toksycznych składników i powinien być obsługiwany wyłącznie w kapturze bezpieczeństwa chemicznego. Aby uzyskać więcej informacji, skontaktuj się z producentem.
  7. Oczyścić DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i eluować próbki w 12 μl buforu elucyjnego.
    UWAGA: Stężenie SDS z etapu deproteinizacji (krok 2.5) jest hamujące dla niektórych zestawów do oczyszczania DNA. Zastosowany tutaj zestaw do oczyszczania DNA działa porównywalnie do wytrącania etanolu.
  8. Dodać 2-5 μl barwnika ładującego i uruchomić próbki na 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 120 V przez 30-50 minut (aż do prawidłowego rozdzielenia; Rysunek 1A).
  9. Wybierz najlepszy stopień trawienia dla eksperymentu i kontynuuj preparatywne trawienie MNazy. Optymalny stopień trawienia wykazuje niewielką lub żadną ilość fragmentów subnukleosomalnych i stosunek mono- do dinukleosomów wynosi 70%-90%.
    UWAGA: W tym eksperymencie stopień trawienia Lane 4 w Rysunek 1A został określony jako optymalne trawienie uzyskane przy użyciu 0,625-1,25 U Mnase dla 2,5 x 105 komórek (= 2,5-5 U Mnase dla 1 x 106 komórek). Aby zapoznać się ze szczegółową dyskusją, zobacz reprezentatywne wyniki.

3. Preparatywne trawienie MNazy

  1. Aby rozdrobnić chromatynę na mononukleosomy poprzez trawienie MNazy, należy rozmrozić wcześniej podwójnie usieciowane podwielokrotności5 x 10 6 komórek i ponownie zawiesić w 1 ml DPBS. Inkubować na lodzie przez 20 minut (dodać 1x BSA, jeśli komórki przyklejają się do ścianki probówki).
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 500 μL buforu MB#1. Powtórz krok wirowania jeden raz. Ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu MB#1 i zrobić 200 μl porcji (1 x 106 komórek na podwielokrotność).
  3. Na podstawie miareczkowania MNazy (opisanego w kroku 2) trawić chromatynę, dodając odpowiednią ilość MNazy (zwykle 2,5-10 U/μL na 1 x 106 komórek) do każdej podwielokrotności. Dobrze wymieszać (szybko odwirować i odwirować) i inkubować na termomikserze w temperaturze 37 °C przez 10 minut z wytrząsaniem 800 obr./min.
  4. Zatrzymać wytrawianie MNazy, dodając 1,6 μl 0,5 M EGTA (ostatnie 4 mM) do każdej podwielokrotności i inkubować na termomieszaczu w temperaturze 65 °C przez 10 minut z wytrząsaniem 800 obr./min.
  5. Pobrać próbkę przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 500 μL 1x NEBuffer 2.1.
  6. Próbki zbiorcze odpowiadające wkładowi 5 x 106 komórek lub mniej do dalszego przetwarzania.
    UWAGA: Jeśli ma być przetworzonych więcej niż 5 x 106 komórek, przetwarzaj te próbki równolegle, ponieważ warunki enzymatyczne są zoptymalizowane dla komórek 5 x 106.
  7. Przed przystąpieniem do etapów ligacji zbliżeniowej należy przenieść 10% próbki jako kontrolę wejściową w celu kontroli poziomu trawienia MNazy. Dodać 150 μl 10 mM Tris o pH 7,4, 25 μl 10% SDS i 25 μl 20 mg/ml proteinazy K do tej próbki i inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.

4. Przetwarzanie końcówek DNA i ligacja zbliżeniowa

  1. Pozostałą próbkę zebrać przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany osad. Zawiesić osad w 90 μl świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix 1 (tabela 1) i inkubować na termomikserze przez 15 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 800 obr./min.
  2. Dodać 10 μl 5 μl fragmentu Klenowa i inkubować na termomikserze przez 15 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 800 obr./min.
  3. Dodać 100 μl świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix 2 (tabela 2) i inkubować w termomikserze przez 45 minut w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem 800 obr./min. Po inkubacji wygasić reakcję enzymatyczną, dodając EDTA do końcowego stężenia 30 mM. Inkubować na termomikserze przez 20 minut w temperaturze 65 °C z wytrząsaniem 800 obr./min.
  4. Pobrać próbkę przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić próbkę w 500 μl świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix 3 (tabela 3) i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej z rotacją (15–20 obr./min).
  5. Pobrać próbkę przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić próbkę w 200 μl świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix 4 (tabela 4) i inkubować w termomieszalniku przez 15 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 800 obr./min.
  6. W celu odwrotnego sieciowania i deproteinizacji dodać do próbki 25 μl 20 mg/ml proteinazy K i 25 μl 10% SDS i inkubować w temperaturze 65 °C przez noc z przerywanym mieszaniem.

5. Oczyszczanie DNA dinukleosomalnego i wybór wielkości

  1. Dodać 500 μl PCI do próbek i kontroli wejściowej, a następnie wymieszać przez wirowanie. Rozdzielić fazy przez odwirowanie przy 19 800 x g przez 5 minut i przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki.
  2. Zagęścić DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA lub przez wytrącanie etanolu. Eluować próbki w 30 μl (krok 5.3) i kontrole wejściowe (krok 3.11) w 15 μl i uruchomić 1,5% żel agarozowy w celu oddzielenia mononukleosomów i dinukleosomów (Rysunek 1B).
    UWAGA: Stężenie SDS z etapu deproteinizacji jest hamujące dla niektórych zestawów do oczyszczania DNA. Zastosowany tutaj zestaw do oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów) działa porównywalnie do wytrącania etanolu. W zależności od liczby użytych ogniw, wejście może wynosić od 100 ng do 10 μg. Zazwyczaj 1-5 μg DNA ekstrahuje się z 5 x 106 komórek.
  3. Wyciąć fragmenty DNA, które mają rozmiar dinukleosomalny (około 300 pz). Użyj dostępnego w handlu zestawu do elucji żelu DNA (patrz tabela materiałów), aby wyekstrahować DNA z żelu agarozowego i eluować w 150 μl.

6. Przygotowanie koralików streptawidyny

  1. Przenieść 10 μl kulek streptawidyny (patrz tabela materiałów) na próbkę do probówki reakcyjnej.
  2. Umieść go w odpowiednim magnesie do probówek o pojemności 1.5 ml (patrz Tabela materiałów). Po klarowaniu roztworu (1-2 min) usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 300 μl 1x TBW (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween 20) na próbkę. Powtórz ten krok raz.
  3. Ponownie zawiesić kulki w 150 μl 2x buforu czarno-białego (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) na próbkę przetworzoną w kroku 7.

7. Rozwijanie streptawidyny i przygotowanie biblioteki na koralikach

  1. Dodać 150 μl wstępnie przygotowanych kulek (etap 6.3) do 150 μl próbki (etap 5.3). Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z rotacją (15-20 obr./min).
  2. Umieść probówki w odpowiednim magnesie i poczekaj, aż roztwór się klaruje (1-2 min). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 300 μl 1x TBW. Powtórz ten krok.
  3. Umieść probówki w odpowiednim magnesie i poczekaj, aż roztwór się klaruje (1-2 min). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 100 μl 0,1x TE (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).
  4. Umieść probówki w odpowiednim magnesie i poczekaj, aż roztwór się klaruje (1-2 min). Usunąć supernatant, ponownie zawiesić kulki w 50 μl 0,1x TE i przenieść je do probówek PCR.
    UWAGA: Objętość użytego 0,1x TE (50 μL) odpowiada objętości wejściowej zestawu do przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA (patrz Tabela materiałów) użytego w tym protokole. Jeśli używany jest inny zestaw lub strategia, odpowiednio dostosuj głośność.
  5. Wykonaj kroki manipulacji DNA w zestawie przygotowawczym biblioteki sekwencjonowania zgodnie z protokołem producenta. Etapy te zazwyczaj obejmują stępienie DNA, ogon A, ligację adaptora i wycięcie U. Ostatni krok (wycięcie litery U) jest specyficzny dla zestawu użytego w tym badaniu. Jeśli używasz tego zestawu, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta od kroku 1 do kroku 2.6 w protokole zestawu przy użyciu nierozcieńczonych adapterów i nie rozważaj przechowywania w temperaturze −20 °C po kroku 2.6.
    UWAGA: Zmiany buforu wymagane przez zestawy sekwencjonowania muszą być wymieniane przez wiązanie kulek z magnesem i płukaniem (kroki 7.3 do 7.4), ponieważ DNA jest nadal związane z kulkami streptawidyny. Dodatkowo, ponieważ DNA jest związane z kulkami magnetycznymi, zignoruj wszelkie kroki oczyszczania i wyboru rozmiaru po ligacji adaptera z protokołu zestawu. Przejdź do kroku 7.6 (ten protokół).
  6. Po zakończeniu podwiązywania adaptera umyj próbkę zgodnie z opisem w kroku 7.2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kulki w 20 μl 0,1x TE.

8. Oszacowanie wymaganych cykli PCR

UWAGA: Zalecane jest oszacowanie wymaganych cykli PCR dla wzmocnienia biblioteki. Zazwyczaj biblioteka Micro-C wymaga 8-15 cykli PCR. Chociaż krok ten nie jest niezbędny, pomaga uniknąć nadmiernej amplifikacji i zmniejsza ryzyko duplikatów PCR.

  1. Aby określić minimalną wymaganą liczbę cykli PCR, należy przeprowadzić PCR z 1 μl próbki DNA streptawidyny-biotyny (krok 7.6). W tym celu dodaj do próbki główną mieszankę PCR (3,2 μlH2O, 0,4 μl startera i5, 0,4 μl startera i7 i 5 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności Q5) do próbki. Wykonaj PCR z 16 cyklami zgodnie z instrukcjami producenta dla używanego zestawu do przygotowania biblioteki DNA.
    UWAGA: Użyte tutaj podkłady są kupowane w osobnym zestawie (patrz Spis materiałów), który musi być kompatybilny z używanym zestawem do przygotowania biblioteki.
  2. Po PCR zebrać kulki za pomocą odpowiedniego magnesu i zmierzyć stężenie DNA w 1 μl supernatantu za pomocą przyrządu do oznaczania ilościowego DNA o wysokiej czułości (patrz tabela materiałów). Aby uzyskać całkowite stężenie DNA, pomnóż tę wartość przez 10 (całkowita objętość reakcji PCR). Oszacuj wymaganą liczbę cykli PCR, jak omówiono w reprezentatywnych wynikach.
  3. Dodać 2 μl 6x buforu ładującego do pozostałych 9 μl mieszaniny PCR. Rozwiąż bibliotekę amplifikowaną PCR na 1% żelu agarozowym, aby określić udane podwiązanie adaptora, co daje rozmiar około 450 pz ( Rysunek 1C).
    UWAGA: Żel powinien wykazywać wyraźne pasmo około 420 pz (biblioteka Micro-C plus adaptery). Pasma 120 pz reprezentują dimery adapterów i wskazują na biblioteki o niskiej złożoności. Mogą pojawić się prążki o mniejszej masie cząsteczkowej (poniżej 100 pz), a są to niewykorzystane startery z reakcji PCR.

9. Wzmocnienie biblioteki sekwencjonowania

  1. Dodać główną mieszaninę PCR (65 μlH2O, 100 μl polimerazy Q5 o wysokiej wierności, 8 μl startera i5, 8 μl startera i7) do pozostałych 19 μl próbki streptawidyny-biotyny-DNA. Mieszaninę reakcyjną podzielić na 50-100 μl podwielokrotności.
    UWAGA: Optymalna objętość dla PCR zależy od maszyny do PCR; zazwyczaj 50 μl oferuje najbardziej powtarzalną amplifikację w popularnych maszynach do PCR.
  2. Wykonaj PCR zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do przygotowania biblioteki DNA z liczbą cykli określoną w kroku 8. Jeśli krok 8 został pominięty, do PCR zaleca się 14 cykli.
  3. Oczyść DNA za pomocą kulek paramagnetycznych (patrz Tabela materiałów) w stosunku 1:0,9 zgodnie z protokołem producenta. Eluować w 20 μl 0,1% TE.
    UWAGA: Jeśli dimery adaptera zostaną wykryte w kroku 8.5, przeprowadź oczyszczanie dwukrotnie przy użyciu tego samego stosunku.
  4. Określić stężenie DNA i poddać próbki systemowi kontroli jakości (patrz tabela materiałów). Zapewnij dobrą jakość biblioteki Micro-C poprzez obecność pojedynczego precyzyjnego pasma (Rysunek 1D).
    UWAGA: Dimery adapterów są rzadkie w preparatach bibliotecznych na koralikach ze względu na mycie próbki przed PCR. Tak więc pojawienie się dimerów adapterowych wskazuje na niską złożoność biblioteki. W przypadku zaobserwowania dimerów adapterowych zdecydowanie zaleca się kontrolę jakości próbki przy niskim sekwencjonowaniu wejściowym.

10. Sekwencjonowanie DNA i przetwarzanie danych

  1. Sekwencjonuj bibliotekę Micro-C z sekwencjonowaniem sparowanych końców zgodnie z wymaganiami dostawcy sekwencjonowania.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby próbki były sekwencjonowane na platformie w trybie sparowanego końca z 50 bp na odczyt. Starsze platformy, które oferują krótsze długości odczytu, takie jak 2 x 35 bp, również zostały z powodzeniem wykorzystane. Co ważne, jeśli badane są powtarzalne regiony genomu, może być wskazane sekwencjonowanie o dłuższej długości odczytu.
  2. Aby ocenić jakość biblioteki Micro-C, należy wykonać sekwencjonowanie przy niskich danych wejściowych z 5 x 106 do 1 x 107 odczytów na próbkę.
  3. Przetwarzaj pliki sekwencjonowania (pliki fastq) za pomocą Distiller10. Odwzoruj odczyty względem odpowiedniego genomu referencyjnego, tutaj mm10.
    UWAGA: Pliki sekwencjonowania mogą być przetwarzane przy użyciu różnych potoków na komputerach lokalnych lub klastrach obliczeniowych. W przypadku próbek o małej głębokości sekwencjonowania większe rozmiary pojemników, takie jak 10 000 bp, 50 000 bp, 100 000 bp i 500 000 bp, mogą zmniejszyć zapotrzebowanie na moc obliczeniową i rozmiary plików. Distiller (użyty w tym badaniu) generuje wszystkie wymagane typy plików, aby ocenić jakość biblioteki Micro-C. Wygenerowany plik *.stats zawiera informacje o szybkości mapy, współczynnikach cis-trans oraz orientacji odczytu stratyfikowanej przez odległość między odczytywanymi parami. Parametry te są wizualizowane w Rysunek 2, a ocena jakości biblioteki Micro-C jest omówiona w reprezentatywnych wynikach. Oprogramowanie przetwarzające generuje również pliki mcool, które można bezpośrednio załadować do HiGlass (https://docs.higlass.io/) w celu wygenerowania macierzy interakcji9.

Wyniki

Prawidłowe przygotowanie bibliotek Micro-C można ocenić na kilku etapach protokołu. Najważniejszym krokiem jest wybór odpowiedniego stopnia trawienia przez MNase. W związku z tym należy przeprowadzić miareczkowanie stężenia MNase, aby w każdej próbce konsekwentnie uzyskiwać 70%-90% mono-nukleosomów w stosunku do di-nukleosomów. Należy zauważyć, że trawienie chromatyny przebiega inaczej w przypadku euchromatyny i heterochromatyny, przy czym MNase trawi heterochromatynę mniej efektywnie. Zatem optymalny stopień trawienia zależy od analizowanego regionu chromatyny oraz badanego typu komórek, ponieważ względna proporcja euchromatyny i heterochromatyny jest specyficzna dla danego typu komórek. Dlatego zaleca się staranne miareczkowanie wymaganego stężenia MNase oraz wstępną ocenę sukcesu eksperymentu Micro-C za pomocą sekwencjonowania materiału o niskiej ilości wejściowej (low-input sequencing).

Typowy wzór miareczkowania MNase chromatyny traktowanej malejącymi ilościami MNase przedstawiono na Rysunku 1A. Tutaj chromatyna z 250 000 komórek na reakcję jest trawiona czterokrotnym rozcieńczeniem MNase. Najwyższe stężenie (10 U MNase, ścieżka 2) wykazuje przetrawioną nadmiernie chromatynę, składającą się niemal wyłącznie z DNA mononukleosomalnego (~150 bp). Co istotne, centrum prążka mononukleosomalnego w żelu agarozowym znajduje się niżej w porównaniu z odpowiadającymi mu prążkami w próbkach z mniejszymi stężeniami MNase, co wskazuje na nadmierne trawienie DNA nukleosomalnego. Nadmiernie przetrawione nukleosomy ulegają nieefektywnej ligacji w reakcji ligacji w bliskości; zatem próbka na ścieżce 2 jest suboptymalna dla eksperymentów Micro-C. Ścieżka 3 (2,5 U MNase) wykazuje niemal odpowiedni stopień trawienia dla eksperymentów Micro-C. W tym przypadku prążek mononukleosomalny jest dominującym gatunkiem, a smug podnukleosomalna, świadcząca o nadmiernie przetrawionych nukleosomach, jest zredukowana, choć wciąż obecna. Stopień trawienia na ścieżce 4 (0,635 U MNase) stanowi idealny warunek dla eksperymentu Micro-C w tym przykładzie miareczkowania. Obecny jest wyraźny prążek mononukleosomalny bez DNA podnukleosomalnego. Intensywność prążków dla DNA mononukleosomalnego i dinukleosomalnego jest niemal równa, co wskazuje na wydajność mononukleosomów na poziomie 66% lub wyższym. Warto zauważyć, że DNA dinukleosomalne jest około dwukrotnie większe od DNA mononukleosomalnego (~320 bp vs. ~150 bp), zatem intensywność jego prążka na mol DNA jest dwukrotnie wyższa w porównaniu z jego mononukleosomalnym odpowiednikiem. Stopień trawienia na ścieżce 5 (0,156 U MNase) wykazuje niedostatecznie przetrawioną chromatynę z niemal całkowitym brakiem DNA nukleosomalnego, co czyni tę próbkę suboptymalną.

Podsumowując, w tym przykładzie trawienie 2,5 x 105 mysich komórek ES przy użyciu 0,625 U MNase (co odpowiada 2,5 U MNase na 1 x 106 komórek w 200 µL) stanowi najbardziej obiecujący punkt wyjścia dla trawień preparatywnych w eksperymentach Micro-C. Należy jednak rozważyć również pośrednie stężenie MNase między warunkami zastosowanymi dla próbek w ścieżce 3 i ścieżce 4 (co odpowiada 5 U MNase na 1 x 106 komórek w 200 µL). Co ważne, trawienie chromatyny za pomocą MNase nie może być skalowane liniowo i nie zaleca się zwiększania skali trawienia preparatywnego ponad 4-krotnie. Aby przygotować biblioteki Micro-C z więcej niż 1 x 106 komórek, zaleca się trawienie chromatyny w aliquotach po 1 x 106 komórek i ich łączenie po inaktywacji MNase.

Aby ocenić skuteczność protokołu ligacji bliskościowej, kontrolę wejściową, która została poddana trawieniu MNazą, ale nie ligacji bliskościowej (krok 3.8), należy porównać z próbką poddaną ligacji bliskościowej (krok 5.3) za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu agarozowym (Ryc. 1B). Prążek mono-nukleosomu po ligacji bliskościowej ma wielkość około 300 bp, podobnie jak di-nukleosomy. W związku z tym stosunek sygnału prążka mono- do di-nukleosomowego powinien przesunąć się z przewagi mono-nukleosomów (ścieżka 1) w stronę di-nukleosomów (ścieżka 3 i ścieżka 4). Ponieważ z żelu agarozowego na tym etapie wycina się i oczyszcza DNA di-nukleosomowe, zaleca się rozdzielenie próbek na kilka ścieżek, aby uniknąć ich przeładowania.

Zaleca się ocenę jakości i ilości przygotowanej biblioteki sekwencjonowania za pomocą minimalnej reakcji PCR. W tej procedurze DNA z 1 µL kulek (1/20 całkowitej próbki) jest amplifikowane przez 16 cykli w 10 µL mieszaniny reakcyjnej PCR. Całkowita koncentracja biblioteki z minimalnego PCR zazwyczaj mieści się w zakresie 50-500 ng po 16 cyklach PCR. Teoretycznie odpowiada to bibliotece o masie 1-10 µg z pozostałych 19 µL próbki, gdyby ona również została amplifikowana przez 16 cykli. Zaleca się stosowanie minimalnej liczby cykli PCR niezbędnej do wygenerowania biblioteki o masie około 100 ng z całkowitej ilości DNA. Zakładając logarytmiczną amplifikację w PCR, teoretyczną koncentrację DNA otrzymanego z 19 µL materiału wyjściowego przy 16 cyklach można sukcesywnie dzielić przez dwa, aby obliczyć liczbę cykli PCR wymaganą do wygenerowania biblioteki o masie 100 ng. Na przykład uzyskanie 100 ng z 1 µL po 16 cyklach odpowiada uzyskowi 1 900 ng przy amplifikacji z 19 µL. W tym scenariuszu 12 cykli powinno idealnie wygenerować bibliotekę sekwencjonowania o masie 118 ng z całkowitej ilości DNA (1 900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Pozostałe 9 µL próbki z minimalnego PCR można następnie wykorzystać do oceny jakości biblioteki za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Ryc. 1C). Wizualizacja powinna wykazać jeden wyraźny prążek przy 420 bp oraz brak prążków dla dimerów adapterów (120 bp). Mogą pojawić się również mniejsze fragmenty, które odpowiadają niewykorzystanym starterom PCR.

Następnie, przed przystąpieniem do zasobożernym sekwencjonowania głębokiego, zaleca się analizę i potwierdzenie poprawnego przygotowania próbek Micro-C za pomocą sekwencjonowania z niskim wkładem materiału. Zazwyczaj biblioteki są sekwencjonowane do głębokości odczytu od 5 x 106 do 1 x 107 i oceniane na podstawie następujących kryteriów: wskaźnika duplikacji odczytów sekwencjonowania, stosunku interakcji cis- do trans-chromosomalnych oraz częstotliwości orientacji odczytów sekwencjonowania. Biblioteki Micro-C są przetwarzane za pomocą Distiller, kompletnego potoku analitycznego, który przetwarza dane z plików odczytów sekwencjonowania (format Fastq) na pliki par odczytów (format Bedpe) i skalowalne macierze interakcji (formaty Cool i Mcool), wykorzystując cooler, pairtools oraz cooltools10,11,12. Potok generuje również plik podsumowujący, który jest idealny do oceny jakości bibliotek Micro-C10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). Wskaźnik duplikacji PCR dostarcza informacji o złożoności biblioteki sekwencjonowania i może zostać wyodrębniony z wygenerowanego pliku *.stats. Wysokiej jakości biblioteki Micro-C wygenerowane z 5 milionów lub więcej komórek charakteryzują się wskaźnikiem duplikacji PCR poniżej 5%-10%. Należy zauważyć, że niektóre platformy sekwencjonowania generują duplikaty PCR podczas formowania klastrów, niezależnie od złożoności biblioteki sekwencjonowania. Rycina 2A przedstawia względne wskaźniki duplikacji dla dwóch eksperymentów: jednego, który uznajemy za próbkę dobrą, oraz jednego będącego próbką złą. W tym przykładzie obie próbki wykazały akceptowalne wskaźniki mapowania. Kolejnymi kryteriami oceny jakości bibliotek Micro-C są stosunek cis do trans oraz częstotliwości orientacji odczytów. W obrębie jądra komórkowego chromosomy zajmują oddzielne terytoria chromosomalne i w związku z tym rzadko oddziałują z innymi chromosomami. Wysoki wskaźnik wykrytych interakcji trans-chromosomalnych wskazuje na wysoką częstotliwość losowych ligacji. Należy odnotować, że na tym poziomie analizy zła próbka wykazała wysoki wskaźnik interakcji trans-chromosomalnych w porównaniu z dobrą próbką (Rycina 2B). W przypadku Micro-C pożądanym jest wskaźnik interakcji cis-chromosomalnych na poziomie 70% lub wyższym.

Biblioteka Micro-C zawiera fragmenty o rozmiarze zbliżonym do prążka DNA dinukleosomowego, który może współoczyszczać się z próbką poddaną ligacji zbliżeniowej i zanieczyszczać eksperyment. Zanieczyszczenia te są zawsze oddziaływaniami cis-chromosomalnymi. Dlatego ważne jest również przeprowadzenie oceny częstości orientacji odczytów. Częstość zanieczyszczenia dinukleosomowego można oszacować za pomocą sekwencjonowania niskiego wkładu (low-input sequencing). DNA dinukleosomowe pochodzi z dwóch sąsiadujących nukleosomów, które nie zostały przecięte przez MNase. W związku z tym powstałe odczyty sekwencjonowania zawsze będą wykazywać orientację odczytu forward-reverse (F i R), a odległość między parami odczytów będzie wynosić około 320 bp. Fragmenty poddane ligacji zbliżeniowej mogą w porównaniu do nich być ligowane w czterech orientacjach, dając pary odczytów F-R, R-R, R-F i F-F, idealnie w równym obfitości (Rycyna 2C). Ponadto wykazują one różne odległości między dwiema parami odczytów. Aby oszacować ilość zanieczyszczeń dinukleosomowych, częstość orientacji odczytów można obliczyć z plików *stats generowanych przez program distiller (Rycyna 2D). Co istotne, w niniejszej pracy frakcja odczytów F-R (czerwona) była wyższa w próbce złej w porównaniu z próbką dobrą, co stało się bardziej widoczne po przeprowadzeniu stratyfikacji orientacji odczytów ze względu na odległość (Rycyna 2E). Frakcja F-R jest zdominowana przez fragmenty dinukleosomowe w porównaniu z bibliotekami Micro-C, gdy pary odczytów są stratyfikowane na odczyty o odległościach <562 bp lub ≥562 bp. Tutaj frakcja odczytów o odległości <562 bp jest zdominowana przez odczyty F-R, podczas gdy frakcja o odległościach ≥562 bp wykazuje równomierny rozkład między cztery możliwe orientacje, co wskazuje, że globalna nadreprezentacja odczytów F-R wynika z zanieczyszczeń dinukleosomowych. Wybór 562 bp jako progu dla podziału na podzbiory jest zdefiniowany przez binowanie w wygenerowanym pliku *stats. Choć nie jest to konieczne dla tej kontroli jakości, bardziej precyzyjny podział można osiągnąć poprzez wyodrębnienie odległości z pliku *pairs, który również jest generowany przez program distiller. Należy zauważyć, że odczyty dinukleosomowe nie obniżają jakości próbki Micro-C, ponieważ mogą zostać zidentyfikowane i pominięte podczas przetwarzania danych. Jednak nie zawierają one cennych informacji o oddziaływaniach 3D i rozcieńczają one odczyty informacyjne.

Zatem staranna miareczkowanie MNase oraz rzetelna kontrola jakości z wykorzystaniem sekwencjonowania niskiego wkładu (low-input sequencing) są najlepszymi narzędziami do optymalizacji jakości eksperymentów Micro-C.

Wyniki elektroforezy, biblioteki Micro-C, subnukleosomalne DNA, ligacja i analiza wielkości.
Rycina 1: Etapy pośrednie protokołu Micro-C. (A) Elektroforeza żelowa na agarozie chromatyny z 2,5 x 105 mysich komórek ES trawionych różnymi stężeniami MNase. Prążki mono-, di- i trinukleosomalne są zaznaczone strzałkami. M: drabinka DNA (ścieżka 1/6); 10 U MNase na 250 000 komórek (ścieżka 2); 2,5 U MNase na 250 000 komórek (ścieżka 3); 0,625 U MNase na 250 000 komórek (ścieżka 4); 0,156 U MNase na 250 000 komórek (ścieżka 2). (B) Elektroforeza żelowa na 1,0% agarozie przygotowanych próbek Micro-C (ścieżka 3 i ścieżka 4) oraz kontroli wejściowej trawionej MNase (ścieżka 1). Ścieżka 1 i ścieżka 2 (M: drabinka DNA) zostały wzmocnione, aby podkreślić względną zmianę intensywności fragmentów mononukleosomalnych względem dinukleosomalnych. Prążki mono- i dinukleosomalne są zaznaczone strzałkami. Prążek dinukleosomalny w próbce poddanej ligacji bliskościowej obejmuje DNA dinukleosomalne oraz DNA biblioteki Micro-C. (C) Elektroforeza żelowa na 1,0% agarozie bibliotek sekwencyjnych Micro-C amplifikowanych z 1 µL próbki w celu oceny jakości. Ścieżka 1 (M): drabinka DNA; ścieżka 2 (S): biblioteka Micro-C. (D) Wykres z analizatora fragmentów (Fragment Analyzer) końcowej biblioteki Micro-C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza oddziaływań chromatyny; wykresy słupkowe; odczyty zmapowane/niezmapowane, odczyty cis/trans-chromosomalne.
Rycina 2: Statystyki próbek dla sekwencjonowania niskiego wkładu (low-input sequencing) w przypadku dobrej i złej próbki. (A) Wykres słupkowy procenta odczytów zmapowanych (zielony) i niezmapowanych (czerwony). (B) Znormalizowany ułamek odczytów mapujących oddziaływania cis- i trans-chromosomalne. Zestawy danych zostały znormalizowane do odczytów mapujących w cis. Odczyty mapujące w cis zostały podzielone warstwowo ze względu na odległość między pierwszym a drugim odczytem w próbkach sekwencjonowanych metodą paired-end: ≤1 kbp (żółty), >1 kbp i ≤10 kbp (pomarańczowy) oraz >10 kbp (czerwony). (C) Schemat potencjalnych form molekularnych o rozmiarach di-nukleosomalnych. (D) Procentowe udziały orientacji par odczytów dla wszystkich odczytów z dobrej i złej próbki. (E) Analogicznie jak w panelu (D), ale z podziałem na odległości (lewo, <562 bp i prawo, ≥562 bp). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Komponenty1x4,4x
10x NEBuffer 2.1,10 µL44 µL
2 µL 100 mM ATP2 µL8.8 µL
100 mM DTT5 µL22 µL
H2O68 µL299.2 µL
10 j./µL T4 PNK5 µL22 µL
Suma90 µL396 µL

Tabela 1: Master mix Micro-C 1. Skład master mixu do reakcji trawienia końców.

Komponenty1x4,4x
1 mM biotyny-dATP10 µL44 µL
1 mM Biotyna-dCTP10 µL44 µL
mieszanina dTTP i dGTP o stężeniu 10 mM1 µL4.4 µL
10x bufor do ligazy T4 DNA5 µL22 µL
200x BSA0.25 µL1.1 µL
H2O23.75 µL104.5 µL

Tabela 2: Master mix Micro-C 2. Skład master mixu do reakcji znakowania końcowego.

Składniki1x4,4x
10x NEB T4 Ligase reaction buffer50 µL220 µL
H2O422,5 µL1859 µL
T4 DNA Ligase25 µL110µL

Tabela 3: Micro-C master mix 3. Skład master mixu do reakcji ligacji bliskościowej.

Komponenty1x4,4x
10x NEBuffer 1.120 µL88 µL
H2O180 µL792 µL
nukleaza ExoIII10 µL44 µL

Tabela 4: Master mix Micro-C 4. Skład master mixu do reakcji usuwania biotyny.

Dyskusja

Powodzenie eksperymentu Micro-C zależy od kilku krytycznych kroków w protokole, które muszą być starannie wykonane. Po pierwsze, sieciowanie za pomocą dodatkowego środka sieciującego DSG lub EGS może prowadzić do agregacji komórek, w zależności od typu komórki. Dodanie 0,1%-0,5% BSA do reakcji sieciowania znacznie zmniejsza agregację bez wpływu na wydajność sieciowania. Nieefektywne sieciowanie może skutkować zwiększonymi wskaźnikami interakcji transchromosomalnych, które wskazują na losowe ligacje. Drugim, ale najważniejszym krokiem w tym protokole jest trawienie chromatyny za pomocą MNazy. Nieoptymalne trawienie chromatyny prowadzi do nieefektywnej ligacji zbliżeniowej (nadmierne trawienie) lub zwiększonego tempa dinukleosomów nieligowanych w pobliżu (niedostateczne trawienie). Skuteczność reakcji ligacji można ocenić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (ryc. 1B) i dodatkowo najlepiej oszacować za pomocą sekwencjonowania o niskim nakładzie wejściowym. Jeśli sekwencjonowanie o niskim poziomie wejściowym wykaże albo wysoki współczynnik duplikacji (nieefektywna ligacja), albo zwiększony wskaźnik dinukleosomów, należy ponownie ocenić stopień trawienia MNazy. Warto zauważyć, że utrata próbki podczas wykonywania protokołu może prowadzić do zmniejszenia złożoności biblioteki. Stężenie próbki najlepiej ocenić po oczyszczeniu DNA (etap 5.3) lub za pomocą minimalnej reakcji PCR (etap 8). Całkowita wydajność DNA z komórek 5 x 106 ssaków po oczyszczeniu DNA wynosi zwykle >2 μg. Stężenie DNA powinno być kontrolowane po trawieniu MNazą, trawieniu ExoIII i oczyszczaniu DNA. Endogenne nukleazy, których obfitość jest specyficzna dla typu komórki i gatunku, mogą być źródłem degradacji DNA. Ponadto oczyszczanie DNA na podstawie kolumn może prowadzić do utraty próbki z powodu niezgodności z SDS w reakcjach deproteinacji. Wytrącanie etanolu można rozważyć, jeśli stężenie DNA jest niskie na tym etapie.

Ponieważ Micro-C wymaga miareczkowania MNazy specyficznej dla próbki, zastosowanie Micro-C do populacji małych komórek, takich jak małe narządy z różnych organizmów modelowych, zarodki i pojedyncze komórki, organoidy lub biopsje pacjentów, jest trudne. W tym przypadku Hi-C 3.0 oferuje ugruntowaną alternatywę wykorzystującą reakcję końcową za pomocą endonukleaz restrykcyjnych specyficznychdla sekwencji 8,9.

Micro-C to szeroko stosowana technologia konformacji chromosomów o wysokiej rozdzielczości o wysokim zakresie dynamiki i niskim stosunku sygnału do szumu, co czyni ją szczególnie odpowiednią do badania cech chromosomówkrótkiego zasięgu 4,5,8, takich jak pętle chromosomowe. Rozdzielczość Micro-C pozwala na wychwycenie pętli promotor-wzmacniacz, które wykraczają poza granicę wykrywalności Hi-C, skutecznie umożliwiając bardziej szczegółową analizę związku między organizacją genomu a regulacją 13,14,15. Co więcej, strategie wychwytywania DNA zostały niedawno połączone z Micro-C w celu zwiększenia rozdzielczości specyficznej dla locus docelowych loci genomowych do niespotykanych dotąd poziomów, ujawniając nowe informacje na temat ultrastruktury genomu 3D 16,17,18. Podsumowując, przewidujemy, że Micro-C i jego pochodne będą kluczową technologią do analizy roli genomu 3D w regulacji transkrypcji, a w konsekwencji w różnicowaniu i utrzymaniu typów komórek.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Christl Gaubitz i Kathleen Stewart-Morgan za ich krytyczną lekturę rękopisu. Dziękujemy Anji Groth i laboratorium Groth za ich wsparcie w tworzeniu naszego laboratorium. Dziękujemy za wsparcie pracownikom platformy CPR/reNEW Genomics: H. Wollmannowi, M. Michautom i A. Kalvisie. Centrum Medycyny Komórek Macierzystych Fundacji Novo Nordisk (reNEW) jest wspierane przez grant Fundacji Novo Nordisk o numerze NNF21CC0073729. Centrum Badań nad Białkami (CPR) Fundacji Novo Nordisk jest wspierane przez grant Fundacji Novo Nordisk o numerze NNF14CC0001. Dziękujemy laboratorium Brickman w Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, za mysie komórki ES.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mM Biotyna dATPJenna Bioscience NU-835-Bio14-S
1 mM Biotyna dCTPJenna BioscienceNU-809-BioX-S
10 mM dGTPNEBN0442S
10 mM dTTP NEBN0443S
10 U/ml T4 PNKNEBM0201L
100 U/L Egzonukleaza IIINEBM0206L
10x NEBuffer 1.1NEBB7001S
10x NEBuffer 2.1NEBB7202S
10x T4 Bufor ligazy DNA NEBB0202A
1x DPBS bez Mg2+ i Ca2+ThermoFisher 
1x LIF
2_Mercaptoethanol 50 mM Gibco313500100,1 mM b-merkaptoetanolu 
37% Formaldehyd Sigma Aldrich252549-500MLUwaga. Zobacz producentów MSDS
400 U/ml T4 DNA Ligaze NEBM0202L
5 U/ml Fragment KlenowaNEBM0210L
AgarozaBIO-RAD1613102Uwaga. Zobacz producentów MSDS
BSA 20mg/mlNEBB9000S
CaCl2
cell counter
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD8418-100MLUwaga. Zobacz producentów MSDS
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001
DynaMag-2 MagnetInvitrogen12321Dokreślany jako: magnes magnetyczny do probówek 1,5 ml
Magnes DynaMag-PCRInvitrogen492025określany jako: magnes magnetyczny do probówek PCR
EDTA Ultrapure 0,5M pH 8,0Invitrogen15575-038
EGTA Ultrapure 0,5M pH 8,0BioWorld40121266-1
Etanol 96% jakości 20824365firmy VWR Chemical 
Bromek etydyny Invitrogen15585-011
Glikol etylenowy bis(bursztynian sukcynimidylu) (EGS)ThermoFisher21565
Fetl Bovin SerumSigma AldrichF752415%
FBS Gel Barwnik ładujący fioletowy (6X)NEBB7024S
Glicyna PanReac AppliChemA1067.0500
Inhibitor Halt Proteinazy (100x)ThermoFisher78430Uwaga. Zobacz producentów MSDS
IGEPAL CA-630 (NP-40)Sigma Aldrich18896-50ML
MgCl 1 MInvitrogenAM9530G
Nukleaza mikrokokkowa (MNaza)WorthingtonLS004798
mysie embrionalne komórki macierzyste 
NaClSigma AldrichS9888-1KG
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (startery Dual Index)Starterywzmacniające NEB E7600Sdo bibliotek sekwencjonowania
Zestaw do przygotowania biblioteki NEBNext Ultra II DNA dla bibliotekiNEBE7645L 
NEBNext Ultra II Q5 Master mix NEBM0544SUwaga. Zobacz producentów MSDS
Roztwór aminokwasów endogennychGibco111400501x NEAA
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco151401481% Pen-Strep
Proteinaza K (40 mg / ml)GoldBioP-480-1Uwaga. Zobacz producentów MSDS
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQIAgen28706określany jako: Zestaw do elucji żelu DNA 
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQIAgen28106określany jako: komercyjny zestaw do oczyszczania DNA 
Zestaw do oznaczania ilościowego DNA Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32854przyrząd do kwantyfikacji DNA o wysokiej czułości 
Szybkie ładowanie fioletowy 1kb plus Drabinka DNANEBN0550S
SPRIwybierz rozmiar koraliki do wyboru BeckmanCoulterB23319koraliki paramagnetyczne 
Mieszalnik ThermoMixer CEppendorf 5382000015określany jako: termomikser
TrisMerck10708976001
Trypsin
Tween20Sigma AldrichP7949-100ML
Ultrapure 10% SDSInvitrogen15553-035
Ultraczysty fenol chloroform Alkohol izoamylowy (PCI)Invitrogen15593-031
Analizator
14190144System kontroli sekwencjonowania Illumina fragmentów

Bibliografia

  1. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  2. Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
  3. Hsieh, T. -H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  4. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  5. Hsieh, T. -H. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).
  6. Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
  7. van Holde, K. E. Chromatin. , Springer. New York, NY. (1989).
  8. Oksuz, B. A. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18, 1046-1055 (2021).
  9. Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved protocol for genome-wide chromosome conformation capture. Current Protocols. 1 (7), 198(2021).
  10. Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P. Mirnylab/distiller-nf; v033. Zenodo. , (2019).
  11. Venev, S., et al. Open2c/cooltools: v0.4.1. Zenodo. , (2021).
  12. Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).
  13. Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion. BioRxiv. , (2022).
  14. Barshad, G., et al. RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts. BioRxiv. , (2022).
  15. Hansen, A. S., et al. Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF. Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).
  16. Hua, P., et al. Defining genome architecture at base-pair resolution. Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).
  17. Downes, D. J. High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale. Nature Communications. 12, 531(2021).
  18. Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments. BioRxiv. , (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowa organizacja genomuprzechwytywanie konformacji chromosomówrozdzielczość nukleosomowatrawienie MNasefałdowanie chromatynypętle chromosomoweligacja bliskościkomórki ssakówprzygotowanie biblioteki do sekwencjonowania
Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.