Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Podsumowanie

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Streszczenie

Trójwymiarowa (3D) organizacja chromosomów jest głównym czynnikiem regulacji genomu i specyfikacji typu komórki. Na przykład uważa się, że elementy cis-regulatorowe, znane jako wzmacniacze, regulują aktywność dystalnych promotorów poprzez interakcję w przestrzeni 3D. Technologie wychwytywania konformacji chromosomów w całym genomie (3C), takie jak Hi-C, zmieniły nasze rozumienie organizacji genomów w komórkach. Obecne zrozumienie organizacji genomu 3D jest ograniczone rozdzielczością, z jaką można rozwiązać topologiczną organizację chromosomów w przestrzeni 3D. Micro-C-XL mierzy fałdowanie chromosomów z rozdzielczością na poziomie nukleosomu, podstawowej jednostki chromatyny, wykorzystując nukleazę mikrokokową (MNazę) do fragmentacji genomów podczas protokołu wychwytywania konformacji chromosomów. Skutkuje to lepszym stosunkiem sygnału do szumu w pomiarach, ułatwiając w ten sposób lepsze wykrywanie miejsc izolacji i pętli chromosomowych w porównaniu z innymi technologiami 3D obejmującymi cały genom. W artykule przedstawiono wizualnie, szczegółowy protokół krok po kroku do przygotowania wysokiej jakości próbek Micro-C-XL z komórek ssaków.

Wprowadzenie

Micro-C-XL to technika pomiaru konformacji genomu 3D z rozdzielczością nukleosomów. Micro-C-XL opiera się na szeroko stosowanej technologii Hi-C opartej na ligacji zbliżeniowej, która zmieniła nasze rozumienie organizacji genomów 3D¹. Micro-C-XL i jego pierwsza wersja, Micro-C, zostały początkowo opracowane w Saccharomyces cerevisiae^2,3, a następnie dostosowane do systemów komórkowych ssaków, dla których protokół wykazał swój pełny potencjał w wykrywaniu cech krótkiego zasięgu genomu 3D, takich jak pętle chromosomów i miejsca izolacji. Ta wersja jest oparta na najnowszych publikacjach Micro-C-XL dotyczących ssaków^4,5. Ponieważ Micro-C-XL zastępuje Micro-C, Micro-C-XL jest odtąd określany w manuskrypcie jako Micro-C.

Główne różnice między Micro-C i Hi-C⁶ są następujące: 1) fragmentacja genomu za pomocą nukleazy mikrokokowej (MNazy) w porównaniu z enzymami restrykcyjnymi i 2) dodatkowe środki sieciujące z większymi odstępami atomowymi między grupami reaktywnymi w porównaniu tylko z formaldehydem. Oba etapy w znacznym stopniu przyczyniają się do poprawy stosunku sygnału do szumu Micro-C w porównaniu z konwencjonalnym Hi-C. Rozmiar fragmentacji ogranicza rozdzielczość, do której organizacja genomu 3D może zostać rozwiązana podczas protokołu ligacji zbliżeniowej. MNaza to nukleaza, która preferencyjnie trawi dostępne DNA i pozostawia nienaruszone DNA chronione nukleosomami. Ślad nukleosomów za pomocą sekwencjonowania MNazy wykazał, że nukleosomy w pełni pokrywają większość genomów eukariotycznych⁷. Ponieważ nukleosomy są rozmieszczone w całym genomie ze średnimi odstępami 160-220 pz, w zależności od gatunku i typu komórki, MNaza jest idealnym enzymem do mapowania architektury genomu w wysokiej rozdzielczości.

Użycie dodatkowego środka sieciującego w połączeniu z formaldehydem (FA) w metodzie Micro-C dodatkowo poprawia stosunek sygnału do szumu^2,8. Specyficzne dla amin środki sieciujące z dłuższymi odstępami atomowymi między grupami reaktywnymi ułatwiają wiązanie białko-białko. Są to zazwyczaj glutaran disuccinimidylu (DSG) lub bursztynian bis-sukcynimidylowy glikolu etylenowego (EGS) o odstępach odpowiednio 7,7 A i 16,1 A. Redukcja szumu za pomocą EGS lub DSG jest szczególnie widoczna w eksperymentach o wysokim współczynniku fragmentacji, takich jak Micro-C, i przypuszczalnie występuje z powodu zmniejszenia częstości losowych zdarzeń ligacji⁸.

Niedawno opracowany protokół Hi-C 3.0, który wykorzystuje sieciowanie ESG/DSG i wiele kombinacji enzymów restrykcyjnych, redukuje szum w eksperymentach Hi-C i znacznie poprawia wykrywanie pętli chromosomowych i miejsc izolacji^8,9. Mimo to, porównanie różnych cech danych o interakcjach w poszczególnych lokalizacjach wykazało, że Micro-C miał lepsze wykrywanie cech krótkiego zasięgu, takich jak pętle chromosomowe i miejsca izolacji, w porównaniu zarówno z Hi-C 3.0, jak i konwencjonalnym Hi-C⁸. Jednak Hi-C 3.0 poprawia wykrywanie cech krótkiego zasięgu i utrzymuje silną detekcję przedziałów genomu w porównaniu z konwencjonalnym Hi-C. Podsumowując, wybór metody wychwytywania konformacji chromosomów powinien być podyktowany kwestią obiektywną i biologiczną.

Tutaj udostępniamy krok po kroku protokół dla udanych eksperymentów Micro-C, które mogą rozwikłać organizację genomu 3D.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i sieciowanie

1. Hodowla komórek zgodnie z doświadczeniem musi uzyskać minimum 1 x 10⁷ komórek. Tutaj komórki hodowano w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w pożywce E14 (DMEM z pirogronianem i L-glutaminą, 15% FBS, 1x LIF, 1x NEAA, 1% paciorkowcem piórowym, 0,1 mM β-merkaptoetanolem [patrz tabela materiałów]) i pasażowano co drugi dzień.
   UWAGA: Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do różnych typów komórek z wielu gatunków, takich jak Homo sapiens i Mus musculus. W tym przykładzie wykorzystano mysie embrionalne komórki macierzyste (ES).
2. Zbierz komórki przy zbieganiu 70%-80%, zasysając pożywkę. Umyć raz 5 ml DPBS i inkubować komórki z 3 ml podgrzanej 0,25% trypsyny na 10 cm naczynie przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C.
3. Ugasić trypsynę 7 ml wstępnie podgrzanej pożywki E14 i przenieść oderwane komórki do probówki o pojemności 50 ml.
4. Granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce. Policz komórki za pomocą licznika komórek.
   UWAGA Protokół jest odporny na pewne zmiany w stężeniach komórek, a do ilościowego określenia liczby komórek użyto różnych liczników komórek; Należy jednak pamiętać o zakresie dynamicznym używanego licznika komórek. Zwykle jest to między 1 x 10^5-1 x 10⁷ komórek/ml. Chociaż szybkość i czas trwania wirowania zostały przetestowane dla tego typu komórek, inne, mniejsze komórki mogą wymagać większej prędkości wirowania lub dłuższego czasu wirowania, a wirowanie należy odpowiednio dostosować.
5. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić komórki w DPBS w końcowym stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml. Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 10⁷ komórek, ponownie zawieś komórki w 10 ml DPBS.
6. W pierwszym etapie sieciowania dodaj 37% formaldehydu (FA) do końcowego stężenia 1% do zawiesiny komórek i inkubuj zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej z rotacją (15-20 obr./min); na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 10⁷ komórek, dodaj 270 μl FA do 10 ml zawiesiny komórek.
   UWAGA: Roztwór FA jest zwykle stabilny w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy po otwarciu.
7. Ugasić reakcję, dodając 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 0,25 M i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z rotacją (15-20 obr./min). Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 10⁷ komórek, dodaj 1,027 ml 2,5 M glicyny do zawiesiny komórek.
8. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml DPBS. Powtórz etap wirowania raz i ponownie zawieś granulowane komórki w DPBS do 4 x 10⁶ komórek/ml. Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 10⁷ komórek, ponownie zawieś komórki w 2,5 ml DPBS.
9. Do drugiego etapu sieciowania należy przygotować 0,3 M roztwór podstawowy bursztynianu bis-sukcynimidylu glikolu etylenowego (EGS) w DMSO (13,6 mg EGS w 100 μl DMSO). Dodać EGS w końcowym stężeniu 3 mM do zawiesiny komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut z rotacją (15-20 obr./min). Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 10⁷ komórek, dodaj 25 μl 0,3 M roztworu podstawowego EGS do 2,5 ml zawiesiny komórek.
   UWAGA: Równoważyć EGS z RT przez co najmniej 20 minut przed ważeniem w celu przygotowania roztworu podstawowego.
10. Ugasić reakcję, dodając 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 0,4 M i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z rotacją (15-20 obr./min). Na przykład, jeśli wydajność wynosi 1 x 10⁷ komórek, dodaj 400 μl 2,5 M glicyny do zawiesiny komórek.
11. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić granulowane komórki w DPBS do 5 x 10⁶ komórek/ml. Rozprowadzać 5 x 10⁶ komórek/probówkę dla bibliotek preparatywnych i 1 x 10⁶ komórek/probówkę do miareczkowania do trawienia MNazy.
    UWAGA: Sugeruje się miareczkowanie optymalnego stopnia trawienia dla każdej partii usieciowanych komórek. Najlepiej zebrać dwie do trzech porcji po 1 x 10⁶ komórek do eksperymentów miareczkowania MNazy (krok 2) i od dwóch do czterech podwielokrotności po 5 x 10⁶ komórek do eksperymentów preparatywnych (krok 3).
12. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Zamroź granulki komórek w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Udane biblioteki Micro-C można przygotować z próbek przechowywanych przez okres do 3 miesięcy.

2. Miareczkowanie MNazy

UWAGA: Przeprowadzenie miareczkowania MNazy jest konieczne do określenia optymalnego stężenia MNazy przed przetworzeniem biblioteki preparatywnej komórek podwójnie usieciowanych.

1. Aby przeprowadzić miareczkowanie MNazy, rozmrozić jedną osadkę 1 x 10⁶ komórek na lodzie przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w 500 μl DPBS (dodać 1x BSA, jeśli komórki przyklejają się do ścianki). Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 20 minut.
2. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 500 μL buforu MB#1 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 0,2% NP-40, 1x inhibitor proteazy [patrz tabela materiałów], pH 7,4).
3. Zebrać komórki przez odwirowanie w sile 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu MB#1 i podzielić próbkę na cztery probówki.
4. Rozmrozić jedną fiolkę MNazy (20 U/μL) i rozcieńczyć 10 mM Tris, pH 7,4, w serii 1:2, 1:4, 1:4 i 1:4, aby osiągnąć stężenia odpowiednio 10 U/μL, 2,5 U/μL, 0,625 U/μL i 0,1256 U/μL (po jednym dla każdego warunku trawienia). W odpowiednich odstępach czasu (10-20 s) dodać 1 μl roztworu MNazy do jednej z czterech próbek, odwirować i inkubować na termomikserze w temperaturze 37 °C przez 10 minut (wytrząsanie 800 obr./min). Kontynuuj dodawanie 1 μl z pozostałych rozcieńczeń MNazy do pozostałych porcji komórek.
5. Zatrzymaj trawienie Mnase, dodając 200 μl świeżo przygotowanego buforu STOP (150 μl 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μL 10 % SDS, 25 μL 20 mg/ml proteinazy K, 2 μL 0,5 M EGTA) do każdej probówki w tej samej kolejności i w tym samym odstępie czasu, w którym dodano MNazę. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
6. Dodać 500 μl alkoholu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego (PCI) do każdej próbki i dokładnie wymieszać przez wirowanie. Wirować przy 19 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia faz i przeniesienia fazy wodnej do nowych probówek (około 200 μl/próbkę).
   UWAGA: PCI zawiera wiele toksycznych składników i powinien być obsługiwany wyłącznie w kapturze bezpieczeństwa chemicznego. Aby uzyskać więcej informacji, skontaktuj się z producentem.
7. Oczyścić DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i eluować próbki w 12 μl buforu elucyjnego.
   UWAGA: Stężenie SDS z etapu deproteinizacji (krok 2.5) jest hamujące dla niektórych zestawów do oczyszczania DNA. Zastosowany tutaj zestaw do oczyszczania DNA działa porównywalnie do wytrącania etanolu.
8. Dodać 2-5 μl barwnika ładującego i uruchomić próbki na 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 120 V przez 30-50 minut (aż do prawidłowego rozdzielenia; Rysunek 1A).
9. Wybierz najlepszy stopień trawienia dla eksperymentu i kontynuuj preparatywne trawienie MNazy. Optymalny stopień trawienia wykazuje niewielką lub żadną ilość fragmentów subnukleosomalnych i stosunek mono- do dinukleosomów wynosi 70%-90%.
   UWAGA: W tym eksperymencie stopień trawienia Lane 4 w Rysunek 1A został określony jako optymalne trawienie uzyskane przy użyciu 0,625-1,25 U Mnase dla 2,5 x 10⁵ komórek (= 2,5-5 U Mnase dla 1 x 10⁶ komórek). Aby zapoznać się ze szczegółową dyskusją, zobacz reprezentatywne wyniki.

3. Preparatywne trawienie MNazy

1. Aby rozdrobnić chromatynę na mononukleosomy poprzez trawienie MNazy, należy rozmrozić wcześniej podwójnie usieciowane podwielokrotności⁵ x 10 6 komórek i ponownie zawiesić w 1 ml DPBS. Inkubować na lodzie przez 20 minut (dodać 1x BSA, jeśli komórki przyklejają się do ścianki probówki).
2. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 500 μL buforu MB#1. Powtórz krok wirowania jeden raz. Ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu MB#1 i zrobić 200 μl porcji (1 x 10⁶ komórek na podwielokrotność).
3. Na podstawie miareczkowania MNazy (opisanego w kroku 2) trawić chromatynę, dodając odpowiednią ilość MNazy (zwykle 2,5-10 U/μL na 1 x 10⁶ komórek) do każdej podwielokrotności. Dobrze wymieszać (szybko odwirować i odwirować) i inkubować na termomikserze w temperaturze 37 °C przez 10 minut z wytrząsaniem 800 obr./min.
4. Zatrzymać wytrawianie MNazy, dodając 1,6 μl 0,5 M EGTA (ostatnie 4 mM) do każdej podwielokrotności i inkubować na termomieszaczu w temperaturze 65 °C przez 10 minut z wytrząsaniem 800 obr./min.
5. Pobrać próbkę przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 500 μL 1x NEBuffer 2.1.
6. Próbki zbiorcze odpowiadające wkładowi 5 x 10⁶ komórek lub mniej do dalszego przetwarzania.
   UWAGA: Jeśli ma być przetworzonych więcej niż 5 x 10⁶ komórek, przetwarzaj te próbki równolegle, ponieważ warunki enzymatyczne są zoptymalizowane dla komórek 5 x 10⁶.
7. Przed przystąpieniem do etapów ligacji zbliżeniowej należy przenieść 10% próbki jako kontrolę wejściową w celu kontroli poziomu trawienia MNazy. Dodać 150 μl 10 mM Tris o pH 7,4, 25 μl 10% SDS i 25 μl 20 mg/ml proteinazy K do tej próbki i inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.

4. Przetwarzanie końcówek DNA i ligacja zbliżeniowa

1. Pozostałą próbkę zebrać przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany osad. Zawiesić osad w 90 μl świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix 1 (tabela 1) i inkubować na termomikserze przez 15 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 800 obr./min.
2. Dodać 10 μl 5 μl fragmentu Klenowa i inkubować na termomikserze przez 15 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 800 obr./min.
3. Dodać 100 μl świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix 2 (tabela 2) i inkubować w termomikserze przez 45 minut w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem 800 obr./min. Po inkubacji wygasić reakcję enzymatyczną, dodając EDTA do końcowego stężenia 30 mM. Inkubować na termomikserze przez 20 minut w temperaturze 65 °C z wytrząsaniem 800 obr./min.
4. Pobrać próbkę przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić próbkę w 500 μl świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix 3 (tabela 3) i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej z rotacją (15–20 obr./min).
5. Pobrać próbkę przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić próbkę w 200 μl świeżo przygotowanej mieszanki Micro-C master mix 4 (tabela 4) i inkubować w termomieszalniku przez 15 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 800 obr./min.
6. W celu odwrotnego sieciowania i deproteinizacji dodać do próbki 25 μl 20 mg/ml proteinazy K i 25 μl 10% SDS i inkubować w temperaturze 65 °C przez noc z przerywanym mieszaniem.

5. Oczyszczanie DNA dinukleosomalnego i wybór wielkości

1. Dodać 500 μl PCI do próbek i kontroli wejściowej, a następnie wymieszać przez wirowanie. Rozdzielić fazy przez odwirowanie przy 19 800 x g przez 5 minut i przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki.
2. Zagęścić DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA lub przez wytrącanie etanolu. Eluować próbki w 30 μl (krok 5.3) i kontrole wejściowe (krok 3.11) w 15 μl i uruchomić 1,5% żel agarozowy w celu oddzielenia mononukleosomów i dinukleosomów (Rysunek 1B).
   UWAGA: Stężenie SDS z etapu deproteinizacji jest hamujące dla niektórych zestawów do oczyszczania DNA. Zastosowany tutaj zestaw do oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów) działa porównywalnie do wytrącania etanolu. W zależności od liczby użytych ogniw, wejście może wynosić od 100 ng do 10 μg. Zazwyczaj 1-5 μg DNA ekstrahuje się z 5 x 10⁶ komórek.
3. Wyciąć fragmenty DNA, które mają rozmiar dinukleosomalny (około 300 pz). Użyj dostępnego w handlu zestawu do elucji żelu DNA (patrz tabela materiałów), aby wyekstrahować DNA z żelu agarozowego i eluować w 150 μl.

6. Przygotowanie koralików streptawidyny

1. Przenieść 10 μl kulek streptawidyny (patrz tabela materiałów) na próbkę do probówki reakcyjnej.
2. Umieść go w odpowiednim magnesie do probówek o pojemności 1.5 ml (patrz Tabela materiałów). Po klarowaniu roztworu (1-2 min) usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 300 μl 1x TBW (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween 20) na próbkę. Powtórz ten krok raz.
3. Ponownie zawiesić kulki w 150 μl 2x buforu czarno-białego (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) na próbkę przetworzoną w kroku 7.

7. Rozwijanie streptawidyny i przygotowanie biblioteki na koralikach

1. Dodać 150 μl wstępnie przygotowanych kulek (etap 6.3) do 150 μl próbki (etap 5.3). Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z rotacją (15-20 obr./min).
2. Umieść probówki w odpowiednim magnesie i poczekaj, aż roztwór się klaruje (1-2 min). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 300 μl 1x TBW. Powtórz ten krok.
3. Umieść probówki w odpowiednim magnesie i poczekaj, aż roztwór się klaruje (1-2 min). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 100 μl 0,1x TE (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).
4. Umieść probówki w odpowiednim magnesie i poczekaj, aż roztwór się klaruje (1-2 min). Usunąć supernatant, ponownie zawiesić kulki w 50 μl 0,1x TE i przenieść je do probówek PCR.
   UWAGA: Objętość użytego 0,1x TE (50 μL) odpowiada objętości wejściowej zestawu do przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA (patrz Tabela materiałów) użytego w tym protokole. Jeśli używany jest inny zestaw lub strategia, odpowiednio dostosuj głośność.
5. Wykonaj kroki manipulacji DNA w zestawie przygotowawczym biblioteki sekwencjonowania zgodnie z protokołem producenta. Etapy te zazwyczaj obejmują stępienie DNA, ogon A, ligację adaptora i wycięcie U. Ostatni krok (wycięcie litery U) jest specyficzny dla zestawu użytego w tym badaniu. Jeśli używasz tego zestawu, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta od kroku 1 do kroku 2.6 w protokole zestawu przy użyciu nierozcieńczonych adapterów i nie rozważaj przechowywania w temperaturze −20 °C po kroku 2.6.
   UWAGA: Zmiany buforu wymagane przez zestawy sekwencjonowania muszą być wymieniane przez wiązanie kulek z magnesem i płukaniem (kroki 7.3 do 7.4), ponieważ DNA jest nadal związane z kulkami streptawidyny. Dodatkowo, ponieważ DNA jest związane z kulkami magnetycznymi, zignoruj wszelkie kroki oczyszczania i wyboru rozmiaru po ligacji adaptera z protokołu zestawu. Przejdź do kroku 7.6 (ten protokół).
6. Po zakończeniu podwiązywania adaptera umyj próbkę zgodnie z opisem w kroku 7.2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kulki w 20 μl 0,1x TE.

8. Oszacowanie wymaganych cykli PCR

UWAGA: Zalecane jest oszacowanie wymaganych cykli PCR dla wzmocnienia biblioteki. Zazwyczaj biblioteka Micro-C wymaga 8-15 cykli PCR. Chociaż krok ten nie jest niezbędny, pomaga uniknąć nadmiernej amplifikacji i zmniejsza ryzyko duplikatów PCR.

1. Aby określić minimalną wymaganą liczbę cykli PCR, należy przeprowadzić PCR z 1 μl próbki DNA streptawidyny-biotyny (krok 7.6). W tym celu dodaj do próbki główną mieszankę PCR (3,2 μl_H2O, 0,4 μl startera i5, 0,4 μl startera i7 i 5 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności Q5) do próbki. Wykonaj PCR z 16 cyklami zgodnie z instrukcjami producenta dla używanego zestawu do przygotowania biblioteki DNA.
   UWAGA: Użyte tutaj podkłady są kupowane w osobnym zestawie (patrz Spis materiałów), który musi być kompatybilny z używanym zestawem do przygotowania biblioteki.
2. Po PCR zebrać kulki za pomocą odpowiedniego magnesu i zmierzyć stężenie DNA w 1 μl supernatantu za pomocą przyrządu do oznaczania ilościowego DNA o wysokiej czułości (patrz tabela materiałów). Aby uzyskać całkowite stężenie DNA, pomnóż tę wartość przez 10 (całkowita objętość reakcji PCR). Oszacuj wymaganą liczbę cykli PCR, jak omówiono w reprezentatywnych wynikach.
3. Dodać 2 μl 6x buforu ładującego do pozostałych 9 μl mieszaniny PCR. Rozwiąż bibliotekę amplifikowaną PCR na 1% żelu agarozowym, aby określić udane podwiązanie adaptora, co daje rozmiar około 450 pz ( Rysunek 1C).
   UWAGA: Żel powinien wykazywać wyraźne pasmo około 420 pz (biblioteka Micro-C plus adaptery). Pasma 120 pz reprezentują dimery adapterów i wskazują na biblioteki o niskiej złożoności. Mogą pojawić się prążki o mniejszej masie cząsteczkowej (poniżej 100 pz), a są to niewykorzystane startery z reakcji PCR.

9. Wzmocnienie biblioteki sekwencjonowania

1. Dodać główną mieszaninę PCR (65 μl_H2O, 100 μl polimerazy Q5 o wysokiej wierności, 8 μl startera i5, 8 μl startera i7) do pozostałych 19 μl próbki streptawidyny-biotyny-DNA. Mieszaninę reakcyjną podzielić na 50-100 μl podwielokrotności.
   UWAGA: Optymalna objętość dla PCR zależy od maszyny do PCR; zazwyczaj 50 μl oferuje najbardziej powtarzalną amplifikację w popularnych maszynach do PCR.
2. Wykonaj PCR zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do przygotowania biblioteki DNA z liczbą cykli określoną w kroku 8. Jeśli krok 8 został pominięty, do PCR zaleca się 14 cykli.
3. Oczyść DNA za pomocą kulek paramagnetycznych (patrz Tabela materiałów) w stosunku 1:0,9 zgodnie z protokołem producenta. Eluować w 20 μl 0,1% TE.
   UWAGA: Jeśli dimery adaptera zostaną wykryte w kroku 8.5, przeprowadź oczyszczanie dwukrotnie przy użyciu tego samego stosunku.
4. Określić stężenie DNA i poddać próbki systemowi kontroli jakości (patrz tabela materiałów). Zapewnij dobrą jakość biblioteki Micro-C poprzez obecność pojedynczego precyzyjnego pasma (Rysunek 1D).
   UWAGA: Dimery adapterów są rzadkie w preparatach bibliotecznych na koralikach ze względu na mycie próbki przed PCR. Tak więc pojawienie się dimerów adapterowych wskazuje na niską złożoność biblioteki. W przypadku zaobserwowania dimerów adapterowych zdecydowanie zaleca się kontrolę jakości próbki przy niskim sekwencjonowaniu wejściowym.

10. Sekwencjonowanie DNA i przetwarzanie danych

1. Sekwencjonuj bibliotekę Micro-C z sekwencjonowaniem sparowanych końców zgodnie z wymaganiami dostawcy sekwencjonowania.
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby próbki były sekwencjonowane na platformie w trybie sparowanego końca z 50 bp na odczyt. Starsze platformy, które oferują krótsze długości odczytu, takie jak 2 x 35 bp, również zostały z powodzeniem wykorzystane. Co ważne, jeśli badane są powtarzalne regiony genomu, może być wskazane sekwencjonowanie o dłuższej długości odczytu.
2. Aby ocenić jakość biblioteki Micro-C, należy wykonać sekwencjonowanie przy niskich danych wejściowych z 5 x 10⁶ do 1 x 10⁷ odczytów na próbkę.
3. Przetwarzaj pliki sekwencjonowania (pliki fastq) za pomocą Distiller¹⁰. Odwzoruj odczyty względem odpowiedniego genomu referencyjnego, tutaj mm10.
   UWAGA: Pliki sekwencjonowania mogą być przetwarzane przy użyciu różnych potoków na komputerach lokalnych lub klastrach obliczeniowych. W przypadku próbek o małej głębokości sekwencjonowania większe rozmiary pojemników, takie jak 10 000 bp, 50 000 bp, 100 000 bp i 500 000 bp, mogą zmniejszyć zapotrzebowanie na moc obliczeniową i rozmiary plików. Distiller (użyty w tym badaniu) generuje wszystkie wymagane typy plików, aby ocenić jakość biblioteki Micro-C. Wygenerowany plik *.stats zawiera informacje o szybkości mapy, współczynnikach cis-trans oraz orientacji odczytu stratyfikowanej przez odległość między odczytywanymi parami. Parametry te są wizualizowane w Rysunek 2, a ocena jakości biblioteki Micro-C jest omówiona w reprezentatywnych wynikach. Oprogramowanie przetwarzające generuje również pliki mcool, które można bezpośrednio załadować do HiGlass (https://docs.higlass.io/) w celu wygenerowania macierzy interakcji⁹.

Wyniki

Pomyślne przygotowanie bibliotek Micro-C można ocenić w kilku krokach protokołu. Najważniejszym krokiem jest wybór odpowiedniego stopnia trawienia MNazy. Dlatego stężenie MNazy należy miareczkować, aby konsekwentnie dawać 70%-90% mononukleosomów w stosunku do dinukleosomów dla każdej próbki. Ważne jest, aby pamiętać, że trawienie chromatyny jest różne dla eu- i heterochromatyny, przy czym MNaza trawi heterochromatynę mniej wydajnie. Tak więc optymalny stopień trawienia zależy od regionu chromatyny będącego przedmiotem zainteresowania i badanego typu komórki, ponieważ względna proporcja eu- i heterochromatyny jest specyficzna dla typu komórki. Dlatego zaleca się staranne miareczkowanie wymaganego stężenia MNazy i najpierw ocenę sukcesu eksperymentu Micro-C poprzez sekwencjonowanie o niskim nakładzie wejściowym.

Typowy wzór miareczkowania MNazy chromatyny traktowanej zmniejszającą się ilością MNazy jest pokazany w Rysunek 1A. Tutaj chromatyna z 250 000 komórek na reakcję jest trawiona z czterokrotnym rozcieńczeniem MNazy. Najwyższe stężenie (10 U MNazy, pas 2) wykazuje nadmiernie strawioną chromatynę składającą się prawie wyłącznie z mononukleosomalnego DNA (~150 pz). Warto zauważyć, że środek prążka mononukleosomalnego przebiega niżej w żelu agarozowym w porównaniu z odpowiednimi prążkami w próbkach o obniżonych stężeniach MNazy, co wskazuje na nadmierne trawienie nukleosomalnego DNA. Nadmiernie strawione nukleosomy są nieefektywnie ligowane w reakcji ligacji zbliżeniowej; w związku z tym próbka na torze 2 jest nieoptymalna do eksperymentów Micro-C. Tor 3 (2,5 U MNazy) wykazuje prawie odpowiedni stopień trawienia dla eksperymentów Micro-C. Tutaj pasmo mononukleosomalne jest gatunkiem dominującym, a rozmaz subnukleosomalny, wskazujący na nadmiernie strawione nukleosomy, jest zmniejszony; Jednak nadal jest obecny. Stopień trawienia w pasie 4 (0,635 U MNazy) jest idealnym warunkiem dla eksperymentu Micro-C w tym przykładzie miareczkowania. Występuje wyraźne prążki mononukleosomalne bez subnukleosomalnego DNA. Intensywność pasma dla DNA mono- i dinukleosomu jest prawie równa, co wskazuje na wydajność mononukleosomu wynoszącą 66% lub wyższą. Warto zauważyć, że DNA dinukleosomalne jest około dwa razy większe niż DNA mononukleosomalne (~320 pz vs. ~150 pz), więc jego intensywność pasma na mol DNA jest dwukrotnie wyższa w porównaniu z jego mononukleosomalnym odpowiednikiem. Stopień trawienia w pasie 5 (0,156 U MNazy) pokazuje niedostatecznie strawioną chromatynę prawie bez nukleosomalnego DNA, a zatem stanowi to próbkę nieoptymalną.

Podsumowując, w tym przykładzie, trawienie 2,5 x 10⁵ mysich komórek ES z 0,625 U MNazy (co odpowiada 2,5 U MNazy dla 1 x 10⁶ komórek w 200 μL) oferuje najbardziej obiecujący punkt wyjścia dla trawienia preparatywnego w eksperymentach Micro-C. Należy jednak również wziąć pod uwagę pośrednie stężenie MNazy między warunkami stosowanymi dla próbek na torze 3 i 4 (odpowiadające 5 U MNazy dla 1 x 10⁶ komórek w 200 μl). Co ważne, trawienie chromatyny za pomocą MNazy nie może być skalowane liniowo i nie zaleca się zwiększania trawienia preparatywnego więcej niż 4-krotnie. Aby przygotować biblioteki Micro-C z więcej niż 1 x 10⁶ komórek, zaleca się trawienie chromatyny w podwielokrotnościach 1 x 10⁶ komórek i łączenie ich po inaktywacji MNazy.

Aby ocenić skuteczność protokołu ligacji zbliżeniowej, kontrola wejściowa, która jest trawiona przez MNazę, a nie ligowana zbliżeniowo (krok 3.8), powinna być porównana z próbką podwiązaną zbliżeniowo (krok 5.3) za pomocą 1,5% elektroforezy w żelu agarozowym (Rysunek 1B). Pasma mononukleosomu ligowane zbliżeniowo ma przybliżoną wielkość 300 pz, podobną do dinukleosomów. W związku z tym stosunek sygnału pasma mono- do dinukleosomów powinien przesunąć się z przewagą mononukleosomów (tor 1) w kierunku di-nukleosomów (tor 3 i pas 4). Ponieważ żel agarozowy na tym etapie jest dinukleosomalnym DNA, które jest wycinane i oczyszczane, zaleca się podzielenie próbek na wiele linii, aby uniknąć nadmiernego obciążenia.

Zaleca się ocenę jakości i ilości przygotowanej biblioteki sekwencjonowania za pomocą minimalnego PCR. W tym przypadku DNA z 1 μl kulek (1/20 całej próbki) jest amplifikowane przez 16 cykli w 10 μl reakcji PCR. Całkowite stężenie minimalnej biblioteki PCR zwykle waha się od 50-500 ng po 16 cyklach PCR. Teoretycznie odpowiada to bibliotece 1-10 μg z pozostałych 19 μl próbki, jeśli byłaby ona również amplifikowana przez 16 cykli. Zaleca się użycie minimalnej liczby cykli PCR potrzebnych do wygenerowania biblioteki około 100 ng z całkowitego DNA. Zakładając amplifikację logarytmiczną w PCR, teoretyczne stężenie DNA uzyskane z 19 μl danych wejściowych po 16 cyklach można podzielić kolejno przez dwa, aby obliczyć liczbę cykli PCR wymaganych do wygenerowania biblioteki 100 ng. Na przykład wydajność 100 ng z 1 μl po 16 cyklach odpowiada wydajności 1 900 ng zwiększonej z 19 μl. W tym scenariuszu 12 cykli powinno idealnie wygenerować bibliotekę sekwencjonowania 118 ng z całkowitego DNA (1,900 ng / [2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Pozostałe 9 μl próbki z minimalnego PCR można następnie wykorzystać do oceny jakości biblioteki za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rysunek 1C). Wizualizacja powinna pokazywać jedno wyraźne pasmo przy 420 pz i brak pasm dla dimerów adaptera (120 pz). Mogą również pojawić się mniejsze fragmenty, które odpowiadają niewykorzystanym starterom PCR.

Następnie, przed przystąpieniem do intensywnego sekwencjonowania zaleca się analizę i potwierdzenie udanego przygotowania próbki Micro-C za pomocą sekwencjonowania o niskim nakładzie pracy. Zazwyczaj biblioteki są sekwencjonowane do głębokości odczytu od 5 x 10^{6 do} 1 x 10⁷ i oceniane na podstawie następujących kryteriów: współczynnik duplikacji odczytu sekwencjonowania, wskaźnik interakcji cis- i transchromosomalnych oraz częstotliwość orientacji odczytu sekwencjonowania. Biblioteki Micro-C są przetwarzane za pomocą Distillera, potoku z pełnym zakresem usług, który przetwarza dane z sekwencjonowania plików odczytu (format Fastq) do plików par odczytów (format Bedpe) i skalowalnych macierzy interakcji (formaty Cool i Mcool) przy użyciu cooler, pairtools i cooltools^10,11,12. Potok generuje również plik podsumowania, który jest idealny do oceny jakości bibliotek Micro-C¹⁰ (https://github.com/open2c/distiller-nf). Szybkość duplikacji PCR dostarcza informacji o złożoności biblioteki sekwencjonowania i może być wyodrębniona z wygenerowanego pliku *.stats. Wysokiej jakości biblioteki Micro-C mają mniej niż 5%-10% współczynniki duplikacji PCR, gdy są generowane z 5 milionów lub więcej komórek. Warto zauważyć, że niektóre platformy sekwencjonowania generują duplikaty PCR podczas tworzenia klastra niezależnie od złożoności biblioteki sekwencjonowania. Rysunek 2A pokazuje względne wskaźniki duplikacji dwóch eksperymentów: jednego, który uważamy za dobrą próbę, a drugiego za złą. W tym przykładzie w obu próbkach wyświetlano akceptowalne stawki mapy. Kolejnym kryterium oceny jakości bibliotek Micro-C jest stosunek cis do trans oraz częstotliwości orientacji odczytu. W jądrze chromosomy zamieszkują poszczególne terytoria chromosomowe, a zatem rzadko wchodzą w interakcje z innymi chromosomami. Wysoki wskaźnik wykrytych interakcji transchromosomalnych wskazuje na wysoki wskaźnik losowych ligacji. Należy zauważyć, że na tym poziomie analizy zła próba wykazała wysoki wskaźnik interakcji transchromosomalnych w porównaniu z dobrą próbą (Rysunek 2B). W przypadku Micro-C pożądany jest wskaźnik interakcji cis-chromosomów na poziomie 70% lub wyższym.

Biblioteka Micro-C ma rozmiar fragmentu podobny do pasma di-nukleosomalnego DNA, który może być jednocześnie oczyszczany z próbką ligowaną zbliżeniowo i zanieczyszczać eksperyment. Te zanieczyszczenia są zawsze interakcjami cis-chromosomalnymi. Dlatego ważne jest, aby ocenić również wskaźniki orientacji odczytu. Stopień zanieczyszczenia dinukleosomów można oszacować za pomocą sekwencjonowania przy niskich nakładach wejściowych. Dinukleosomalne DNA wywodzi się z dwóch sąsiednich nukleosomów, które nie zostały rozszczepione przez MNazę. W związku z tym wynikowe odczyty sekwencyjne będą zawsze wyświetlać orientację odczytu do przodu i do tyłu (F i R), a odległość między parami odczytu będzie wynosić około 320 pz. Dla porównania, fragmenty podwiązane zbliżeniowo mogą być ligowane w czterech orientacjach, co daje pary odczytów z F-R, R-R, R-F i F-F, najlepiej z równą obfitością (Rysunek 2C). Ponadto wyświetlają różne odległości między dwiema parami odczytu. Aby oszacować ilość zanieczyszczeń dinukleosomalnych, częstotliwość orientacji odczytu można obliczyć na podstawie plików *stats wygenerowanych przez destylator (Rysunek 2D). Warto zauważyć, że w tej pracy odsetek odczytów F-R (czerwony) był wyższy w złej próbie w porównaniu z dobrą próbą, a stało się to bardziej widoczne, gdy orientacje odczytu były stratyfikowane według odległości (Rysunek 2E). Frakcja F-R jest zdominowana przez fragmenty dinukleosomalne w porównaniu z bibliotekami Micro-C, gdy pary odczytu są stratyfikowane na odczyty o odległościach <562 pz lub ≥562 pz. W tym przypadku ułamek odczytów z odległością <562 pz jest zdominowany przez odczyty F-R, podczas gdy ułamek z odległościami ≥562 pz wykazuje równomierny rozkład między czterema możliwymi orientacjami, co wskazuje, że globalna nadreprezentacja odczytów F-R wynika z zanieczyszczeń dinukleosomalnych. Wybór 562 bp jako progu dla podzbioru jest definiowany przez kategoryzację w wygenerowanym pliku *stats. Chociaż nie jest to konieczne do tej kontroli jakości, bardziej zdefiniowane podzbiory można uzyskać, wyodrębniając odległości z pliku *pairs, który jest również generowany przez destylator. Należy zauważyć, że odczyty dinukleosomalne nie obniżają jakości próbki Micro-C, ponieważ mogą zostać zidentyfikowane i zignorowane podczas przetwarzania danych. Nie zawierają one jednak cennych informacji na temat interakcji 3D i osłabiają odczyty informacyjne.

Tak więc, staranne miareczkowanie MNazy i dokładna kontrola jakości z sekwencjonowaniem o niskim wkładzie są najlepszymi narzędziami do optymalizacji jakości eksperymentów Micro-C.

Rysunek 1: Pośrednie etapy protokołu Micro-C. (A) Elektroforeza chromatyny w żelu agarozowym z 2,5 x 10⁵ mysich komórek ES trawionych różnymi stężeniami MNazy. Pasma mono-, di- i trinukleosomalne są oznaczone strzałkami. M: Drabina DNA (pas 1/6); 10 U MNazy na 250 000 komórek (tor 2); 2,5 U MNazy na 250 000 komórek (tor 3); 0,625 U MNazy na 250 000 komórek (tor 4); 0,156 U MNazy na 250 000 komórek (tor 2). (B) 1,0% elektroforeza w żelu agarozowym w próbkach przygotowanych przez Micro-C (tor 3 i tor 4) oraz kontrola wejściowa strawiona przez MNazę (tor 1). Pas 1 i Tor 2 (M: drabina DNA) są wzmocnione, aby podkreślić względną zmianę intensywności fragmentów mono- i dinukleosomalnych. Pasma mono- i dinukleosomalne są oznaczone strzałkami. Prążek dinukleosomalny w próbce podwiązanej zbliżeniowo łączy DNA z biblioteki dinukleosomalnej i Micro-C. (C) 1,0% elektroforeza w żelu agarozowym z bibliotek sekwencjonowania Micro-C amplifikowana z próbki o objętości 1 μl w celu oceny jakości. Tor 1 (M): drabinka DNA; Tor 2 (S): Biblioteka Mirco-C. (D) Ślad analizatora fragmentów końcowej biblioteki Micro-C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykładowe statystyki dla sekwencjonowania dobrej i złej próbki przy niskim wkładzie . (A) Wykres słupkowy procentowych odczytów zmapowanych (zielony) i niezmapowanych (czerwony). (B) Znormalizowana frakcja odczytów mapujących interakcje cis i transchromosomalne. Zestawy danych zostały znormalizowane do odczytu mapowania CIS. Odczyty mapowania cis zostały stratyfikowane przez odległość między pierwszym a drugim odczytem próbek sekwencjonowanych na sparowanych końcach: ≤1 kbp (żółty), >1 kbp i ≤10 kbp (pomarańczowy) oraz >10 kbp (czerwony). (C) Schemat potencjalnych gatunków molekularnych o rozmiarach dinukleosomalnych. (D) Procentowe orientacje par odczytów dla wszystkich odczytów dobrej i złej próby. (E) Taki sam jak panel (D), ale uwarstwiony odległościami (po lewej, <562 pz i po prawej, ≥562 pz). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Składniki	1x	4,4xa
10x NEBuffer 2.1,	10 μL	44 μL
2 μL 100 mM ATP	2 μl	8,8 μl
100 mM naziemna telewizja cyfrowa	5 μL	22 μL
H2O	68 μL	299,2 μL
10 U/μL T4 PNK	5 μL	22 μL
łączny	90 μL	396 μL

Tabela 1: Główny miks Micro-C 1. Skład mieszanki wzorcowej do końcowej reakcji żucia.

Składniki	1x	4,4xa
1 mM Biotyna-dATP	10 μL	44 μL
1 mM Biotyna-dCTP	10 μL	44 μL
10 mM mieszanina dTTP i dGTP	1 μL	4,4 μL
10x bufor ligazy DNA T4	5 μL	22 μL
200x BSA	0,25 μL	1,1 μl
H2O	23,75 μl	104,5 μL

Tabela 2: Główny miks Micro-C 2. Skład mieszanki wzorcowej do końcowej reakcji znakowania.

Składniki	1x	4,4xa
10x bufor reakcyjny NEB T4 Ligazy	50 μL	220 μL
H2O	422,5 μL	1859 μL
Ligaza DNA T4	25 μL	110μL

Tabela 3: Główny miks Micro-C 3. Skład mieszanki wzorcowej do reakcji ligacji zbliżeniowej.

Składniki	1x	4,4xa
10x NEBuffer 1.1	20 μL	88 μL
H2O	180 μL	792 μL
Nukleaza egzoIII	10 μL	44 μL

Tabela 4: Główny miks Micro-C 4. Skład mieszanki wzorcowej do reakcji usuwania biotyny.

Dyskusja

Powodzenie eksperymentu Micro-C zależy od kilku krytycznych kroków w protokole, które muszą być starannie wykonane. Po pierwsze, sieciowanie za pomocą dodatkowego środka sieciującego DSG lub EGS może prowadzić do agregacji komórek, w zależności od typu komórki. Dodanie 0,1%-0,5% BSA do reakcji sieciowania znacznie zmniejsza agregację bez wpływu na wydajność sieciowania. Nieefektywne sieciowanie może skutkować zwiększonymi wskaźnikami interakcji transchromosomalnych, które wskazują na losowe ligacje. Drugim, ale najważniejszym krokiem w tym protokole jest trawienie chromatyny za pomocą MNazy. Nieoptymalne trawienie chromatyny prowadzi do nieefektywnej ligacji zbliżeniowej (nadmierne trawienie) lub zwiększonego tempa dinukleosomów nieligowanych w pobliżu (niedostateczne trawienie). Skuteczność reakcji ligacji można ocenić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (ryc. 1B) i dodatkowo najlepiej oszacować za pomocą sekwencjonowania o niskim nakładzie wejściowym. Jeśli sekwencjonowanie o niskim poziomie wejściowym wykaże albo wysoki współczynnik duplikacji (nieefektywna ligacja), albo zwiększony wskaźnik dinukleosomów, należy ponownie ocenić stopień trawienia MNazy. Warto zauważyć, że utrata próbki podczas wykonywania protokołu może prowadzić do zmniejszenia złożoności biblioteki. Stężenie próbki najlepiej ocenić po oczyszczeniu DNA (etap 5.3) lub za pomocą minimalnej reakcji PCR (etap 8). Całkowita wydajność DNA z komórek 5 x 10⁶ ssaków po oczyszczeniu DNA wynosi zwykle >2 μg. Stężenie DNA powinno być kontrolowane po trawieniu MNazą, trawieniu ExoIII i oczyszczaniu DNA. Endogenne nukleazy, których obfitość jest specyficzna dla typu komórki i gatunku, mogą być źródłem degradacji DNA. Ponadto oczyszczanie DNA na podstawie kolumn może prowadzić do utraty próbki z powodu niezgodności z SDS w reakcjach deproteinacji. Wytrącanie etanolu można rozważyć, jeśli stężenie DNA jest niskie na tym etapie.

Ponieważ Micro-C wymaga miareczkowania MNazy specyficznej dla próbki, zastosowanie Micro-C do populacji małych komórek, takich jak małe narządy z różnych organizmów modelowych, zarodki i pojedyncze komórki, organoidy lub biopsje pacjentów, jest trudne. W tym przypadku Hi-C 3.0 oferuje ugruntowaną alternatywę wykorzystującą reakcję końcową za pomocą endonukleaz restrykcyjnych specyficznych^{dla sekwencji 8,9}.

Micro-C to szeroko stosowana technologia konformacji chromosomów o wysokiej rozdzielczości o wysokim zakresie dynamiki i niskim stosunku sygnału do szumu, co czyni ją szczególnie odpowiednią do badania cech chromosomów^krótkiego zasięgu ^4,5,8, takich jak pętle chromosomowe. Rozdzielczość Micro-C pozwala na wychwycenie pętli promotor-wzmacniacz, które wykraczają poza granicę wykrywalności Hi-C, skutecznie umożliwiając bardziej szczegółową analizę związku między organizacją genomu a regulacją 13,14,15. Co więcej, strategie wychwytywania DNA zostały niedawno połączone z Micro-C w celu zwiększenia rozdzielczości specyficznej dla locus docelowych loci genomowych do niespotykanych dotąd poziomów, ujawniając nowe informacje na temat ultrastruktury genomu 3D 16,17,18. Podsumowując, przewidujemy, że Micro-C i jego pochodne będą kluczową technologią do analizy roli genomu 3D w regulacji transkrypcji, a w konsekwencji w różnicowaniu i utrzymaniu typów komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 mM Biotyna dATP	Jenna Bioscience	NU-835-Bio14-S
1 mM Biotyna dCTP	Jenna Bioscience	NU-809-BioX-S
10 mM dGTP	NEB	N0442S
10 mM dTTP	NEB	N0443S
10 U/ml T4 PNK	NEB	M0201L
100 U/L Egzonukleaza III	NEB	M0206L
10x NEBuffer 1.1	NEB	B7001S
10x NEBuffer 2.1	NEB	B7202S
10x T4 Bufor ligazy DNA	NEB	B0202A
1x DPBS bez Mg2+ i Ca2+	ThermoFisher
1x LIF
2_Mercaptoethanol 50 mM	Gibco	31350010	0,1 mM b-merkaptoetanolu
37% Formaldehyd	Sigma Aldrich	252549-500ML	Uwaga. Zobacz producentów MSDS
400 U/ml T4 DNA Ligaze	NEB	M0202L
5 U/ml Fragment Klenowa	NEB	M0210L
Agaroza	BIO-RAD	1613102	Uwaga. Zobacz producentów MSDS
BSA 20mg/ml	NEB	B9000S
CaCl2
cell counter
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma Aldrich	D8418-100ML	Uwaga. Zobacz producentów MSDS
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65001
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D	określany jako: magnes magnetyczny do probówek 1,5 ml
Magnes DynaMag-PCR	Invitrogen	492025	określany jako: magnes magnetyczny do probówek PCR
EDTA Ultrapure 0,5M pH 8,0	Invitrogen	15575-038
EGTA Ultrapure 0,5M pH 8,0	BioWorld	40121266-1
Etanol 96%	jakości 20824365	firmy VWR Chemical
Bromek etydyny	Invitrogen	15585-011
Glikol etylenowy bis(bursztynian sukcynimidylu) (EGS)	ThermoFisher	21565
Fetl Bovin Serum	Sigma Aldrich	F7524	15%
FBS Gel Barwnik ładujący fioletowy (6X)	NEB	B7024S
Glicyna	PanReac AppliChem	A1067.0500
Inhibitor Halt Proteinazy (100x)	ThermoFisher	78430	Uwaga. Zobacz producentów MSDS
IGEPAL CA-630 (NP-40)	Sigma Aldrich	18896-50ML
MgCl 1 M	Invitrogen	AM9530G
Nukleaza mikrokokkowa (MNaza)	Worthington	LS004798
mysie embrionalne komórki macierzyste
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (startery Dual Index)	Startery	wzmacniające NEB E7600S	do bibliotek sekwencjonowania
Zestaw do przygotowania biblioteki NEBNext Ultra II DNA dla biblioteki	NEB	E7645L
NEBNext Ultra II Q5 Master mix	NEB	M0544S	Uwaga. Zobacz producentów MSDS
Roztwór aminokwasów endogennych	Gibco	11140050	1x NEAA
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)	Gibco	15140148	1% Pen-Strep
Proteinaza K (40 mg / ml)	GoldBio	P-480-1	Uwaga. Zobacz producentów MSDS
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu	QIAgen	28706	określany jako: Zestaw do elucji żelu DNA
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	QIAgen	28106	określany jako: komercyjny zestaw do oczyszczania DNA
Zestaw do oznaczania ilościowego DNA Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32854	przyrząd do kwantyfikacji DNA o wysokiej czułości
Szybkie ładowanie fioletowy 1kb plus Drabinka DNA	NEB	N0550S
SPRIwybierz rozmiar koraliki do wyboru Beckman	Coulter	B23319	koraliki paramagnetyczne
Mieszalnik ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015	określany jako: termomikser
Tris	Merck	10708976001
Trypsin
Tween20	Sigma Aldrich	P7949-100ML
Ultrapure 10% SDS	Invitrogen	15553-035
Ultraczysty fenol chloroform Alkohol izoamylowy (PCI)	Invitrogen	15593-031
Analizator