Method Article

Ocena procesu i kinetyka ekspresji rekombinowanej deacetylazy chitynowej w komórkach E. coli Rosetta pLysS przy użyciu techniki statystycznej

DOI:

10.3791/64590

⸱

March 10th, 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym protokole, technika statystyczna, centralne projektowanie kompozytowe (CCD), została zastosowana w celu optymalizacji warunków procesu ekspresji rekombinowanej bakteryjnej deacetylazy chitynowej (BaCDA) w komórkach E. coli Rosetta pLysS. Zastosowanie CCD spowodowało ~2,39-krotny wzrost ekspresji i aktywności BaCDA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach zyskała na znaczeniu bardziej ekologiczna droga deacetylacji chityny do chitozanu przy użyciu enzymu deacetylazy chityny. Enzymatycznie przekształcony chitozan o właściwościach emulujących ma szeroki zakres zastosowań, szczególnie w dziedzinie biomedycyny. Zgłoszono kilka rekombinowanych deacetylaz chitynowych z różnych źródeł środowiskowych, ale nie ma badań nad optymalizacją procesu produkcji tych rekombinowanych deacetylaz chitynowych. W niniejszym badaniu wykorzystano centralną konstrukcję kompozytową metodologii powierzchni odpowiedzi w celu maksymalizacji produkcji rekombinowanej bakteryjnej deacetylazy chitynowej (BaCDA) w E. coli Rosetta pLysS. Zoptymalizowane warunki procesu to stężenie glukozy 0,061%, stężenie laktozy 1%, temperatura inkubacji 22 °C, prędkość mieszania przy 128 obr./min i 30 godzin fermentacji. W optymalnych warunkach ekspresja spowodowana indukcją laktozy rozpoczęła się po 16 godzinach fermentacji. Maksymalną ekspresję, biomasę i aktywność BaCDA zarejestrowano 14 godzin po indukcji. W optymalnych warunkach aktywność BaCDA ekspresji BaCDA wzrosła ~2,39-krotnie. Optymalizacja procesu skróciła całkowity cykl fermentacji o 22 godziny i czas odciągania o 10 godzin po indukcji. Jest to pierwsze badanie, w którym opisano optymalizację procesu ekspresji deacetylazy rekombinowanej chityny przy użyciu centralnej konstrukcji kompozytu i jego profilowania kinetycznego. Dostosowanie tych optymalnych warunków wzrostu może zaowocować opłacalną produkcją na dużą skalę mniej zbadanej deacetylazy monoranowej, rozpoczynając tym samym bardziej ekologiczną drogę do produkcji chitozanu klasy biomedycznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chityna, β strukturalny, naturalny polimer połączony z 1-4 glikozydami, jest drugim najobficiej występującym polisacharydem w przyrodzie po celulozie. Mimo to chityna ma ograniczone zastosowania przemysłowe ze względu na swoją nierozpuszczalność1. To wąskie gardło jest rozwiązywane poprzez poddanie chityny działaniu N-deacetylacji, która nadaje ładunek dodatni i zwiększa rozpuszczalność powstałego polimeru, chitozan1. Chityna może być modyfikowana do chitozanu na dwie różne drogi: chemiczną i enzymatyczną. Biomedyczne zastosowanie chitozanu wymaga kontrolowanej i zdefiniowanej deacetylacji, która jest ograniczona w szlakach chemicznych2,3. To ograniczenie można rozwiązać za pomocą deacetylaz chitynowych (CDA), zielonego enzymatycznego podejścia do procesu deacetylacji4,5.

Deacetylaza chitynowa należy do rodziny esterazy węglowodanowej 4 (CE-4), zdefiniowanej w bazie danych enzymów aktywnych węglowodanowo (CAZY). Enzymy z rodziny CE-4 mają wspólną homologię NodB lub domenę deacetylazy polisacharydowej jako region konserwatywny. Centralny projekt kompozytowy (CCD), narzędzie statystyczne, służy do optymalizacji kilku enzymów modyfikujących chitynę typu dzikiego6,7,8,9. Jednak dalsze etapy wykorzystania organizmów dzikich stają się żmudne, stąd przejście w kierunku enzymów rekombinowanych10,11,12,13,14,15,16,17. W ostatnich latach halofilne rekombinowane CDA ze źródeł morskich zyskały na znaczeniu ze względu na łatwość w zastosowaniu przemysłowym i produkcji chitozanu klasy biomedycznej18,19.

Produkcja enzymu rekombinowanego w E. coli ma ograniczenie w tym procesie, dlatego potrzebna jest optymalizacja pożywki, ponieważ jej ekspresja w E. coli różni się w zależności od użytego genu i plazmidu20. W związku z tym ważne staje się badanie przesiewowe odpowiedniego procesu i parametrów składników odżywczych. Jeden czynnik na raz (OFAT), powszechnie stosowana metoda optymalizacji, wymaga ogromnych zasobów i czasu na przeprowadzanie eksperymentów krok po kroku. Ta metoda cierpi z powodu braku informacji statystycznych dotyczących interakcji między parametrami20,21,22,23. W związku z tym przyjęto metodologię CCD powierzchni odpowiedzi (RSM) do badania ekspresji halofilnej bakteryjnej deacetylazy chitynowej (BaCDA) i aktywności BaCDA w E. coli Rosetta pLysS. Parametrami branymi pod uwagę przy optymalizacji ekspresji u gospodarza E. coli były stężenie laktozy, stężenie glukozy, temperatura inkubacji, szybkość mieszania i czas inkubacji. W większości badań nad ekspresją E. coli jako induktor stosowano pożywkę Luria Bertani (LB) z izopropylo β-d-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG). To dodanie IPTG wymagało regularnego monitorowania wzrostu24. Te powtarzające się mediacje podczas procesu fermentacji również otwierają drogę do zanieczyszczenia. W związku z tym grupy badawcze przestawiły się na wspaniały bulion (TB) z laktozą jako induktorem. Włączenie laktozy do pożywek zamiast IPTG rozwiązuje ten problem; E. coli zużywa tę laktozę i wytwarza allo-laktozę jako produkt uboczny, co powoduje stan autoindukcji. Ta pożywka z autoinduktorem zawiera glicerol, który wykazał zwiększoną wydajność rekombinowanego białka25. Ta nadekspresja białek rekombinowanych w pożywkach gruźliczych została dodatkowo poprawiona poprzez optymalizację parametrów procesu. W niniejszym badaniu zastosowano centralną konstrukcję kompozytową w celu optymalizacji heterologicznej ekspresji halofilnego BaCDA w komórkach E. coli Rosetta pLysS. Wybranymi parametrami procesu były temperatura inkubacji, szybkość mieszania i czas inkubacji, a ocenianymi parametrami składników odżywczych były stężenie glukozy i laktozy. Halofilową ekspresję BaCDA oceniono za pomocą przewidywanego zoptymalizowanego warunku i poddano walidacji krzyżowej za pomocą SDS-PAGE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pożywka ekspresji i warunki kultury

  1. Przekształć wektor pET-22b zawierający gen BaCDA w kompetentne komórki E. coli Rosetta pLysS za pomocą metody szoku cieplnego, zgodnie z opisem w15.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas pracy z mikroorganizmami. Wszystkie prace mikrobiologiczne muszą być wykonywane wewnątrz okapu szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  2. Przeprowadzić wstępne badanie ekspresji w pożywkach gruźliczych zawierających 0,05% (w/v) glukozy i 0,2% (w/v) laktozy w temperaturze 16 °C i 180 obr./min. Hoduj 6,792 x 107 komórek pLysS E. coli Rosetta w 100 ml pożywki zawierającej sklonowany plazmid BaCDA, aż osiągnie fazę stacjonarną. We wspomnianych warunkach wzrostu komórki E. coli Rosetta pLysS osiągają gęstość optyczną 600 (OD600) wynoszącą 10,85 ± 0,21,
    UWAGA: Skład pożywki TB (% w/v): trypton, 1,2; ekstrakt drożdżowy, 2,4; glicerol, 0,6; i 1x TB soli (17 mM KH2PO4 i 74 mM K2HPO4)17.

2. Optymalizacja i projektowanie eksperymentalne

  1. Zaprojektuj eksperymenty i dopasuj model wielomianowy drugiego rzędu do centralnego projektu złożonego za pomocą oprogramowania narzędzi statystycznych. Oprogramowaniem statystycznym wykorzystanym w niniejszym badaniu był MINITAB 17.0 (wersja próbna).
    1. Aby to zrobić, otwórz oprogramowanie i kliknij następujące przyciski: Stat > DoE > Response surface > Create response surface > Response design > Central composite. Dane wyjściowe są wyświetlane jako okno dialogowe.
  2. Podaj pięć parametrów: temperaturę inkubacji, szybkość mieszania, czas inkubacji, stężenie glukozy i stężenie laktozy, na pięciu poziomach (-2, -1, 0, +1, +2) w oknie dialogowym.
    1. Aby to zrobić, wprowadź parametry z poziomami w oknie dialogowym, wprowadź szczegóły wszystkich parametrów i naciśnij OK. W ten sposób generowana jest eksperymentalna matryca projektowa z sześcioma powtórzeniami w punkcie środkowym, co wymaga 32 przebiegów eksperymentalnych. Oprogramowanie generuje tabelę zawierającą parametry i ich poziomy w ujęciu zakodowanym i niekodowanym, wykorzystywaną w optymalizacji procesu z wykorzystaniem CCD (Tabela 1).
  3. Wykonaj 32 eksperymenty z warunkami wygenerowanymi przez oprogramowanie. Wprowadzić wyniki eksperymentu do eksperymentalnej matrycy projektowej (wygenerowanej przez oprogramowanie) zawierającej poziomy i parametry w postaci zakodowanych i niekodowanych jednostek (tabela 2).
  4. Przeanalizuj eksperymentalną matrycę projektową (Tabela 2) za pomocą oprogramowania. Aby to zrobić, otwórz oprogramowanie i wprowadź odpowiedź do arkusza danych. Wybierz kolumnę Response (Odpowiedź) > Stat > DoE > Response surface (Powierzchnia odpowiedzi> Analizuj projekt powierzchni odpowiedzi > OK. Dane wyjściowe są analizowane pod kątem istotności statystycznej, a model jest przewidywany przez oprogramowanie.

Tabela 1: Parametry i ich poziomy w zakodowanych i niekodowanych terminach użyte w projekcie eksperymentalnym do oszacowania ekspresji rekombinowanej deacetylazy chitynowej w komórkach E. coli Rosetta pLysS. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Eksperymentalna matryca projektowa z eksperymentalną i przewidywaną aktywnością (wyrażeniem) BaCDA rekombinowanej deacetylazy chitynowej w komórkach E. coli Rosetta pLysS. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Walidacja modelu

  1. Zweryfikuj zaprojektowany model za pomocą narzędzia optymalizatora odpowiedzi dostępnego w oprogramowaniu.
  2. Powtórzyć fermentację w optymalnych warunkach przewidzianych przez oprogramowanie i porównać wartość eksperymentalną z wartością przewidzianą przez oprogramowanie.
    1. Aby to zrobić, otwórz oprogramowanie i wybierz kolumnę Odpowiedź > Stat > DoE > Response surface > Response optimizer > Maximize > OK. Wynikiem są optymalne warunki procesu i wartości przewidywane przez oprogramowanie. Powtórzyć fermentację w przewidywanych optymalnych warunkach i porównać wartości.

4. Metody analityczne

  1. Ekspresja, biomasa i kwantyfikacja białka
    1. Przeprowadź fermentację w 32 warunkach podanych przez oprogramowanie w matrycy projektu eksperymentalnego (tabela 2). Otrzymanie osadu po każdym przebiegu przez odwirowanie kultury w temperaturze 5,405 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zważyć osad komórkowy w celu określenia uzysku biomasy.
      UWAGA: Wszelkie czynności związane z drobnoustrojami powinny odbywać się w warunkach aseptycznych (tj. w komorach bezpieczeństwa biologicznego).
    2. Lizować osad komórkowy w celu uzyskania białka peryplazmatycznego za pomocą sonikacji. Dodaj 5 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazolu) do każdego grama osadu komórkowego i rozbijaj przez sonikację przez 10 cykli z impulsem 10 s włączonym i 10 s wyłączonym przy 60% amplitudzie. Zebrać lizat przez odwirowanie przy 5 405 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Określić ilościowo stężenie białka za pomocą testu Bradforda26.
      UWAGA: Aby uniknąć denaturacji białek, sonikacja musi być wykonywana w niskich temperaturach. Umieść próbki na lodzie podczas wykonywania sonikacji.
    3. Przeanalizuj wyrażenie BaCDA za pomocą SDS-PAGE, a następnie oprogramowania ImageJ. Załaduj 10 μl rozpuszczalnego lizatu komórkowego (białka peryplazmatycznego) na 12% żelu bis-akrylamidowym i uruchom pod 1x buforem tris-glicyny-SDS (TGS) przy prądzie 100 V przez 2 godziny. Po zakończeniu biegu zabarwij żel kolorem Coomassie blue i odplamij, aby usunąć tło27.
    4. Uchwyć obraz za pomocą modułu dokumentacji żelu. Określ wyrażenie BaCDA, porównując intensywność pasma w postaci wartości pikseli za pomocą oprogramowania ImageJ. Rozważmy przebieg eksperymentalny z najniższą aktywnością BaCDA i biomasą jako piksel odniesienia 28.
      1. Aby to zrobić, otwórz oprogramowanie i otwórz plik obrazu, a następnie wybierz każdy pas za pomocą prostokątnego pola. Przejdź do pozycji Analizuj i ustaw każdy pas jako 100%, a następnie wybierz pasmo z nadekspresją w każdym pasie, korzystając z prostokątnego pola. Przejdź do Analizuj i określ intensywność pasma, powtórz proces na każdym torze i wyeksportuj wynik jako .xls plik. Jako natężenie odniesienia należy rozważyć intensywność pasma przebiegu eksperymentalnego z najniższą aktywnością BaCDA i przeanalizować ekspresję każdego pasa.
  2. Oznaczenie aktywności enzymatycznej
    1. Określić aktywność BaCDA za pomocą zestawu do oznaczania octanu15, używając chityny glikolu etylenowego (1 mg/ml; EGC) jako substrat29.
    2. Pozostawić 20 μl BaCDA do reakcji z 40 μl substratu w obecności 40 μl 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7) przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C, mieszając przy 800 obr./min.
    3. Po upływie 1 godziny odwirować 100 μl reagenta przez kolumnę o stężeniu 3 kDa przy 2,111 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić retentat składający się z BaCDA i zebrać filtrat zawierający octan uwolniony podczas reakcji. Użyj filtratu do testu octanowego, aby określić aktywność BaCDA.
      UWAGA: Jedną jednostkę enzymu definiuje się jako aktywność, która uwalnia 1 μM octanu z substratu na mikrolitr enzymu na minutę. Test aktywności enzymatycznej przeprowadzono w trzech egzemplarzach, a odpowiednią aktywność enzymatyczną obliczono odpowiednio.
  3. Kinetyka fermentacji indukcji laktozy
    1. Zbadaj profil aktywności, aby określić punkt indukcji laktozy i punkt początkowy odciągu. Profilowanie aktywności odbywa się poprzez oszacowanie biomasy i aktywności BaCDA przy zoptymalizowanych warunkach fermentacji.
    2. Określ stężenie glukozy w pożywce za pomocą zestawu do szacowania stężenia glukozy. Wykreślić profil aktywności przy użyciu biomasy, stężenia glukozy i aktywności BaCDA w zależności od czasu fermentacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalizacja procesu ekspresji peryplazmatycznego rekombinowanego enzymu deacetylazy chitynowej w E. coli przy użyciu centralnego projektu kompozytowego (CCD)
Konstrukt pET22b-Ba CDA, uprawiany w niezoptymalizowanych warunkach, dał maksymalny plon biomasy i aktywność BaCDA odpowiednio 22,26 ± 0,98 g/L i 84,67 ± 0,56 U/L15. W niniejszym badaniu przyjęto podejście statystyczne CCD w celu znalezienia optymalnych warunków procesu ekspresji peryplazmatyc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deacetylowana chityna, chitozan, ma wiele zastosowań, zwłaszcza w dziedzinie biomedycyny30. Jednak powtarzalność chitozanu w odniesieniu do jego stopnia acetylacji (DA) i wzorca acetylacji (PA) jest poważnym problemem, oprócz innych obaw środowiskowych. W ten sposób wykorzystano bardziej ekologiczną drogę, wykorzystującą enzymy. Szereg CDA można wykorzystać do stworzenia chitozanu o unikalnym wzorcu deacetylacji, co zwiększyłoby ich zastosowania biomedyczne 4,5

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Manipal Academy for Higher Education (MAHE) za fundusz MAHE UNSW, a autorzy chcieliby podziękować Radzie Badań Naukowych i Przemysłowych - Grupie Rozwoju Zasobów Ludzkich (CSIR-MHRD), Rządowi Indii za stypendium badawcze, list przyznający numer 09/1165(0007)2K19 EMR-I z dnia 31.03.2019.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
Acetate zestaw testowyMegazyme, IrlandiaK-ACETAKProtokół został nieznacznie zmodyfikowany i zoptymalizowany do wykonania testu na płytce 96-dołkowej
Zestaw do szacowania stężenia glukozyAgappe diagnosis Ltd., Indie12018013Protokół został nieznacznie zmodyfikowany i zoptymalizowany do wykonywania testu na płytce
96-dołkowejChemicals
Acetic acidHi-media, IndiaAS001Służy do przygotowania roztworu do barwienia i usuwania SDS-PAGE
AkrylamidHi-media, IndieMB068Służy do przygotowania żelu SDS-PAGE
Pursiarczan amonuHi-media, IndieMB003Służy do przygotowania żelu SDS-PAGE
Bis-acrylamidHi-media, IndieMB005Służy do przygotowania SDS-PAGE gel
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media, IndieMB092Służy do przygotowania roztworu do barwienia i usuwania SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media, IndieMB153Służy do przygotowania testu Bardforda
Glikol etylenowy chitozanSigma-aldrich, USAE1502Używany do przygotowania chityny glikolu etylenowego i chityny glikolu etylenowego zastosowano jako substrat do reakcji enzymatycznej
D-glukozyHi-media, IndieMB037Używany jako składnik pożywki.
ImidazolHi-media, IndieGRM1864Stosowany w buforze do lizy
LaktozaHi-media, IndieGRM017Stosowany jako składnik pożywki.
MetanolFinar, Indie30930LC250Służy do przygotowania roztworu do barwienia i usuwania SDS-PAGE
Chlorek sodu (NaCl)Hi-media, IndieMB023Stosowany w buforze do lizy
Kwas fosforowyHi-media, IndieMB157Używany do przygotowania testu Bardforda
dodecylosiarczan sodu (SDS)Hi-media, IndieGRM6218Służy do przygotowania żelu SDS-PAGE
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyHi-media, IndieMB024Służy do przygotowania soli gruźliczej na pożywkę i bufor do reakcji enzymatycznej.
Fosforan sodu jednozasadowy bezwodnyHi-media, IndieGRM3964Służy do przygotowania soli gruźliczej na pożywkę i bufor do reakcji enzymatycznej.
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Hi-media, IndieMB026Używany do przygotowania żelu SDS-PAGE
Baza TrisHi-media, IndieMB029Używany do przygotowania żelu SDS-PAGE
TryptonHi-media, IndieRM7707Używany jako składnik nośnika.
Ekstrakt drożdżowyHi-media, IndieRM027Stosowany jako składnik pożywki.
Equipment
AlphaImager Jednostka dokumentacji żelu HPProteinSimple, USA92-13823-00Służy do robienia zdjęć SDS-PAGE
Mikser stołowyEppendorf, Niemcy 9.776 660Używany do przechowywania do reakcji enzymatycznej z adapterem 2 ml
Wytrząsarka do bioinkubatoraInstrumenty Trishul, Indie13410622Używany do inkubacji kultur bakteryjnych w różnych temperaturach i prędkościach obrotowych
BiospektrofotometrEppendorf, Niemcy 6135000009Służy do wykonywania wszystkich odczytów spektroskopowych
Wirówka chłodzącaEppendorf, Niemcy 5805000017Służy do odwirowywania hodowli, lizatu i wszystkich innych protokołów wirowania
Sucha kąpielLabnet International, USAS81522039Służy do denaturacji próbki białka do mikropipet SDS-PAGE
Eppendorf, Niemcy 3123000900Używany w protokole do pomiarów objętości
Wytrząsarka kołyskowaInstrumenty Trishul, Indie11770719Służy do wstrząsania żelem SDS-PAGE do barwienia i odbarwiania
Jednostka SDS-PAGEBio-Rad, USA1658001FCSłuży do odlewania i uruchamiania żelu SDS-PAGE
Ultrasonics & Materials, Inc., USAVCX 130Służy do lizy komórki bakteryjnej za pomocą ultradźwięków
Waga wagowaSartorius, NiemcyBSA124 SSłuży do pomiaru masy w całym protokole
Devices
Nanosep Urządzenia odśrodkowe z membraną Omega (3 kDa)PALL life sciences, USAOD003C33Służy do oddzielania enzymu po substracie treatment
SoftwaresVersionOpracowany w
MINITAB17.0  (Wersja próbna)  Uniwersytet Stanowy PensylwaniiSłuży do projektowania modelu eksperymentalnego i analizy danych
ImageJ1.53oNational Institutes of Health (NIH)Służy do analizy poziomu ekspresji za pomocą SDS-PAGE image
Plasmid
pET22b (+) DNA— NovagenMerck- Millipore, USA69744Przechowywane w temperaturze − 20 ° C
komórki
E. coli Rosetta pLysS— NovagenMerck- Millipore, USA70956Utrzymywany w Luria– Rosół Bertani (LB) zawierający 25% glicerolu o stężeniu − 80 stopni Celsjusza; Z

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yadav, M., et al. Seafood waste: a source for preparation of commercially employable chitin/chitosan materials. Bioresources and Bioprocessing. 6 (1), 1-20 (2019).
  2. Anil, S. Potential medical applications of chitooligosaccharides. Polymers. 14 (17), 3558(2022).
  3. Amiri, H., et al. Chitin and chitosan derived from crustacean waste valorization streams can support food systems and the UN Sustainable Development Goals. Nature Food. 3 (10), 822-828 (2022).
  4. Wattjes, J., et al. Patterns matter part 1: Chitosan polymers with non-random patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104583(2020).
  5. Cord-Landwehr, S., et al. Patterns matter part 2: Chitosan oligomers with defined patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104577(2020).
  6. He, Y., Xu, J., Wang, S., Zhou, G., Liu, J. Optimization of medium components for production of chitin deacetylase by Bacillus amyloliquefaciens Z7, using response surface methodology. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 28 (2), 242-247 (2014).
  7. Pareek, N., Vivekanand, V., Saroj, S., Sharma, A. K., Singh, R. P. Purification and characterization of chitin deacetylase from Penicillium oxalicum SAE M-51. Carbohydrate Polymers. 87 (2), 1091-1097 (2012).
  8. Yonis, R. W., Luti, K. J. K., Aziz, G. M. Statistical optimization of chitin bioconversion to produce an effective chitosan in solid state fermentation by Asperigellus flavus. Iraqi Journal of Agricultural Sciences. 50 (3), 916-927 (2019).
  9. Deeba, F., Shakir, H. A., Irfan, M., Khan, M., Qazi, J. I. Utilization of agro-industrial waste for chitinase production by locally isolated bacillus subtilis using response surface methodology. Pakistan Journal of Zoology. 54 (2), 551-560 (2022).
  10. Pandey, A., Tripathi, A. H., Tripathi, P. H. Production, purification, and application of the microbial enzymes. Industrial Applications of Microbial Enzymes. , CRC Press. 19-39 (2022).
  11. Bhat, P., et al. Expression of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli pLysS: Sustainable production, purification and characterisation. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 1008-1013 (2019).
  12. Hamer, S. N., et al. Enzymatic production of defined chitosan oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination of chitin oligosaccharide deacetylases. Scientific Reports. 5, 8716(2015).
  13. Kadokura, K., et al. Production of a recombinant chitin oligosaccharide deacetylase from Vibrio parahaemolyticus in the culture medium of Escherichia coli cells. Biotechnology Letters. 29 (8), 1209-1215 (2007).
  14. Liu, J., et al. Identification and characterization of a chitin deacetylase from a metagenomic library of deep-sea sediments of the Arctic Ocean. Gene. 590 (1), 79-84 (2016).
  15. Pawaskar, G. M., Raval, K., Rohit, P., Shenoy, R. P., Raval, R. Cloning, expression, purification and characterization of chitin deacetylase extremozyme from halophilic Bacillus aryabhattai B8W22. Biotech. 11 (12), 515(2021).
  16. Raval, R., Simsa, R., Raval, K. Expression studies of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli Rosetta cells. International Journal of Biological Macromolecules. 104, 1692-1696 (2017).
  17. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).
  18. Yang, G., et al. Enzymatic modification of native chitin and chitin oligosaccharides by an alkaline chitin deacetylase from Microbacterium esteraromaticum MCDA02. International Journal of Biological Macromolecules. 203, 671-678 (2022).
  19. Amer, O. A., et al. Exploring new marine bacterial species, Alcaligenes faecalis Alca F2018 valued for bioconversion of shrimp chitin to chitosan for concomitant biotechnological applications. International Journal of Biological Macromolecules. 196, 35-45 (2022).
  20. Packiam, K. A. R., Ramanan, R. N., Ooi, C. W., Krishnaswamy, L., Tey, B. T. Stepwise optimization of recombinant protein production in Escherichia coli utilizing computational and experimental approaches. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (8), 3253-3266 (2020).
  21. Jayakumar, D., Sachith, S. K., Nathan, V. K., Rishad, K. S. M. Statistical optimization of thermostable alkaline protease from Bacillus cereus KM 05 using response surface methodology. Biotechnology Letters. 43 (10), 2053-2065 (2021).
  22. Balakrishnan, R., Mohan, N., Sivaprakasam, S. Application of design of experiments in bioprocessing: process analysis, optimization, and reliability. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 289-319 (2022).
  23. Papaneophytou, C. P., Kontopidis, G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli: A general review. Protein Expression and Purification. 94, 22-32 (2014).
  24. Tang, S. R., Somasundaram, B., Lua, L. H. L. Protein expression optimization strategies in E. coli: a tailored approach in strain selection and parallelizing expression conditions. Methods in Molecular Biology. 2406, 93-111 (2022).
  25. Nag, N., Khan, H., Tripathi, T. Strategies to improve the expression and solubility of recombinant proteins in E. coli. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , Academic Press. 1-12 (2022).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  27. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of staining sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels with coomassie brilliant blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  28. Etemadzadeh, M. H., Arashkia, A., Roohvand, F., Norouzian, D., Azadmanesh, K. Isolation, cloning, and expression of E. coli BirA gene for biotinylation applications. Advanced Biomedical Research. 4, 149(2015).
  29. Yin, L., Wang, Q., Sun, J., Mao, X. Expression and molecular modification of chitin deacetylase from Streptomyces bacillaris. Molecules. 28 (1), 113(2023).
  30. Hamedi, H., Moradi, S., Hudson, S. M., Tonelli, A. E., King, M. W. Chitosan based bioadhesives for biomedical applications: A review. Carbohydrate Polymers. 282, 119100(2022).
  31. Falak, S., Sajed, M., Rashid, N. Strategies to enhance soluble production of heterologous proteins in Escherichia coli. Biologia. 77 (3), 893-905 (2022).
  32. Shahzadi, I., et al. Scale-up fermentation of Escherichia coli for the production of recombinant endoglucanase from Clostridium thermocellum. Scientific Reports. 11 (1), 7145(2021).
  33. Ganjave, S. D., Dodia, H., Sunder, A. V., Madhu, S., Wangikar, P. P. High cell density cultivation of E. coli in shake flasks for the production of recombinant proteins. Biotechnology Reports. 33, 00694(2022).
  34. Wurm, D. J., et al. The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (20), 8721-8729 (2016).
  35. Gennari, A., et al. Recombinant production in Escherichia coli of a β-galactosidase fused to a cellulose-binding domain using low-cost inducers in fed-batch cultivation. Process Biochemistry. 124, 290-298 (2023).
  36. Mostovenko, E., Deelder, A. M., Palmblad, M. Protein expression dynamics during Escherichia coli glucose-lactose diauxie. BMC Microbiology. 11, 126(2011).
  37. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-32 (2014).
  38. Studier, F. W. Stable cultures and auto-induction for inducible protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-22 (2014).
  39. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  40. Selvaraj, S., Natarajan, K., Nowak, A., Murty, V. R. Mathematical modeling and simulation of newly isolated bacillus cereus M1GT for tannase production through semi-solid state fermentation with agriculture residue triphala. South African Journal of Chemical Engineering. 35 (1), 89-97 (2021).
  41. Ghahremanifard, P., Rezaeinezhad, N., Rigi, G., Ramezani, F., Ahmadian, G. Designing a novel signal sequence for efficient secretion of Candida antarctica lipase B in E. coli: The molecular dynamic simulation, codon optimization and statistical analysis approach. International Journal of Biological Macromolecules. 119, 291-305 (2018).
  42. Vuillemin, M., Malbert, Y., Laguerre, S., Remaud-Siméon, M., Moulis, C. Optimizing the production of an α-(1→2) branching sucrase in Escherichia coli using statistical design. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (12), 5173-5184 (2014).
  43. Sattari, F., Rigi, G., Ghaedmohammadi, S. The first report on molecular cloning, functional expression, purification, and statistical optimization of Escherichia coli-derived recombinant Ficin from Iranian fig tree (Ficus carica cv.Sabz). International Journal of Biological Macromolecules. 165, 2126-2135 (2020).
  44. Hajihassan, Z., Biroonro, N. Enhanced expression of recombinant activin A in Escherichia coli by optimization of induction parameters. Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran. 29 (2), 105-111 (2018).
  45. Rigi, G., Mohammadi, S. G., Arjomand, M. R., Ahmadian, G., Noghabi, K. A. Optimization of extracellular truncated staphylococcal protein A expression in Escherichia coli BL21 (DE3). Biotechnology and Applied Biochemistry. 61 (2), 217-225 (2014).
  46. Faust, G., Stand, A., Weuster-Botz, D. IPTG can replace lactose in auto-induction media to enhance protein expression in batch-cultured Escherichia coli. Engineering in Life Sciences. 15 (8), 824-829 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chitin DeacetylaseRecombinant ExpressionE Coli RosettaChitosan ProductionProcess OptimizationCentral Composite DesignResponse Surface MethodologyEnzyme KineticsLactose InductionFermentation Process
Video Coming Soon

Related Articles