W tym artykule opisana jest metoda pomiaru promieniowania in situ w żywej tkance. Praca ta zawiera szczegółowe informacje na temat budowy sond w skali mikro do różnych pomiarów promieniowania i natężenia promieniowania, zawiera wskazówki dotyczące montażu tkanki w celu charakterystyki promieniowania oraz przedstawia metody obliczeniowe do analizy uzyskanych danych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikrosonda radiometryczna wewnątrztkankowa do pomiaru promieniowania in situ w żywej tkance
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Organizmy wydają się nieprzezroczyste, głównie dlatego, że ich zewnętrzne warstwy tkankowe silnie rozpraszają się na padające światło; silnie absorbujące pigmenty, takie jak krew, zazwyczaj mają wąskie absorbancje, tak że średnia swobodna droga światła poza szczytami absorbancji może być dość długa. Ponieważ ludzie nie mogą widzieć przez tkanki, na ogół wyobrażają sobie, że tkanki takie jak mózg, tłuszcz i kości zawierają niewiele światła lub nie zawierają go wcale. Jednak światłoczułe białka opsyny ulegają ekspresji w wielu z tych tkanek, a ich funkcje są słabo poznane. Blask wewnątrz tkanki jest również ważny dla zrozumienia fotosyntezy. Na przykład gigantyczne małże są silnie wchłaniające, ale utrzymują gęstą populację glonów głęboko w tkance. Rozprzestrzenianie się światła przez systemy takie jak osady i biofilmy może być złożone, a zbiorowiska te mogą w znacznym stopniu przyczyniać się do produktywności ekosystemów. W związku z tym opracowano metodę konstruowania mikrosond optycznych do pomiaru natężenia promieniowania skalarnego (strumień fotonów przecinających punkt) i natężenia promieniowania w dół (strumień fotonów przecinający płaszczyznę prostopadłą) w celu lepszego zrozumienia tych zjawisk wewnątrz żywej tkanki. Technika ta jest również wykonalna w laboratoriach terenowych. Te mikrosondy są wykonane ze światłowodów ciągniętych na gorąco, które są następnie mocowane w ciągniętych szklanych pipetach. Aby zmienić akceptację kątową sondy, kula o wielkości 10-100 μm z żywicy epoksydowej utwardzanej promieniami UV zmieszanej z dwutlenkiem tytanu jest następnie mocowana do końca ciągniętego, przyciętego włókna. Sonda jest wprowadzana do żywej tkanki, a jej położenie jest kontrolowane za pomocą mikromanipulatora. Sondy te są w stanie mierzyć promieniowanie tkanek in situ w rozdzielczościach przestrzennych 10-100 μm lub w skali pojedynczych komórek. Sondy te zostały użyte do scharakteryzowania światła docierającego do komórek tłuszczowych i mózgowych 4 mm pod skórą żywej myszy oraz do scharakteryzowania światła docierającego na podobne głębokości w żywej, bogatej w glony tkance gigantycznych małży.
Wprowadzenie
Zaskakująco, zwierzęta lądowe i mieszkańcy płytkich oceanów mają wystarczająco dużo światła w swoim ciele do fizjologii wizualnej, a nawet fotosyntezy. Na przykład poziom światła w środku głowy myszy (poza silnymi pasmami absorbancji hemoglobiny) jest tłumiony o trzy lub cztery rzędy wielkości w stosunku do świata zewnętrznego. Jest to mniej więcej różnica między poziomem światła w pomieszczeniach i na zewnątrz. Tak więc nieprzezroczystość tkanki lub materiału spowodowana silnym rozpraszaniem nie jest tym samym, co nieprzezroczystość spowodowana silną absorpcją światła. Światło może rozchodzić się na duże odległości w systemie silnie rozpraszającym do przodu, podobnie jak światło rozchodzące się w systemach wodnych o wysokim stężeniu komórek i cząstek1. Ta obserwacja jest szczególnie istotna w świetle faktu, że białka opsyny są prawie wszechobecne w ekspresji we wszystkich tkankach wszystkich zwierząt. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób i gdzie światło jest tłumione i rozpraszane w żywej tkance. Jednak w przeciwieństwie do systemów wodnych, z żywą tkanką, niemożliwe jest zanurzenie instrumentu w słupie wody i uzyskanie pomiarów promieniowania i natężenia promieniowania, a także konieczna jest nowa technika.
Inne metody wcześniej używane do scharakteryzowania właściwości absorpcji i rozpraszania żywej tkanki obejmują pomiar sond odbicia tkanek i/lub całkowanie kul2,3, metody mikroskopowe, takie jak skaningowa mikroskopia konfokalna4, pomiar dyfuzji światła laserowego na powierzchni5, oraz techniki modelowania, takie jak transfer promieniowania Monte Carlo6. Wspomniane metody eksperymentalne często wymagają specjalistycznego, dużego i drogiego sprzętu lub szczegółowej wiedzy o strukturze tkanki i są generalnie ograniczone w swojej zdolności do charakteryzowania przestrzennej struktury światła głęboko w tkance.
Istnieją również podobne metody oparte na sondzie, które wykorzystują igłę podskórną do wprowadzenia światłowodu przez tkankę7,8,9. Z naszego doświadczenia wynika, że zmodyfikowane igły są skuteczne w nakłuwaniu tkanek, ale wymagają znacznej siły i na ogół rozrywają delikatne tkanki podczas przechodzenia przez gęsto upakowane komórki. Dlatego igły te zazwyczaj wymagają zabiegu chirurgicznego, aby wprowadzić więcej niż milimetr w warstwę tkanki. Opisana tutaj metoda, wykorzystująca nasmarowany, ciągniony szklany wspornik, jest w stanie przesuwać się między komórkami przy minimalnym zranieniu tkanki i bez dodatkowej operacji.
Ten manuskrypt przedstawia metodę zainspirowaną pracą Jorgensona i współpracowników nad pomiarem światła w matach glonów10,11, wykorzystując mikrosondy optyczne na podłożu szklanym i przenośną elektronikę, które są podatne na głębokie sondowanie gęstych tkanek oraz na budowę i zastosowanie w terenie. Sondy te mogą być skonstruowane w celu scharakteryzowania skalarnego natężenia promieniowania (światło uderzające w punkt ze wszystkich kierunków) i promieniowania opadającego (światło przecinające płaszczyznę poziomą) wewnątrz żywej tkanki w wysokich rozdzielczościach przestrzennych. Sondy te zostały pierwotnie opracowane do pomiaru transferu promieniowania w tkance fotosymbiotycznych gigantycznych małży12. Standardowe pomiary absorpcji i transmisji całej tkanki nie były wystarczające do scharakteryzowania wydajności fotosyntezy tkanki, ponieważ ma duże znaczenie, czy całe padające światło jest pochłaniane przez kilka komórek doświadczających dużej intensywności na powierzchni tkanki, czy wiele komórek doświadczających niskich intensywności w całej objętości tkanki. W drugim projekcie sondy te zostały wykorzystane do pomiaru natężenia promieniowania in vivo w mózgu myszy13,14, charakteryzując w ten sposób środowisko świetlne opsyn wyrażanych głęboko w mózgu. Te mikrosondy są zarówno małe, jak i wystarczająco czułe, aby zmierzyć natężenie promieniowania w tkance mózgowej myszy z nienaruszonym futrem, skórą i kośćmi i wykazać, że fizjologiczny poziom światła jest wystarczająco wysoki, aby stymulować głębokie operacje mózgu.
Ta mikro-optyczna sonda i zestaw pomiarowy mogą być przydatne dla badaczy potrzebujących określić ilościowo i scharakteryzować światło wewnątrz tkanki biologicznej, szczególnie dla bardziej szczegółowego zrozumienia fotosyntezy lub funkcji wizualnych pigmentów wyrażanych poza oczami. Metoda ta może być stosowana samodzielnie lub w połączeniu z innymi technikami, aby w pełni scharakteryzować właściwości optyczne i propagację światła w żywej tkance przy niskich kosztach, przy użyciu małego przenośnego sprzętu wbudowanego we własnym zakresie i z regulowanymi parametrami w zależności od zadania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie jest zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi Uniwersytetu Yale dotyczącymi badań nad kręgowcami i bezkręgowcami.
1. Budowa mikrosondy optycznej
- Budowa szklanej tulei, materiał: pipeta Pasteura, 5,75 cala (patrz tabela materiałów)
- Za pomocą montowanego zacisku krokodylkowego (tabela materiałów) zamontuj szklaną pipetę za szeroki koniec tak, aby zwężający się koniec był skierowany w dół w kierunku podłogi, a orientacja pipety była prostopadła do podłogi.
- Zawieś plastikowy uchwyt imadła o wadze 50 g (tabela materiałów) na stożkowym końcu pipety. Umieść podkładkę z taśmą izolacyjną między pipetą a uchwytem imadła, aby zapobiec poślizgowi.
- Podgrzej stożkową końcówkę pipety za pomocą małego palnika butanowego (tabela materiałów). Przyłóż płomień 1 cm powyżej uchwytu imadła. Trzymaj pochodnię tak, aby najjaśniejsza część płomienia znajdowała się 3 cm od szyby, a szklanka znajdowała się na czubku płomienia. Gdy długość pipety zwiększy się o około 5 cali, natychmiast usuń płomień.
- Użyj małych nożyczek lub noża do szkła, aby przyciąć wyciągnięty koniec pipety w miejscu, w którym nowa średnica wyciągniętego jest mniej więcej dwukrotnie większa niż średnica światłowodu użytego w następnej sekcji (patrz krok 1.2). Spiłuj wszelkie ostre obszary przyciętego końca za pomocą papieru karborundowego (Tabela materiałów). Spłucz powstałe małe odłamki szkła lub kurz za pomocą butelki z alkoholem izopropylowym, a następnie sprężonego powietrza.
- Ciągnięcie światłowodu (Rysunek 1D)
- Użyj żyletki, aby przeciąć światłowód, usuwając jedno złącze SMA ze światłowodu zakończonego SMA o średnicy 200 μm (tabela materiałów). Wytnij blisko jednego z zakończeń SMA. Następnie za pomocą żyletki usuń kolejne 5 cm osłony z tworzywa sztucznego i włókna szklanego, tak aby gołe światłowód był odsłonięty i wystawał z reszty nienaruszonego zespołu.
- Użyj palnika butanowego, aby spalić powłokę polimerowo-poliimidową z włókna szklanego. Spłucz izopropanolem. Wytrzyj gołe włókno szklane do czysta za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.
- Następnym krokiem jest zamontowanie gołego włókna, aby można je było również ciągnąć za pomocą płomienia. Zamontuj goły koniec światłowodu bezpośrednio w szczypcach clamp (Tabela materiałów) na stole lub krawędzi półki, pozwalając, aby zakończony SMA koniec światłowodu zwisał w kierunku podłogi. Dodaj ciężarki do ciągnięcia w postaci dwóch małych zacisków (łączna waga: 10 g) na osłoniętym końcu włókna około 12 cali w dół od miejsca, w którym gołe włókno światłowodowe jest trzymane w zacisku szczypiec.
- Aby wyciągnąć włókno, zacznij od włączonego płomienia palnika butanowego. Przy włączonym płomieniu trzymaj palnik butanowy w odległości 1 cm od gołego włókna, tak aby płomień był prostopadły do światłowodu i 3 cm w dół pionowo od miejsca, w którym szczypce clamp trzyma gołe światłowód. Pozwól włóknu rozciągnąć się, pociągnąć, oddzielić i opaść na podłogę.
- Sprawdź powstały ciągnięty koniec światłowodu. Delikatnie zeszlifuj wszelkie nierówności papierem karborundowym, wyczyść alkoholem izopropylowym i niestrzępiącą się chusteczką i osusz sprężonym powietrzem.
UWAGA: W tym momencie można użyć mikroskopu, aby scharakteryzować i udokumentować rozmiar i kształt wyciągniętego włókna. - Użyj pisaka do folii, aby przyciemnić boki włókna i zapobiec przedostawaniu się światła rozproszonego (Tabela materiałów). Delikatnie przeciągnij włókno w poprzek końcówki wstrzykiwacza, pozostawiając odsłonięty tylko niewielki obszar na końcówce.
- Montaż wciągniętego włókna wewnątrz szklanej tulei pipety (Rysunek 1A)
- Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, ostrożnie włóż stożkowe światłowód z kroku 1.2 do szerokiego końca zmienionej szklanej pipety z kroku 1.1 i przepchnij światłowód, aż ~1 mm gołego włókna będzie wystawać ze stożkowego końca pipety.
- Za pomocą taśmy izolacyjnej przymocuj osłonięty koniec światłowodu do szerokiego końca pipety.
- Umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na igłę o małej grubości (tabela materiałów). Ostrożnie przyłóż kroplę kleju do przyciętej krawędzi wyciągniętej pipety, unikając gołego końca wyciągniętego włókna.
- Pozwól, aby działanie kapilarne wchłonęło klej do pipety, zwilżając obszar między ścianką pipety a światłowodem. Poczekaj, aż klej utwardzi się przez co najmniej 15 minut przed przeniesieniem zespołu sondy.
- Modyfikacja końcówki światłowodu za pomocą kuli rozpraszającej (Rysunek 1C)
- Stwórz surowiec na końcówkę kuli rozpraszającej, mieszając kroplę kleju utwardzanego promieniami UV z proszkiem dwutlenku tytanu (tabela materiałów) przy ~1:1 v/v.
- Przymocuj sondę do mikromanipulatora z uchwytem pręta montażowego (tabela materiałów) tak, aby sonda znajdowała się w orientacji poziomej. Przygotować zbiornik roboczy materiału rozpraszającego, zanurzając końcówkę drutu lub igły w mieszaninie kleju/TiO2 przygotowanej powyżej w taki sposób, aby utworzyła się kropla kleju. Zamontuj drut lub igłę z kroplą w pobliżu końcówki sondy poziomej. Wygodnie jest to zrobić za pomocą zacisku krokodylkowego zamontowanego na ławce.
- Umieść kulę rozpraszającą na końcówce sondy. Za pomocą mikromanipulatora powoli i ostrożnie wepchnij końcówkę światłowodu sondy w kroplę kleju/TiO2. Następnie szybko wyjmij końcówkę z kleju. Powtórz dwa do trzech razy, aż na końcówce światłowodu osadzi się kulista kropla kleju o pożądanym rozmiarze.
UWAGA: Kula rozpraszająca będzie stabilna przy średnicach od dwóch do ośmiu razy większych niż średnica stożkowego światłowodu. Ostateczny optymalny rozmiar zależy od ostatecznego pożądanego zastosowania. - Utwardź kulę, podłączając zakończony SMA koniec światłowodu do źródła światła UV sprzężonego ze światłowodem (tabela materiałów).
UWAGA: Źródło światła użyte w tym badaniu miało moc 5,3 mW. Przy tej mocy zalecany czas utwardzania to co najmniej 12 godzin lub noc. Po utwardzeniu jest to dobry moment na scharakteryzowanie i zmierzenie rozmiaru końcowej końcówki sondy optycznej.
2. Przygotowanie i montaż tkanki do pomiarów optycznych (Rysunek 2 i Rysunek 3)
- Przygotuj naczynia do zamontowania próbek do eksperymentu. Podgrzej duży koniec pipety Pasteura za pomocą palnika butanowego, aby zrobić stempel i stopić otwór o średnicy 0,5 cm w dnie plastikowej szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm. Uszczelnij otwór na spodniej stronie naczynia taśmą izolacyjną lub taśmą laboratoryjną. Rób kilka na raz, aby zwiększyć wydajność.
- Przygotuj płynną żelatynę (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją na opakowaniu.
UWAGA: Komercyjna żelatyna bezsmakowa spożywcza ze sklepu spożywczego jest lepsza do tego celu niż żelatyna chemiczna od dostawców chemicznych, ponieważ żelatyna klasy chemicznej jest mniej optycznie przejrzysta i mniej niezawodna mechanicznie niż produkt spożywczy. - Przeprowadzić sekcję i przygotowanie tkanki, która zostanie użyta.
UWAGA: Z doświadczenia wynika, że każda płaska tkanka o grubości do 1 cm może być z powodzeniem zmierzona w tym eksperymencie przy użyciu dowolnej techniki preparacji odpowiedniej dla danego systemu. W przypadku tkanki małża olbrzymiego, stempel biopsyjny o średnicy 8 mm został użyty do wykonania płaskiego, regularnego okręgu tkanki małża do wykorzystania w eksperymencie12. W przypadku tego systemu można było skutecznie przygotować tylko jedną próbkę na raz, biorąc pod uwagę czas wymagany do wykonania pomiaru, aby upewnić się, że próbka jest nadal w stanie przypominającym życie pod koniec eksperymentu. - Napełnij dwie szalki Petriego z kroku 2.1 do jednej czwartej płynnej żelatyny i pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT) tuż przed żelowaniem. W jednym naczyniu umieść biopsję w poduszce z lepkiej żelatyny, która tworzy się w otworze w dnie naczynia. Użyj pipety Pasteura, aby delikatnie dodać żelatynę RT wokół biopsji, aż szalka Petriego będzie pełna (Ryc. 3). Napełnij drugie naczynie żelatyną, aby uzyskać ślepą próbkę.
- Naczynia na próbki należy wstawić do lodówki na około 10-30 minut, aż żelatyna będzie całkowicie utwardzona i lekko elastyczna w dotyku.
UWAGA: W chłodnym pomieszczeniu może to nie być konieczne; Podczas pracy w tropikach ten krok jest wymagany, aby w pełni utwardzić żelatynę. - Wykonanie mocowania do szalki Petriego na mikromanipulatorze (Rysunek 2)
- Wytnij kwadrat o wymiarach 6 cm x 6 cm o grubości 1/4 cala z pleksi (tabela materiałów).
- Wywierć lub stopij otwór w plastikowym kwadracie o tej samej średnicy co szalka Petriego (~35 mm). Upewnij się, że szalka Petriego dobrze przylega do tego otworu i jest utrzymywana na miejscu za pomocą tarcia. Dodaj taśmę do krawędzi naczynia, aby nieznacznie zwiększyć rozmiar i kontakt cierny.
- Wywierć lub stopij otwór o średnicy 1/4 cala w rogu plastikowego kwadratu. Użyj tego otworu, aby przymocować kwadrat do mikromanipulatora za pomocą 1/4 cala i.
- Przykryj plastikowy kwadrat czarną taśmą izolacyjną, aby zmniejszyć rozproszone światło docierające do sondy. Podobnie, użyj taśmy, aby utworzyć spódnicę wokół boków kwadratu rozciągającą się poniżej dna włożonej czaszy (>10 mm), aby zredukować rozproszone światło (Rysunek 2B).
- Użyj i odpowiedniego sprzętu, aby przymocować uchwyt szalki Petriego do mikromanipulatora, który pozwala na trójwymiarową regulację i dobrze rozdzielony ruch pionowy w zakresie większym niż grubość próbek (dobrym przykładem są część 1 i część 2 manipulatora wymienionego w Tabeli Materiałów). Przymocuj ten mikromanipulator do optycznej płytki stykowej.
3. Konfiguracja pomiaru dla biopsji tkanek
- Zamontuj źródło światła nad obszarem, w którym odbywa się pomiar, w taki sposób, aby światło było kolimowane, gdy dotrze do płaszczyzny, w której zostanie umieszczona próbka (Rysunek 2A). Na przykład przymocuj soczewkę kolimacyjną o średnicy 5 cm (tabela materiałów) do 5-milimetrowego światłowodu cieczy (tabela materiałów) i wznieś się ponad próbkę o >0,6 m za pomocą imadła i ramki przymocowanej do optycznej płytki stykowej (tabela materiałów). Następnie podłącz światłowód do szerokopasmowego źródła światła, takiego jak plazmowe źródło światła wymienione w Tabeli materiałów.
- Przymocuj sondę do pionowo zorientowanego uchwytu tak, aby była skierowana w stronę źródła światła. Przymocuj sondę za pomocą clamps, wąż clamps lub taśma do słupka stołu optycznego.
UWAGA: W eksperymencie z gigantycznymi małżami używany jest specjalnie zaprojektowany uchwyt na pręt, taki jak mikromanipulator wymieniony w Tabeli Materiałów. W tej pracy został on przymocowany za pomocą magnesów do optycznej płytki stykowej (Tabela materiałów). Dodatkowe stopnie swobody dla wyrównania uzyskane dzięki umieszczeniu zarówno sondy, jak i próbki na manipulatorach są wygodne, ale nie są wymagane. Uważaj, aby nie zacisnąć zbyt mocno na słupku, ponieważ może to spowodować uszkodzenie obudowy pipety. - Umieść manipulator próbki w pobliżu sondy zamontowanej pionowo. Użyj manipulatora próbki, aby wyregulować położenie stolika na próbkę w taki sposób, aby sonda była wyśrodkowana w otworze o średnicy 0,5 cm na dnie szalki Petriego. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć dotykania lub uderzania końcówką zamontowanej sondy.
UWAGA: Przydatny może być mikroskop stereoskopowy zamontowany na wysięgniku umieszczony nad obszarem próbki. W ten sposób można zobaczyć wyrównanie końcówki sondy, stolika i próbki od góry do dołu przed rozpoczęciem eksperymentu (Rysunek 2A). - Podłącz końcówkę światłowodu sondy zakończoną SMA do spektrometru światłowodowego USB (tabela materiałów) i podłącz spektrometr do komputera za pomocą USB.
4. Zbieranie danych
- Konfiguracja eksperymentalna
- Sonda i manipulatory powinny być ustawione dokładnie w wyrównanej pozycji, w której dane będą zbierane, jak w kroku 3.4.
- Użyj bawełnianego wacika lub drobnej igły, aby ostrożnie nałożyć niewielką ilość smaru silikonowego (tabela materiałów) na część sondy, która zostanie włożona do tkanki, aby zmniejszyć tarcie między bokami sondy a próbką tkanki. Ponownie nałóż smar silikonowy przed każdym pomiarem linii bazowej lub tkanki.
- Usunąć taśmę zakrywającą otwór w szalce Petriego z ślepą próbką i umieścić ją w uchwycie na próbkę (krok 2.7), upewniając się, że jest bezpiecznie przytrzymywana na miejscu przez tarcie.
- Użyj mikromanipulatora, aby opuścić próbkę na sondę. Pozwól, aby sonda weszła do żelatyny przez otwór na spodzie szalki Petriego. Kontynuuj, aż sonda znajdzie się około 5 mm od dna warstwy żelatyny.
- Włącz źródło światła. Korzystając z oprogramowania spektrometru, dostosuj czas integracji spektrometru, aż sygnał będzie jak najwyższy, ale nie nasycony. Ustaw liczbę uśrednionych skanów z zakresu od dwóch do pięciu, a wartość pikseli wygładzania na sześć. Użyteczne czasy integracji na tym etapie mogą wynosić od 1 do 50 ms dla tego planu bazowego.
- Zbieranie widm referencyjnych
- Zbierz ciemny pomiar.
- Po ustawieniu parametrów spektrometru dla ślepej próbki, odłącz włókno sondy od spektrometru i przykryj port nieprzezroczystą metalową osłoną dostarczoną ze spektrometrem.
- Uzyskaj ciemny pomiar ze spektrometru (często przy użyciu ikony ciemnej żarówki w graficznym interfejsie użytkownika), aby scharakteryzować szum spektrometru bez światła wejściowego. Zapisz ten pomiar zgodnie ze strategią pozyskiwania danych.
- Zbierz pomiar lampy. Podłącz ponownie światłowód sondy do spektrometru, poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje i uzyskaj inne widmo. Pomiar ten charakteryzuje światło docierające do sondy przez żelatynę przy braku tkanki.
- Zbierz ciemny pomiar.
- Zbieranie widm tkankowych
- Usuń taśmę ze spodu płytki Petriego i umieść ją w uchwycie na próbkę.
- Wyrównaj naczynie z próbką z sondą za pomocą trójwymiarowej manipulacji, tak aby biopsja tkanki była wyśrodkowana nad końcówką sondy.
- Nałóż żel silikonowy na sondę (patrz 4.1.2) i powoli opuść próbkę na sondę, aż końcówka sondy przejdzie przez żelatynę podtrzymującą próbkę tkanki i właśnie dostanie się do próbki tkanki.
UWAGA: Niektóre spektrometry i programy komputerowe umożliwiają monitorowanie wykrytego światła w czasie rzeczywistym. Użyj tego, aby określić, kiedy sonda wchodzi w tkankę. Intensywność widma gwałtownie się zmniejszy, gdy tylko końcówka sondy znajdzie się w bezpośrednim kontakcie z tkanką. - Sprawdzić, czy czas całkowania jest odpowiedni dla pomiaru, upewniając się, że mierzone widmo nie jest ani zbyt głośne, ani nasycone. W razie potrzeby zmień czas integracji.
- Za każdym razem, gdy czas integracji jest dostosowywany, wykonaj i zapisz nowy ciemny pomiar (krok 4.2.1). Nie zmieniaj liczby uśrednionych skanów ani liczby wygładzonych pikseli.
- Po znalezieniu odpowiednich parametrów pomiarowych należy wykonać pomiary i zapisać widmo.
- Przesuń próbkę w dół na określoną odległość za pomocą mikromanipulatora. W przypadku manipulatora użytego w tym badaniu każdy mały znacznik miał wartość 0,001 cala lub 25,4 μm. Próbka została przesunięta w dół przez pięć znaczników, czyli 127 μm, dla każdego pomiaru. Powtórz krok 4.3.4.
- Kontynuuj zapisywanie widm w każdej pionowej pozycji w tkance.
UWAGA: W przypadku opisanego tutaj systemu wymagane czasy integracji wahały się od 1 ms do 5 s dla pomiarów w pojedynczej próbce tkanki. W końcu końcówka sondy wyjdzie z górnej części tkanki i będzie tam widoczna (Rysunek 4A). Jest to ostateczny pomiar i charakteryzuje światło padające na górną część tkanki.
- Wczytywanie i przetwarzanie danych
- Użyj oprogramowania spektrometru, aby przekonwertować wszystkie zebrane widma (ciemne widma, widma lamp i pomiary tkanek) na rozdzielane pliki tekstowe.
- Korzystając z Matlaba lub wybranego języka kodowania, załaduj wszystkie pliki pomiarowe dla próbki. Dla każdego widma pomiaru tkanki odejmij ciemne widmo przez pasujący czas integracji, a następnie podziel je przez czas integracji.
UWAGA: W tym badaniu do ładowania i przetwarzania danych użyto skryptu Matlab (Plik uzupełniający 1). - Obliczyć procent światła padającego docierającego do każdej pozycji w tkance, dzieląc widma uzyskane za pomocą sondy wewnątrz tkanki przez widmo podstawowe uzyskane w pustej żelatynie.
UWAGA: Pomiar w górnej części tkanki (krok 4.3.6) powinien być bardzo podobny do pomiaru wyjściowego w żelatynie (krok 4.1) i po podzieleniu powinien być bliski 100%. W zależności od kontekstu doświadczalnego, jako odniesienie można użyć dowolnego widma lampy (widma z pustej żelatyny lub widma z samej górnej części tkanki). Jednak nadal ważne jest, aby zebrać widmo lampy przed rozpoczęciem eksperymentu. Dzieje się tak dlatego, że jeśli sonda pęknie lub eksperyment w inny sposób zakończy się niepowodzeniem przed dotarciem do górnej części tkanki, dane uzyskane przed uszkodzeniem są nadal użyteczne, co nie ma miejsca, jeśli nie ma odpowiadającego mu początkowego widma odniesienia lampy. - Wizualizacja danych; pomocne mogą być wykresy konturowe (Rysunek 4B).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół opisuje procedurę konstrukcji mikro-sondy optycznej, którą można wykorzystać do pomiaru natężenia promieniowania opadającego (światła docierającego do punktu z jednego kierunku) lub, po dodaniu rozpraszającej światło kulistej końcówki, do pomiaru natężenia promieniowania skalarnego (światła docierającego do punktu ze wszystkich kierunków). Sondy te umożliwiają pomiar natężenia promieniowania z rozdzielczością przestrzenną zbliżoną do skali pojedynczych komórek wewnątrz żywej tkanki. Protokół ten opisuj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje technikę systematycznego charakteryzowania środowiska optycznego za pomocą dużej objętości żywej tkanki z rozdzielczością przestrzenną w przybliżeniu w skali pojedynczych komórek. Ta niedroga, elastyczna i łatwa w użyciu metoda może być przydatna dla wszystkich badaczy badających propagację światła w żywych systemach. Z doświadczenia, w porównaniu z istniejącymi metodami7, sondy te wymagają nieco więcej praktyki i umiejętności do zbudowania, ale skutkują mniejszymi uszkodzenia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Sanaz Vahidinia za zapoznanie nas z kolegami dr Jorgensena i jego pracą. Badania te były wspierane przez granty z Army Research Office (nr W911NF-10-0139), Office of Naval Research (poprzez nagrodę MURI nr N00014-09-1-1053) oraz nagrodę NSF-INSPIRE NSF-1343158.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 "środek łożyska kulkowego skoku + D11 + A2: D31 + A2: A2: D31 | Edmond Optics | 37-935 | Część 2 manipulatora do opuszczania próbki |
| Arkusz akrylowy o grubości 1/4 cala | McMaster-Carr | 8505K754 | Do wykonania uchwytu na szalkę Petriego |
| 3/4" mini zacisk sprężynowy | Kowadło | 99693 | Użyj jako ciężarka do ciągnięcia światłowodu |
| 8 mm dziurkacz do biopsji | Fisher Scientific | NC9324386 | Do próbki tkanki |
| Palnik butanowy | McMaster-Carr | MT-51 | Źródło ciepła do ciągnięcia włókna i pipety Soczewka |
| kolimacyjna | Thorlabs | LLG5A1-A | Do kolimacji źródła światła przez płynny światłowód |
| Sprężone powietrze | McMaster-Carr | 7437K35 | Do suszenia wyciągniętego włókna i pipety |
| Klej cyjanoakrylowy - płynny | McMaster-Carr | 66635A31 | Do mocowania stożkowego końca włókna na górze ciągniętej pipety |
| Taśma izolacyjna | McMaster-Carr | 76455A21 | Do zabezpieczania włókna w pipecie i do zwiększania uchwytu do zacisków |
| Drobnoziarnisty papier karborundowy | McMaster-Carr | 4649A24 | Dobrze sprawdza się mały trójkąt na uchwycie noża exacto |
| Żelatyna | Knox | 10043000048679 | Do zabezpieczania biopsji tkanki na szalce |
| PetriegoSzklana pipeta Pasteura | Fisher Scientific | 13-678-20B | Jednorazowa szklana pipeta o długości 5,75" |
| Strzykawki insulinowe, igła 31G | BD | 320440 | Do nakładania kleju |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | Do czyszczenia ciągniętego włókna i pipety |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | Do wycierania pipety światłowodowej i szklanej do czysta |
| dioda LED sterownik | Thorlabs | LEDD1B | Do zasilania diod LED UV |
| Źródło światła do pomiarów | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Źródło białego światła o niskiej temperaturze do pomiarów |
| Liniowy metryczny stopień zębatkowy osi X-Y-Z | Edmond Optics | 55-023 | Część 1 manipulatora do obniżania próbki |
| Płynny światłowód | Thorlabs | LLG5-4T | Do źródła światła w pomiarach |
| Nóżki magnetyczne | Siskiyou | MGB 8-32 | Do użytku z paskami magnetycznymi |
| Paski magnetyczne | Siskiyou | MS-6.0 | Do montażu magnetycznego do płytki stykowej |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-osiowy manipulator z uchwytem na pipety |
| Nieprzezroczysty długopis, mały | WindowTint | TOP01 | Do nieprzezroczystej strony światłowodu, aby zapobiec przedostawaniu się światła rozproszonego do sondy |
| Płytka stykowa optyczna | Edmond Optics | 03-640 | Do stabilnego mocowania uchwytu sondy, próbki, mikroskopu i źródła światła |
| Światłowody | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | Około 4 włókna są dobre do posiadania |
| Plazmowe źródło światła | Thorlabs | HPLS345 | Do pomiarów radiometrii tkankowej |
| Plastikowy zacisk szczypiec | McMaster-Carr | 5070A11 | Szczypce zaciskowe używane do ciężaru w pipecie ciągnącej |
| Polistyrenowe szalki Petriego | Thomas scientific | 3488N10 | Uchwyty na próbki, wystarczająca objętość, aby utrzymać grubość próbki plus ~10 mm żelatyny na wierzchu |
| Żyletki | McMaster-Carr | 3962A3 | Do usuwania płaszcza ze światłowodu |
| Smar silikonowy | Thomas scientific | 1232E30 | Do zmniejszania tarcia między sondą a tkanką |
| Oprogramowanie do analizy danych | Matlab | Wybrane oprogramowanie do analizy danych | |
| Spektrometr + oprogramowanie spektrometru | Avantes | AvaSpec-2048L | Spektrometr może być dowolnej marki, ten jest kompatybilny ze światłowodami zakończonymi SMA i jest dostarczany z własnym oprogramowaniem do uruchamiania spektrometru |
| Dwutlenek tytanu w proszku | Sigma Aldrich | 718467-100G | Do tworzenia sfery |
| rozpraszaniaKlips stołowy | Toolour | Toolour Toolour0004 | Do trzymania pipety podczas ciągnięcia i do trzymania gotowych sond |
| Zaciski prętowe o działaniu spustowym | mcMaster-Carr | 51755A2 | Dobry do trzymania światłowodów podczas ciągnięcia lub utwardzania |
| Klej utwardzany promieniami UV | Delo Photobond | GB368 | Do wytwarzania kuli rozpraszającej |
| źródło światła UV | Thorlabs | M365FP1 | Źródło światła do utwardzania kleju w kuli rozpraszającej, to jest kompatybilne z włóknem sma, wyższa intensywność = krótszy czas utwardzania |
| Białe źródło światła LED | Thorlabs | MCWHF2 | Do charakteryzowania włókna ciągniętego i sfery rozpraszającej |
Bibliografia
- Williams, J. Optical properties of the ocean. Reports on Progress in Physics. 36 (12), 1567-1608 (2001).
- Solonenko, M., et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates. Physics in Medicine & Biology. 47 (6), 857-873 (2002).
- Vásquez-Elizondo, R. M., Enríquez, S. Light absorption in coralline algae (Rhodophyta): A morphological and functional approach to understanding species distribution in a coral reef lagoon. Frontiers in Marine Science. 4, 393(2017).
- Samatham, R. Optical properties of mutant versus wild-type mouse skin measured by reflectance-mode confocal scanning laser microscopy (rCSLM). Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041309(2008).
- Dimofte, A., Finlay, J. C., Zhu, T. C. A method for determination of the absorption and scattering properties interstitially in turbid media. Physics in Medicine & Biology. 50 (10), 2291-2311 (2005).
- Wang, L., Jacques, S. L., Zheng, L. MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 47 (2), 131-146 (1995).
- Wangpraseurt, D., Larkum, A. W. D., Ralph, P. J., Kühl, M. Light gradients and optical microniches in coral tissues. Frontiers in Microbiology. 3, 316(2012).
- Garcia-Pichel, F. A SCALAR IRRADIANCE FIBER-OPTIC MICROPROBE FOR THE MEASUREMENT OF ULTRAVIOLET RADIATION AT HIGH SPATIAL RESOLUTION. Photochemistry and Photobiology. 61 (3), 248-254 (1995).
- Rickelt, L. F. Fiber-Optic Probes for Small-Scale Measurements of Scalar Irradiance. Photochemistry and Photobiology. 92 (2), 331-342 (2016).
- Jorgensen, B. B. A simple fiber-optic microprobe for high resolution light measurements: Application in marine sediment. Limnology and Oceanography. 31 (6), 1376-1383 (1986).
- Kühl, M., Lassen, C., Jørgensen, B. B. Optical properties of microbial mats: Light measurements with fiber-optic microprobes. Microbial Mats. NATO ASI Series. 35, Springer. Berlin, Heidelberg. (1994).
- Holt, A. L., Vahidinia, S., Gagnon, Y. L., Morse, D. E., Sweeney, A. M. Photosymbiotic giant clams are transformers of solar flux. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140678(2014).
- Nayak, G., et al. Adaptive thermogenesis in mice is enhanced by opsin 3-dependent adipocyte light sensing. Cell Reports. 30 (3), 672-686 (2020).
- Zhang, K. X., et al. Violet-light suppression of thermogenesis by opsin 5 hypothalamic neurons. Nature. 585 (7825), 420-425 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
