Oznaczanie efektywności krycia haploidów u Saccharomyces cerevisiae

Summary

W tej pracy opisana jest solidna metoda ilościowego oznaczania efektywności krycia drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta jest szczególnie przydatna do ilościowego oznaczania barier przedzygotycznych w badaniach specjacji.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae jest szeroko stosowanym organizmem modelowym w genetyce, ewolucji i biologii molekularnej. W ostatnich latach stał się również popularnym organizmem modelowym do badania problemów związanych ze specjacją. Cykl życiowy drożdży obejmuje zarówno fazę rozmnażania bezpłciowego, jak i płciowego. Łatwość przeprowadzania eksperymentów ewolucyjnych oraz krótki czas generacji organizmu pozwalają na badanie ewolucji barier rozrodczych. Wydajność, z jaką dwa typy kojarzenia (a i α) łączą się w pary, tworząc diploidalny a/α, jest określana jako wydajność krycia. Każdy spadek skuteczności krycia między haploidami wskazuje na barierę przedzygotyczną. W związku z tym, aby określić ilościowo zakres izolacji reprodukcyjnej między dwoma haploidami, wymagana jest solidna metoda ilościowego określania wydajności krycia. W tym celu przedstawiono tutaj prosty i wysoce powtarzalny protokół. Protokół obejmuje cztery główne kroki, które obejmują łatanie haploidów na płytce YPD, mieszanie haploidów w równych liczbach, rozcieńczanie i posiewanie dla pojedynczych kolonii, a na koniec obliczanie wydajności na podstawie liczby kolonii na płytce odpadającej. Markery auksotroficzne są stosowane w celu wyraźnego rozróżnienia między haploidami a diploidami.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, powszechnie nazywany pączkującym drożdżem, to jednokomórkowy eukariont. Ma dwa typy krycia, A i α, i wykazuje zarówno bezpłciowe, jak i płciowe cykle rozrodcze. Typy kojarzenia a i α są haploidami i mogą dzielić się mitotycznie pod nieobecność innego typu kojarzenia w otaczającym środowisku, który reprezentuje bezpłciowy cykl drożdży. Kiedy dwa typy kojarzenia znajdują się w bliskiej odległości, przestają dzielić się mitotycznie i łączą się, tworząc komórkę diploidalną. Drożdże diploidalne mogą albo dzielić się mitotycznie w obecności składników odżywczych, albo uleg....

Protocol

UWAGA: Protokół zasadniczo obejmuje następujące kroki: (1) łatanie haploidów w siatkach efektywności krycia na płytce YPD, (2) mieszanie haploidów w równych ilościach po 24 godzinach inkubacji i dawanie mieszanym haploidom kilku godzin na kojarzenie się (7 godzin w tym badaniu), (3) posiewanie mieszanych komórek na YPD w celu izolowania pojedynczych kolonii po 7 godzinach w temperaturze 30 °C, i wreszcie (4) określenie liczby diploidów utworzonych za pomocą markerów auksotroficznych. Kroki te zostały szczegółowo omówione poniżej (zobacz również Rysunek 2).

1. Łatanie haploidów w siatkach efektywności kr....

Results

Kwantyfikacja efektywności krycia dwóch typów krycia
Opisany tutaj protokół został wykorzystany do ilościowego określenia efektywności krycia między dwoma szczepami drożdży - między SK1AMa i SK1AMα oraz między ScAMa i ScAMα (Rysunek 3A). W tych eksperymentach krycie między dwoma haploidami powtórzono co najmniej 12 razy. W każdym z powtórzeń eksperymentu co najmniej 100 kolonii zostało narzuconych na pożywkę z pod.......

Discussion

Kwantyfikacja efektywności krycia u S. cerevisiae jest niezbędna do przeprowadzenia badań związanych z genami zaangażowanymi w szlaki godowe lub zbadania wpływu środowiska zewnętrznego na zachowania godowe. W ciągu ostatnich dwóch dekad S. cerevisiae stał się również popularnym modelem do rozwiązywania problemów związanych ze specjacją 14,36,37,38. Obecność dwóch typów krycia .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar w proszku regularny do bakteriologii	SRL	19661 (0140186)
Siarczan amonu, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glukoza	Sigma Life Science	G8270
Szklane płytki Petriego	HiMedia	PW008	Wymiar 90 mm x 15 mm
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
Kwas L-asparaginowy	Sigma Life Science	A7219
Monochlorek L-histydyny monohydrat	Sigma Life Science	H5659
L-Izoleucyna	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucyna	Sigma Life Science	L8912
L-Lizyna	Aldrich	62840
L-Metionina	Sigma Life Science	M5308
L-Fenyloalanina	Sigma Life Science	P5482
L-Treonina	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrozyna	Sigma Life Science	T8566
L-Walina	Sigma Life Science	V0513
Krycie siatka			1 cm x 1,5 cm siatka prostokątna narysowana na płytce Petriego
Probówki do mikrowirówek	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Ekstrakt drożdżowy w proszku	HiMedia	RM027
Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów i siarczanu	amonuBD Difco	233520