Oznaczanie efektywności krycia haploidów u Saccharomyces cerevisiae

Summary

W tej pracy opisana jest solidna metoda ilościowego oznaczania efektywności krycia drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta jest szczególnie przydatna do ilościowego oznaczania barier przedzygotycznych w badaniach specjacji.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae jest szeroko stosowanym organizmem modelowym w genetyce, ewolucji i biologii molekularnej. W ostatnich latach stał się również popularnym organizmem modelowym do badania problemów związanych ze specjacją. Cykl życiowy drożdży obejmuje zarówno fazę rozmnażania bezpłciowego, jak i płciowego. Łatwość przeprowadzania eksperymentów ewolucyjnych oraz krótki czas generacji organizmu pozwalają na badanie ewolucji barier rozrodczych. Wydajność, z jaką dwa typy kojarzenia (a i α) łączą się w pary, tworząc diploidalny a/α, jest określana jako wydajność krycia. Każdy spadek skuteczności krycia między haploidami wskazuje na barierę przedzygotyczną. W związku z tym, aby określić ilościowo zakres izolacji reprodukcyjnej między dwoma haploidami, wymagana jest solidna metoda ilościowego określania wydajności krycia. W tym celu przedstawiono tutaj prosty i wysoce powtarzalny protokół. Protokół obejmuje cztery główne kroki, które obejmują łatanie haploidów na płytce YPD, mieszanie haploidów w równych liczbach, rozcieńczanie i posiewanie dla pojedynczych kolonii, a na koniec obliczanie wydajności na podstawie liczby kolonii na płytce odpadającej. Markery auksotroficzne są stosowane w celu wyraźnego rozróżnienia między haploidami a diploidami.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, powszechnie nazywany pączkującym drożdżem, to jednokomórkowy eukariont. Ma dwa typy krycia, A i α, i wykazuje zarówno bezpłciowe, jak i płciowe cykle rozrodcze. Typy kojarzenia a i α są haploidami i mogą dzielić się mitotycznie pod nieobecność innego typu kojarzenia w otaczającym środowisku, który reprezentuje bezpłciowy cykl drożdży. Kiedy dwa typy kojarzenia znajdują się w bliskiej odległości, przestają dzielić się mitotycznie i łączą się, tworząc komórkę diploidalną. Drożdże diploidalne mogą albo dzielić się mitotycznie w obecności składników odżywczych, albo ulegać mejozie w warunkach głodu azotu w obecności ubogiego źródła węgla, które nie ulega fermentacji, takiego jak acetate¹. Powoduje to powstawanie zarodników, które pozostają w stanie uśpienia, dopóki nie pojawią się sprzyjające warunki wzrostu. Cykl życiowy zostaje zakończony, gdy te zarodniki wykiełkują, a dwa typy haploidalne zostaną uwolnione z powrotem do puli haploidalnej^2,3 (Rysunek 1).

Łączenie komórek drożdży obejmuje kilka etapów, takich jak aglutynacja, tworzenie projekcji godowej lub "shmoo", po której następuje fuzja komórkowa i jądrowa^4,5. Dwa typy krycia a i α wytwarzają odpowiednio współczynnik a i α czynnik, aby zainicjować krycie. Czynniki te to feromony polipeptydowe, które wiążą się z receptorami (Ste2 i Ste3) obecnymi na powierzchni komórki o przeciwnym typie krycia⁵. Wiązanie feromonów z receptorami inicjuje szlak odpowiedzi feromonów, szlak transdukcji sygnału kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK)^6,7,8. Powoduje to zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G1, co prowadzi do metabolicznie aktywnej fazy stacjonarnej⁹. Komórki przestają wtedy dzielić się mitotycznie, a białka potrzebne do krycia są syntetyzowane. Ponieważ komórki haploidalne nie mogą się do siebie zbliżać, projekcja godowa lub "shmoo" jest skierowana w stronę partnera godowego. Kiedy komórki wchodzą w kontakt, ściana komórkowa ulega degradacji, a zawartość cytoplazmatyczna łączy się, co powoduje krzyżowanie się, tworząc komórkę diploidalną^10,11. Efektywność krycia między haploidami została wykorzystana jako miara specjacji w szczepach wyewoluowanych w laboratorium, a także między istniejącymi gatunkami¹².

Będąc prostym organizmem eukariotycznym, drożdże są modelem z wyboru dla dużej liczby pytań badawczych związanych ze złożonymi organizmami eukariotycznymi. Jedno z takich pytań wiąże się ze specjacją i ewolucją barier rozrodczych^13,14. W przypadku organizmów rozmnażających się płciowo gatunek jest definiowany przez koncepcję gatunku biologicznego (BSC) zaproponowaną przez Ernsta Mayra¹⁵. Zgodnie z tą koncepcją mówi się, że dwa osobniki populacji należą do dwóch różnych gatunków, jeśli nie mogą się krzyżować i są izolowane reprodukcyjnie. Załamanie płciowego cyklu rozrodczego (który obejmuje fuzję gamet w celu utworzenia zygoty, rozwój zygoty w potomstwo i osiągnięcie dojrzałości płciowej u potomstwa) prowadzi do izolacji reprodukcyjnej. Jak pokazano w Rysunek 1, cykl życiowy S. cerevisiae jest porównywalny do płciowego cyklu rozrodczego: a) fuzja dwóch typów krycia a i α jest podobna do fuzji gamet w organizmach rozmnażających się płciowo; b) zdolność diploida do przechodzenia podziału mitotycznego jest równoznaczna z rozwojem zygoty w potomstwo; oraz c) diploidalny zarodniknik poddawany jest porównywalny z procesem gametogenezy¹⁴.

Izolacja pre-zygotyczna występuje, gdy obserwuje się kojarzenie selektywne. Mając równe szanse na kojarzenie się z dwoma genetycznie różnymi typami a, typ α preferencyjnie kojarzy się z jednym z nich nad drugim lub odwrotnie¹⁴. W przypadku eksperymentów ewolucyjnych, w których haploidy ewoluowały w różnych środowiskach, obecność bariery przed kryciem można określić, przeprowadzając test kojarzenia. Spadek efektywności krycia w porównaniu z przodkiem wskazuje na ewolucję bariery przed kryciem. Izolacja postzygotyczna może powstać z powodu niezdolności diploidalnego do skutecznego podziału mitotycznego i/lub zarodnikowania w celu wytworzenia haploidalnych zarodników¹⁴. Można je określić ilościowo, mierząc odpowiednio tempo wzrostu diploidów i obliczając wydajność zarodnikowania. W związku z tym, aby zbadać ewolucję barier rozrodczych, potrzebne są solidne metody ilościowego określania (a) wydajności krycia, (b) mitotycznego wzrostu diploidu oraz (c) wydajności zarodnikowania diploidalnego. W niniejszej pracy przedstawiono solidną metodę ilościowego określania skuteczności kojarzenia szczepów drożdży.

W eksperymentach laboratoryjnych, jednym ze sposobów wykrywania występowania krycia jest użycie markerów auksotroficznych, które uzupełniają wymagania żywieniowe. Gdy dwa typy kojarzenia są auksotroficzne dla dwóch różnych aminokwasów, tylko komórka diploidalna utworzona w wyniku fuzji dwóch typów kojarzenia może rosnąć na pożywce z niedoborem obu aminokwasów. W związku z tym markery auksotroficzne są przydatne do wykrywania krycia zarówno jakościowo, jak i ilościowo. Test jakościowy wystarczy do zidentyfikowania typu krycia szczepu po mejozie¹⁶. Testy ilościowe są niezbędne, gdy ktoś jest zainteresowany identyfikacją zmniejszenia krycia podczas badania genów zaangażowanych w szlak kojarzenia^17,18. Ponadto, w związku z tym, że drożdże są coraz częściej wykorzystywane w badaniach specjacji, konieczny jest wygodny i powtarzalny test kojarzenia, ponieważ kwantyfikacja skuteczności krycia jest miarą bariery przedzygotycznej.

Efektywność krycia między dwoma typami krycia drożdży została wcześniej określona ilościowo^16,19,20. Większość poprzednio używanych metod ma podobny wygląd z kilkoma wariantami^{16,21,22,23,24,25}. Niektóre z nich używają kultur we wczesnej fazie logarytmicznej, podczas gdy kilka innych używa kultur szczepów haploidalnych w środkowej fazie logarytmicznej. Istnieją różnice w proporcjach, w których te dwa typy krycia są mieszane. Prawie wszystkie protokoły wykorzystują membranę nitrocelulozową. Zawiesiny obu typów krycia pobrane z wcześniej wyhodowanych kultur są mieszane i filtrowane na membranie nitrocelulozowej umieszczonej na płytce YPD. W jednym z wariantów protokołu haploidalna zawiesina jest bezpośrednio łatana na płycie YPD²¹. W eksperymentach dotyczących genów zaangażowanych w produkcję feromonów dwóch typów kojarzenia, feromony są dodawane zewnętrznie podczas tworzenia zawiesin dwóch typów kojarzenia²⁴.

Po inkubacji przez kilka godzin (zazwyczaj około 5 godzin) po wymieszaniu haploidów, komórki są zmywane z błony, rozcieńczane i powlekane na selektywnych podłożach. W jednej z wcześniejszych metod opisanych w 1973 roku, efektywność tworzenia lub kojarzenia zygoty została obliczona poprzez zliczenie liczby pączków, komórek niepączkujących i par kojarzących się pod mikroskopem za pomocą hemocytometru²⁶. Jednak większość metod opisanych później wykorzystuje markery auksotroficzne do rozróżnienia haploidów i diploidów. Efektywność krycia jest obliczana jako procent komórek diploidalnych w stosunku do liczby komórek diploidalnych i haploidalnych w puli komórkowej^16,21,23.

Jednakże, pomimo wielu doniesień o używaniu drożdży jako organizmu modelowego do badania specjacji, do tej pory w literaturze nie ma standardowego protokołu do obliczania efektywności krycia. Komórki w fazie logarytmicznej mogą nie być idealne do ilościowego określenia wydajności krycia. Podczas krycia cykl komórkowy dwóch haploidów zostaje zatrzymany, a zatem komórki podczas krycia nie dzielą się⁹. Ponieważ wiadomo również, że cykl komórkowy jest podobnie zatrzymany w komórkach w fazie stacjonarnej²⁷, użycie takich komórek może sprawić, że protokół będzie bardziej powtarzalny. Komórki fazy stacjonarnej można mieszać i układać na płytkach YPD (tj. w środowisku bogatym w składniki odżywcze) w celu krycia. Konwencjonalne procedury wymagają również membrany nitrocelulozowej i zmywania komórek, co sprawia, że proces jest uciążliwy i podatny na błędy w obsłudze. Ponadto stosowane do tej pory protokoły określają ilościowo skuteczność krycia w odniesieniu do jednego haploidu. Jednak przy pomiarze izolacji reprodukcyjnej skuteczność krycia określa się ilościowo dla określonej kombinacji haploidów, a nie dla pojedynczego haploidu.

Aby rozwiązać te problemy, tutaj przedstawiamy solidną metodę ilościowego oznaczania efektywności krycia drożdży, która jest wysoce powtarzalna i łatwa w użyciu. Co więcej, metoda ta oraz zastosowane w niej szczepy drożdży mogą być również wykorzystane w badaniach nad wpływem przepływu genów na ewolucję barier godowych.

W tym badaniu użyto dwóch różnych szczepów S. cerevisiae. Jeden ze szczepów wywodzi się z tła SK1; zostało to zmodyfikowane w naszym laboratorium poprzez dodanie markerów auksotroficznych w pobliżu locus MAT. Wynikowe genotypy haploidów przedstawiono w tabeli 1^28,29,30. W szczepie SK1 haploidalny miał gen TRP1 wstawiony w pobliżu locus MAT, a α haploidalny miał gen LEU2 wstawiony w pobliżu locus MAT. W szczepie ScAM geny TRP1 i URA3 zostały wprowadzone odpowiednio do haploidów a i α. Miejsce insercji znajdowało się w regionie ARS chromosomu III (Chr III: 197378..197609). Dla opisanego tutaj protokołu wystarczą markery auksotroficzne w dowolnym miejscu genomu. Jednak posiadanie markerów auksotroficznych w pobliżu locus MAT oznacza, że szczepy te mogą być również wykorzystywane do badań badających wpływ przepływu genów na specjację^31,32. Markery dodano w pobliżu locus MAT, aby zapobiec przetasowaniu markerów w wyniku rekombinacji. W związku z tym protokół ten może być wykorzystany do ilościowego określenia wydajności krycia w badaniach obejmujących specjację, a także do identyfikacji zmiany wydajności krycia podczas badania białek zaangażowanych w szlak kojarzenia.

Protocol

UWAGA: Protokół zasadniczo obejmuje następujące kroki: (1) łatanie haploidów w siatkach efektywności krycia na płytce YPD, (2) mieszanie haploidów w równych ilościach po 24 godzinach inkubacji i dawanie mieszanym haploidom kilku godzin na kojarzenie się (7 godzin w tym badaniu), (3) posiewanie mieszanych komórek na YPD w celu izolowania pojedynczych kolonii po 7 godzinach w temperaturze 30 °C, i wreszcie (4) określenie liczby diploidów utworzonych za pomocą markerów auksotroficznych. Kroki te zostały szczegółowo omówione poniżej (zobacz również Rysunek 2).

1. Łatanie haploidów w siatkach efektywności krycia

1. Ożywić haploidy a α z wywarów zamrażarskich poprzez smugowanie na płytce agarowej YPD (2% agar, 2% dekstroza, 1% pepton, 0,5% ekstraktu drożdżowego) i pozwól im rosnąć przez 48 godzin w temperaturze 30 °C, aby uzyskać izolowane pojedyncze kolonie.
2. Zaszczepić pojedyncze kolonie z płytki YPD w 5 ml pożywki YPD (2% dekstrozy, 1% peptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin z wytrząsaniem 250 obr./min. Po tym okresie inkubacji komórki znajdują się w stacjonarnej fazie wzrostu.
3. Narysuj siatkę efektywności krycia na świeżej płytce YPD. Narysuj siatkę jako prostokąt o wymiarach 1 cm x 1,5 cm podzielony na trzy pola tak, aby każde miało wymiary 1 cm x 0,5 cm, jak pokazano w Rysunek 2A.
4. Łatka 5 μl kultury YPD dwóch typów krycia po lewej i prawej prostokątnej (Rysunek 2B). Ta objętość odpowiada w przybliżeniu 5 x 10⁵ haploidalnym komórkom ułożonym w każdej sekcji. Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 30 °C.
   UWAGA: Celem siatki jest precyzyjne pomiary eksperymentalne (takie jak liczba komórek w eksperymencie). Rozmiar siatki jest na tyle mały, że można ją eksperymentalnie wykonać, ale na tyle duży, że można nią łatwo manipulować (jak podnoszenie komórek z siatki) i nie jest podatny na dryf lub zdarzenia losowe.

2. Mieszanie haploidów i krycie

UWAGA: Po 24 godzinach (Rysunek 2C), równa liczba komórek dwóch haploidalnych typów jest zeskrobywana z dwóch siatek, mieszana i układana w środkowym prostokącie (Rysunek 2D).

1. Aby wymieszać równą liczbę komórek, należy usunąć około 1/3 plastra umieszczonego w zewnętrznych pudełkach za pomocą sterylnej wykałaczki i ponownie zawiesić w 20 μl wody w sterylnej fiolce o pojemności 1,5 ml dla każdego z haploidów.
2. Rozcieńczyć 5 μl tej zawiesiny w 2 ml wody. Zmierzyć średnicę zewnętrzną tej rozcieńczonej zawiesiny za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm. Wymieszaj równą liczbę komórek z dwóch szczepów, w oparciu o wartość OD i liczbę komórek/ml w 1 OD dla tego konkretnego szczepu. Obliczyć objętość wymaganą do zmieszania i odessać ją z pozostałych 15 μl indywidualnej zawiesiny haploidalnej.
   UWAGA: Liczba komórek załatanych w środkowym prostokącie jest taka, że komórki tworzą monowarstwę. Biorąc pod uwagę, że komórka drożdży jest kulą o promieniu 2,58 μm³³, prostokątne pudełko o wymiarach 1 cm x 0,5 cm wymagałoby około 1,7 x 10⁶ komórek, aby utworzyć monowarstwę. Należy zwrócić uwagę na to, aby nie było fizycznego kontaktu między komórkami łatanymi do krycia a dwiema haploidalnymi siatkami komórkowymi. Ponieważ równe liczby każdego typu komórek haploidalnych muszą zostać wymieszane, z każdego szczepu dodaje się 8,5 x 10⁵ komórek. Liczba komórek jest obliczana na podstawie pomiarów OD, przy czym 1 OD przy 600 nm jest w przybliżeniu równoważne 1 x 10⁷ komórek³⁴. Na przykład, jeśli OD₆₀₀ zawiesiny haploidalnej wynosi 0,17, a α haploidalnej 0,11, można obliczyć liczbę komórek w 5 μl każdej zawiesiny haploidalnej. Aby zapewnić 8,5 x 10⁵ komórek każdego typu haploidalnego, miesza się 1,25 μl zawiesiny haploidalnej a i 1,93 μl zawiesiny haploidalnej α.
3. Dodać wymagane objętości obu haploidów do świeżej i sterylnej fiolki o pojemności 1,5 ml i dobrze wymieszać za pomocą pipety. Ostateczna objętość tej zawiesiny wynosi zwykle około 6–8 μl. Umieść tę zawiesinę w środkowej siatce. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 7 godzin, dając haploidom wystarczająco dużo czasu na połączenie (Rysunek 2E).

3. Posiewanie mieszanych komórek na agarze YPD

1. Po okresie inkubacji trwającym 7 godzin zeskrobać komórki ze środkowego prostokąta za pomocą wykałaczki lub końcówki pipety i rozcieńczyć w 2 ml sterylnej wody. Następnie rozprowadź zawiesinę komórkową na agarze YPD, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Aby określić współczynnik rozcieńczenia niezbędny do uzyskania pojedynczych kolonii, należy zmierzyć OD pierwszej probówki, do której dodaje się zeskrobane komórki. Dla każdego używanego typu/szczepu komórek należy określić konkretne współczynniki rozcieńczenia.
   UWAGA: Na przykład OD600 0,15 odpowiada 3 x 106 komórkom w zawiesinie o objętości 2 ml (biorąc pod uwagę 1 OD = 1 x 107 komórek/ml). Aby uzyskać kilkaset kolonii na płytce YPD, zawiesinę komórek rozcieńcza się seryjnie dwukrotnie w stosunku 1:20, a następnie do rozprowadzania stosuje się 100 μl końcowego rozcieńczenia.
2. Po posianiu inkubować płytki YPD w temperaturze 30 °C przez 36–48 godzin, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Upewnij się, że z każdego eksperymentu krytowego uzyskano kilkaset pojedynczych kolonii do badań przesiewowych, aby zapewnić wykrycie istotności statystycznej w danych (Rysunek 2F).

4. Badania przesiewowe w kierunku diploidów za pomocą markerów auksotroficznych

1. Określ, jaka frakcja uzyskanych kolonii jest diploidalna. Aby zidentyfikować diploidalne kolonie na płytce, przenieś pojedyncze kolonie, umieszczając je pojedynczo na podwójnej płytce drop-out (2% glukozy, 0,66% azotu, 0,05% mieszaniny aminokwasów z podwójnym drop-outem i 2% agaru) pozbawionych aminokwasów, dla których szczepy są auksotroficzne, jak pokazano na Rysunek 2G. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 48 godz.
   UWAGA: Kolonie można również przenieść na podwójną płytkę wysuwaną za pomocą poszycia repliki. W tym badaniu tryptofan i leucyna (trp⁻ leu⁻) zostały użyte do ilościowego określenia skuteczności kojarzenia szczepów SK1AM, a pożywka drop-out tryptofanu i uracylu (trp⁻ ura⁻) zastosowano dla szczepów ScAM. Tylko diploidalne kolonie rosną na podwójnej płytki opadającej, ponieważ mają oba markery auksotroficzne: geny TRP1 i LEU2 w szczepach SK1AM oraz geny TRP1 i URA3 w szczepach ScAM.
2. Dodatkowo nałóż smugi lub replikę na pojedyncze pożywki (trp− lub leu− lub ura−), aby określić ilościowo częstość występowania każdego z dwóch rodzajów haploidalnych w populacji.
3. Oblicz skuteczność krycia, η, w następujący sposób:
   Eq (1)
   gdzie liczba połączonych haploidów jest po prostu równa dwukrotności liczby diploidów zidentyfikowanych na podwójnej płytce wypadającej (ponieważ każdy diploid powstał w wyniku skrzyżowania dwóch haploidów). Całkowita liczba haploidów jest równa sumie liczby haploidów prążkowanych plus dwukrotności liczby prążkowanych diploidów.
   UWAGA: Na przykład, jeśli tylko 60 kolonii rośnie po smugowaniu/replikowaniu posiewu 100 kolonii na pożywce z podwójnym drop-outem, skuteczność krycia można określić ilościowo jako 75% (ponieważ 60 x 2 haploidy połączyły się, tworząc 60 diploidów, a 40 haploidów nie połączyło się).

Results

Kwantyfikacja efektywności krycia dwóch typów krycia
Opisany tutaj protokół został wykorzystany do ilościowego określenia efektywności krycia między dwoma szczepami drożdży - między SK1AMa i SK1AMα oraz między ScAMa i ScAMα (Rysunek 3A). W tych eksperymentach krycie między dwoma haploidami powtórzono co najmniej 12 razy. W każdym z powtórzeń eksperymentu co najmniej 100 kolonii zostało narzuconych na pożywkę z pod...

Discussion

Kwantyfikacja efektywności krycia u S. cerevisiae jest niezbędna do przeprowadzenia badań związanych z genami zaangażowanymi w szlaki godowe lub zbadania wpływu środowiska zewnętrznego na zachowania godowe. W ciągu ostatnich dwóch dekad S. cerevisiae stał się również popularnym modelem do rozwiązywania problemów związanych ze specjacją 14,36,37,38. Obecność dwóch typów krycia ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar w proszku regularny do bakteriologii	SRL	19661 (0140186)
Siarczan amonu, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glukoza	Sigma Life Science	G8270
Szklane płytki Petriego	HiMedia	PW008	Wymiar 90 mm x 15 mm
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
Kwas L-asparaginowy	Sigma Life Science	A7219
Monochlorek L-histydyny monohydrat	Sigma Life Science	H5659
L-Izoleucyna	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucyna	Sigma Life Science	L8912
L-Lizyna	Aldrich	62840
L-Metionina	Sigma Life Science	M5308
L-Fenyloalanina	Sigma Life Science	P5482
L-Treonina	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrozyna	Sigma Life Science	T8566
L-Walina	Sigma Life Science	V0513
Krycie siatka			1 cm x 1,5 cm siatka prostokątna narysowana na płytce Petriego
Probówki do mikrowirówek	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Ekstrakt drożdżowy w proszku	HiMedia	RM027
Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów i siarczanu	amonuBD Difco	233520