Artykuł metodologiczny

Generowanie szczurów z niedoczynnością przytarczyc za pomocą przytarczyc wspomaganej nanocząstkami węgla

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64611

⸱

14 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Cariology and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthognathic and TMJ Surgery, West China Hospital of Stomatology, 3Guangdong Province Key Laboratory of Stomatology, Hospital of Stomatology, Guanghua School of Stomatology, Sun Yat-Sen University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zwierzęcy model nabytej niedoczynności przytarczyc (HypoPT) jest kluczowy dla zrozumienia, jak HypoPT wpływa na homeostazę jonów mineralnych i do weryfikacji skuteczności nowych metod leczenia. W tym miejscu przedstawiono technikę generowania modelu szczura nabytej niedoczynności przytarczyc (AHypoPT) za pomocą paratyreoidektomii (PTX) przy użyciu nanocząstek węgla.

Streszczenie

Niedoczynność przytarczyc (HypoPT) jest rzadką chorobą obejmującą przytarczyce, która charakteryzuje się zmniejszonym wydzielaniem lub siłą działania parathormonu (PTH), co prowadzi do wysokiego poziomu fosforu w surowicy i niskiego poziomu wapnia w surowicy. HypoPT najczęściej wynika z przypadkowego uszkodzenia gruczołów lub ich usunięcia podczas operacji tarczycy lub innej operacji przedniej części szyi. Chirurgia przytarczyc/tarczycy stała się bardziej powszechna w ostatnich latach, wraz ze wzrostem występowania HypoPT jako powikłania pooperacyjnego. Istnieje pilna potrzeba stworzenia modelu zwierzęcego HypoPT, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw wpływu HypoPT na homeostazę jonów mineralnych i zweryfikować skuteczność terapeutyczną nowych metod leczenia. W tym przypadku opisano technikę tworzenia nabytego HypoPT u samców szczurów poprzez wykonanie paratyreoidektomii (PTX) przy użyciu nanocząstek węgla. Model szczurzy jest bardzo obiecujący w porównaniu z mysimi modelami niedoczynności przytarczyc. Co ważne, ludzki region wiązania receptora PTH ma 84,2% podobieństwo sekwencji do sekwencji szczura, co jest wyższe niż 73,7% podobieństwo dzielone u myszy. Co więcej, wpływ estrogenu, który może wpływać na szlak sygnałowy receptora PTH/PTHrP, nie został w pełni zbadany u samców szczurów. Nanocząstki węgla to znaczniki limfatyczne, które barwią węzły chłonne tarczycy na czarno, nie wpływając na ich funkcję, ale nie barwią przytarczyc, co ułatwia ich identyfikację i usunięcie. W tym badaniu poziomy PTH w surowicy były niewykrywalne po PTX, co skutkowało znaczną hipokalcemią i hiperfosfatemią. W ten sposób stan kliniczny pooperacyjnego HypoPT może być niezwykle reprezentowany w modelu szczurzym. PTX wspomagany nanocząstkami węgla może zatem służyć jako niezwykle skuteczny i łatwy do wdrożenia model do badania patogenezy, leczenia i rokowania HypoPT.

Wprowadzenie

1,2. Niedoczynność przytarczyc (HypoPT) objawia się zmniejszonym wydzielaniem lub funkcjonalną utratą PTH. Jest to rzadkie zaburzenie endokrynologiczne, z częstością występowania około 9-37 na 100 000 osobolat3,4,5. HypoPT charakteryzuje się zmniejszonym poziomem PTH i wapnia w surowicy, któremu towarzyszy zwiększony poziom fosforu w surowicy6,7. HypoPT jest klasyfikowany na podstawie jego przyczyny: nabyta niedoczynność przytarczyc (AHypoPT) lub idiopatyczna niedoczynność przytarczyc (IHypoPT)8. AHypoPT jest częściej spotykany w praktyce klinicznej; około 75% przypadków AHypoPT jest spowodowanych resekcją lub przypadkowym uszkodzeniem przytarczyc podczas operacji tarczycy lub innych operacji głowy i szyi. Inne przyczyny to radioterapia i chemioterapia nowotworów głowy i szyi oraz toksyczność leków1,8. Ulepszone metody diagnostyczne i wzrost badań przesiewowych w kierunku chorób związanych z tarczycą zwiększyły liczbę operacji chirurgicznych tarczycy. Doprowadziło to do odpowiedniego wzrostu liczby powiązanych powikłań przytarczyc9,10.

Łatwo znane modele zwierzęce o stabilnych cechach są potrzebne do lepszego zbadania AHypoPT i sprawdzenia skuteczności terapeutycznej nowych metod leczenia. Paratyreoidektomia (PTX) wykonywana na szczurach i myszach została opisana w poprzednich badaniach6,11; Jednak ze względu na niezwykle mały rozmiar przytarczyc i zmienność ich anatomicznego rozmieszczenia, wskaźnik sukcesu jest w praktyce stosunkowo niski. Tak więc tyreo-przytarczyce (TPTX) (tj. całkowite usunięcie tarczycy i przytarczyc) jest zwykle wykonywana w celu zapewnienia resekcji przytarczyc12. Jednak wynikający z tego niski poziom tyroksyny może komplikować badania z tym modelem zwierzęcym13. Modele HypoPT ustanowione innymi metodami, takimi jak stymulacja leków i edycja genów, nie mogą prawidłowo reprezentować najczęstszej patogenezy AHypoPT. Nasza grupa wcześniej używała modeli myszy z nokautem do oznaczania przytarczyc i umożliwienia usunięcia przytarczyc bez uszkadzania tarczycy i otaczających jej struktur anatomicznych14,15. Jednak ta metoda wykorzystuje transgeniczne modele myszy, które wymagają dłuższego czasu rozwoju ze względu na wymagania dotyczące krycia i hodowli.

Dlatego naszym celem było stworzenie łatwego do wygenerowania modelu AHypoPT. W tym badaniu opisano szczurzy model PTX przy użyciu znakowania nanocząstek węgla. Zawiesina nanocząsteczek węgla o stężeniu 50 mg/ml, która jest powszechnie stosowana w chirurgii tarczycy, równomiernie rozprowadza się w tarczycy po miejscowym wstrzyknięciu16. Gruczoły tarczycy stają się czarne, ale przytarczyce pozostają niezabarwione17, co wyraźnie odróżnia przytarczyce od gruczołów tarczycy i umożliwia wykonanie PTX bez wpływu na tarczycę. Ta metoda jest odpowiednia dla szczurów w różnym wieku. Wstrzyknięcie zawiesiny nanocząstek węgla jest bezpieczne i ma znikomy wpływ na funkcjonowanie tarczycy18. Model szczurzy PTX znakowany nanocząstkami węgla wygenerowany w tym badaniu wykazał znaczące fenotypy hipokalcemii i hiperfosfatemii podczas 4-tygodniowego okresu obserwacji. Tak więc ten model AHypoPT jest łatwy do ustalenia i ma powtarzalny fenotyp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Państwowym Kluczowym Laboratorium Chorób Jamy Ustnej, Uniwersytet Syczuański. Przed eksperymentem uzyskano pozwolenie od odpowiednich lokalnych agencji. Do niniejszego badania wykorzystano osiem 8-10 tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley (SD) o średniej wadze 200-250 g. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Pokarm i wodę dostarczano ad libitum przez cały okres doświadczalny.

1. Przedoperacyjne przygotowanie do generacji szczurów PTX wspomaganych nanocząstkami węgla

  1. Znieczulenie 8-10-tygodniowych szczurów za pomocą inhalacji izofluranu w ilości 2,0%-2,5%, a następnie wstrzyknięcia dootrzewnowego (i.p.) tribromoetanolu w stężeniu 10 ml / kg masy ciała. Zagwarantować wystarczającą głębokość znieczulenia, badając brak odruchu świetlnego źrenicy. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    UWAGA: Szczury w wieku 8-10 tygodni są rozpoznawane jako dorosłe szczury. Jednak ta metoda modelowania może być stosowana u szczurów w wieku 7 dni.
  2. Przygotuj znieczulone szczury SD do operacji, goląc sierść brzusznej części szyi w pozycji leżącej. Zdezynfekować obszar operacyjny za pomocą wacików powidonowo-jodowych (patrz Tabela Materiałów).
  3. Przykryj zwierzę obłożeniami chirurgicznymi (patrz Tabela materiałów) i odsłoń obszar operacyjny, dążąc do zminimalizowania zanieczyszczenia mikrobiologicznego.

2. Paratyreoidektomia (PTX)

  1. Zacznij od punktu środkowego między dwoma uszami i wytnij 2 cm nacięcie wzdłużnie w kierunku ogona za pomocą skalpela chirurgicznego. Wypreparuj kolejno powięź i warstwę tłuszczową za pomocą ostrych, zakrzywionych, ząbkowanych kleszczy.
  2. Oddziel mięśnie przytchawicze i odsłoń tchawicę za pomocą stosunkowo kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym w powiększeniu 4x-5x.
  3. Zlokalizuj lewy i prawy płat tarczycy w kształcie motyla z boku tchawicy.
  4. Wstrzyknąć 1 μl zawiesiny nanocząstek węgla (patrz tabela materiałów) pod błonę tarczycy za pomocą strzykawki o pojemności 10 μl ze igłą ze ściętym skosem 30 G. Po 5 minutach przepłukać obszar operacyjny solą fizjologiczną, aby oczyścić dodatkową zawiesinę nanocząstek węgla pokrywającą błonę tarczycy.
    UWAGA: Zalecanym punktem wstrzyknięcia jest mezjalna część płata tarczycy, która ma mniej naczyń krwionośnych. Zawiesina nanocząstek węgla jest powszechnie stosowana w chirurgii tarczycy ze względu na jej zdolność do wykrywania węzłów chłonnych. Zabarwienie tarczycy i pozostawienie przytarczyc niezabarwionych ułatwia identyfikację tych ostatnich.
  5. Sprawdź, czy tarczyca staje się, podczas gdy przytarczyce pozostają niezabarwione w ciągu ~5 minut. Obserwuj podświetlone przytarczyce w zwykłym świetle, używając światła mikroskopu stereoskopowego lub lampy stołowej.
    UWAGA: Zazwyczaj gryzonie mają dwa przytarczyce w kształcie kropli znajdujące się na lewej i prawej powierzchni tarczycy. Czasami dodatkowe przytarczyce mogą znajdować się dalej.
  6. Precyzyjnie wytnij niezabarwione przytarczyce za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych. Użyj sterylnych wacików do hemostazy lub gąbki żelatynowej w przypadku większego krwawienia.
  7. Zamknij mięśnie, warstwy tłuszczu i skórę, warstwa po warstwie, przerywanym poziomym szwem materaca za pomocą szwów poliglaktynowych 910 6-0 (patrz Tabela materiałów).
  8. W przypadku grupy pozorowanej należy wykonać wszystkie etapy przygotowania przedoperacyjnego i PTX z wyjątkiem kroku 2.6. Znieczulij szczury i oddziel tkanki nad tchawicą. Zlokalizuj przytarczyce, ale ich nie usuwaj. Przeprowadź rekonwalescencję pooperacyjną i obserwację razem ze szczurami z grupy PTX.

3. Rekonwalescencja pooperacyjna i obserwacja

  1. Po zabiegu należy umieścić szczury na termostatycznym kocu elektrycznym (37 °C), aby utrzymać temperaturę ciała. Chlorowodorek buprenorfiny w dawce 0,01 mg/kg należy wstrzykiwać podskórnie (s.c.) co 12 godzin jako środek przeciwbólowy pooperacyjny. Przenieś szczury do sterylnej klatki, gdy zaczną się poruszać i próbować się czołgać.
  2. Uważnie obserwuj szczury po operacji przez 2 godziny. Wróć szczury do pomieszczenia hodowlanego, obserwuj je rutynowo i rejestruj ich stan.
  3. Pobrać 10 μl krwi z żyły ogonowej 7 dni po zabiegu. Zmierz stężenie Ca2+ w surowicy, liczbę Pi w surowicy i PTH w surowicy za pomocą odpowiednich zestawów komercyjnych (patrz tabela materiałów). Udana paratyreoidektomia powoduje zmniejszenie stężenia zjonizowanego Ca2 + poziom 2 SD w surowicy niższe niż u szczurów operowanych pozorami (9,00 mmol/L, n = 16).
    UWAGA: Do analizy statystycznej użyto oprogramowania statystycznego i do tworzenia wykresów (patrz Spis materiałów). Test t Studenta został wykorzystany do porównania parametrów surowicy i moczu między grupami pozorowanymi i PTX. p < 0,05 uznano za statystycznie istotne. Stężenie Ca2+ i Pi w surowicy i moczu oraz mocznik i kreatyninę w surowicy mierzono za pomocą zestawów komercyjnych zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Stężenie C-telopeptydu kolagenu typu I i osteokalcyny w surowicy mierzono za pomocą dostępnych na rynku zestawów ELISA (patrz tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Położenie i liczba przytarczyc zostały początkowo zaobserwowane u szczurów pod mikroskopem sekcyjnym. Przed wstrzyknięciem nanocząstek węgla tarczyca miała przeświecający czerwony kolor, a przytarczyce były pod mikroskopem prawie nierozróżnialne (Rysunek 1A). Po wstrzyknięciu nanocząstek tarczyca została zabarwiona na czarno, podczas gdy przytarczyce pozostały niezabarwione (Rysunek 1B). Ostrożna sekcja jasnych przytarczyc pozwoliła na pozostawienie tarczycy nie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Doniesienia epidemiologiczne wskazują, że wykrywalność chorób tarczycy znacznie wzrosła, a liczba wykonywanych operacji z tym związanych odpowiednio wzrosła19,20. Częstość występowania pooperacyjnej niedoczynności przytarczyc wynosi około 7,6%8,21, podczas gdy zwiększona zachorowalność na nabytą niedoczynność przytarczyc spowodowała, że ta rzadka choroba zyskała większą uwagę badaczy. Dlatego szczególnie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant NSFC 81800928, finansowanie badań przez West China School/Hospital of Stomatology Sichuan University (No. RCDWJS2021-1) oraz grant Państwowego Kluczowego Laboratorium Chorób Jamy Ustnej SKLOD-R013.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% roztwór chlorku soduKelun Co. Sichuan, Chiny
10 i mikro; L 30G NanoFil StrzykawkaWPI
6-0 poliglaktyna 910 szew z igłąEthicon, IncJ510G
Test Liqui LiquiColorwapnia EKF0155-225Do analizy Ca2+
Zawiesina nanocząstek węgla do wstrzykiwańLummy, Chongqing, ChinyH200732461 ml: 50 mg
kreatyniny (Cr) Zestaw do oznaczania (oksydaza sarkozynowa)Jiancheng, Nanjing, ChinyC011-2-1Do analizy kreatyniny
Jednorazowy skalpelShinva, Chiny
Kleszcze biologiczneDumstar Shinva, Chiny
Mikro nożyczki sprężynowe do preparowaniaShinva, Chiny
MicroVue Szczur nienaruszony PTH ELISAImmunotopics30-2531Do pomiaru PTH w surowicy
szczuraUchwyt igłyShinva, Chiny
Test fosforu i liki-UVEKF0830-125Do analizy liczby Pi
Gaza warstwowaWeian Co. Henan, Chiny
Powidon-jodYongan Co.Ltd farmaceutyczny. Chengdu, Chiny
Prism 9.0 (oprogramowanie do statystyk i wykresów)GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USAhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Szczurzy C-telopeptyd kolagenu typu I (CTX-I) Zestaw ELISACUSABIO, Wuhan, ChinyCSB-E12776rDo analizy CTX-I
Zestaw ELISA Osteokalcyna / Białko Gla Kości (OT / BGP)CUSABIO, Wuhan, ChinyCSB-E05129rDo analizy osteokalcyny
Bezpieczne żyletki z pojedynczą krawędziąAmerican Safety Razor Company66-0089
Szczuryw wieku od 8 do 10 tygodni
Serwety chirurgiczneLiangyou Co. Sichuan, Chiny
Zestaw do oznaczania mocznikaJiancheng, Nanjing, ChinyC013-2-1Do analizy mocznika
Sprague-Dawley

Bibliografia

  1. Bilezikian, J. P., et al. Hypoparathyroidism in the adult: Epidemiology, diagnosis, pathophysiology, target-organ involvement, treatment, and challenges for future research. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (10), 2317-2337 (2011).
  2. Bilezikian, J. P. Hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (6), 1722-1736 (2020).
  3. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. Postsurgical hypoparathyroidism-Risk of fractures, psychiatric diseases, cancer, cataract, and infections. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2504-2510 (2014).
  4. Underbjerg, L., Sikjaer, T., Mosekilde, L., Rejnmark, L. The epidemiology of nonsurgical hypoparathyroidism in Denmark: A nationwide case finding study. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (9), 1738-1744 (2015).
  5. Astor, M. C., et al. Epidemiology and health-related quality of life in hypoparathyroidism in Norway. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (8), 3045-3053 (2016).
  6. Rodriguez-Ortiz, M. E., et al. Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (7), 1190-1197 (2012).
  7. Davies, B. M., Gordon, A. H., Mussett, M. V. A plasma calcium assay for parathyroid hormone, using parathyroidectomized rats. The Journal of Physiology. 125 (2), 383-395 (1954).
  8. Clarke, B. L., et al. Epidemiology and diagnosis of hypoparathyroidism. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 101 (6), 2284-2299 (2016).
  9. Liu, Y., Shan, Z. Expert consensus on diagnosis and treatment for elderly with thyroid diseases in China. Aging Medicine. 4 (2), 70-92 (2021).
  10. Sulejmanovic, M., Cickusic, A. J., Salkic, S., Bousbija, F. M. Annual incidence of thyroid disease in patients who first time visit department for thyroid diseases in Tuzla Canton. Materia Socio-Medica. 31 (2), 130-134 (2019).
  11. Liao, H. W., et al. Relationship between fibroblast growth factor 23 and biochemical and bone histomorphometric alterations in a chronic kidney disease rat model undergoing parathyroidectomy. PloS One. 10 (7), 0133278(2015).
  12. Russell, P. S., Gittes, R. F. Parathyroid transplants in rats: A comparison of their survival time with that of skin grafts. The Journal of Experimental Medicine. 109 (6), 571-588 (1959).
  13. Sakai, A., et al. Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 23 (1), 8-14 (2005).
  14. Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010(2017).
  15. Bi, R., et al. Diphtheria toxin- and GFP-based mouse models of acquired hypoparathyroidism and treatment with a long-acting parathyroid hormone analog. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (5), 975-984 (2016).
  16. Huang, Y., et al. Carbon nanoparticles suspension injection for photothermal therapy of xenografted human thyroid carcinoma in vivo. MedComm. 1 (2), 202-210 (2020).
  17. Zhang, R. J., Chen, Y. L., Deng, X., Yang, H. Carbon nanoparticles for thyroidectomy and central lymph node dissection for thyroid cancer. The American Surgeon. , (2022).
  18. Long, M., et al. A carbon nanoparticle lymphatic tracer protected parathyroid glands during radical thyroidectomy for papillary thyroid non-microcarcinoma. Surgical Innovation. 24 (1), 29-34 (2017).
  19. Li, Y., et al. Efficacy and safety of long-term universal salt iodization on thyroid disorders: Epidemiological evidence from 31 provinces of mainland China. Thyroid. 30 (4), 568-579 (2020).
  20. Powers, J., Joy, K., Ruscio, A., Lagast, H. Prevalence and incidence of hypoparathyroidism in the United States using a large claims database. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (12), 2570-2576 (2013).
  21. Zihao, N., et al. Promotion of allogeneic parathyroid cell transplantation in rats with hypoparathyroidism. Gland Surgery. 10 (12), 3403-3414 (2021).
  22. Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Experimental and Clinical Transplantation. , (2021).
  23. Jung, S. Y., et al. Standardization of a physiologic hypoparathyroidism animal model. PLoS One. 11 (10), 0163911(2016).
  24. Chen, W., Lv, Y., Xie, R., Xu, D., Yu, J. Application of lymphatic mapping to recognize and protect parathyroid in thyroid carcinoma surgery by using carbon nanoparticles. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 28 (24), 1918-1920 (1924).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Szczurzy model niedoczynno ci przytarczycoperacja z u yciem nanocz steczek w glatechnika paratyreidektomiipoziom parathormonu w surowicypomiar poziomu wapnia w surowicyszczurzy model hiperfosfatemiizachowanie tarczycyanaliza przebudowy ko cioperacja pod stereomikroskopemidentyfikacja przytarczyc

Powiązane artykuły