Obecny protokół opisuje ultrasonografię wysokiej częstotliwości do wizualizacji całej tarczycy myszy i monitorowania wzrostu anaplastycznego raka tarczycy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ultrasonografia o wysokiej rozdzielczości do analizy ortotopowych guzów ATC w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rak anaplastyczny tarczycy (ATC) wiąże się ze złym rokowaniem i krótką medianą czasu przeżycia, ale żadne skuteczne leczenie nie poprawia znacząco wyników. Genetycznie zmodyfikowane modele mysie, które naśladują postęp ATC, mogą pomóc naukowcom w badaniu metod leczenia tej choroby. Krzyżowanie trzech różnych genotypów myszy, TPO-cre / ERT2; BrafCA/wt; Opracowano transgeniczny model ATC Trp53Δex2-10/Δex2-10. Mysi model ATC został wywołany przez dootrzewnowe wstrzyknięcie tamoksyfenu z nadekspresją BrafV600E i delecją Trp53, a guzy powstały w ciągu około 1 miesiąca. Do zbadania inicjacji i progresji guza zastosowano ultradźwięki o wysokiej rozdzielczości, a poprzez pomiar rozmiarów guza uzyskano dynamiczną krzywą wzrostu. W porównaniu z obrazowaniem rezonansu magnetycznego (MRI) i tomografią komputerową, ultradźwięki mają zalety w obserwacji mysiego modelu ATC, takie jak to, że są nieinwazyjne, przenośne, w czasie rzeczywistym i bez ekspozycji na promieniowanie. Ultradźwięki o wysokiej rozdzielczości nadają się do pomiarów dynamicznych i wielokrotnych. Jednak badanie ultrasonograficzne tarczycy u myszy wymaga odpowiedniej wiedzy anatomicznej i doświadczenia. Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę wykorzystania ultradźwięków o wysokiej rozdzielczości do skanowania guzów w transgenicznym modelu ATC. Tymczasem wymieniono regulację parametrów ultradźwiękowych, umiejętności skanowania ultradźwiękowego, znieczulenie i rekonwalescencję zwierząt oraz inne elementy, które wymagają uwagi podczas procesu.
Wprowadzenie
Chociaż anaplastyczny rak tarczycy (ATC) stanowi mniej niż 2% nowotworów tarczycy, powoduje ponad 50% zgonów związanych z rakiem tarczycy rocznie. Mediana czasu przeżycia po rozpoznaniu ATC wynosi tylko około 6 miesięcy i nie są dostępne żadne metody leczenia, które znacząco poprawiałyby przeżycie1,2.
Rzadkość ATC utrudniła badania nad początkiem i agresywnym postępem choroby. Niedawno udostępniono genetycznie zmodyfikowane modele myszy, które naśladują chorobę, które dostarczają informacji na temat choroby i jej reakcji na możliwe metody leczenia3,4,5. Takie badania wymagają dokładnego obrazowania guza do pomiarów i monitorowania, które zwykle wykonuje się za pomocą rezonansu magnetycznego, tomografii komputerowej lub ultrasonografii o wysokiej rozdzielczości6,7. Ultrasonografia jest szeroko stosowana w narządach myszy. Ma przewagę nad obrazowaniem rezonansu magnetycznego i tomografią komputerową, ponieważ może być wykonywany w czasie rzeczywistym i nie naraża pacjenta na promieniowanie, a niezbędny sprzęt jest na tyle mały, że można go przenosić8,9. Jednak badania nad ciągłym monitorowaniem wzrostu ATC za pomocą ultradźwięków są rzadkie; Dlatego niniejsza praca bada użyteczność ultradźwięków w tym kontekście.
Tutaj przedstawiono protokół do korzystania z ultrasonografii o wysokiej rozdzielczości do dokładnego skanowania, monitorowania i mierzenia guzów w mysim modelu ATC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Niniejsze badanie zostało przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Syczuańskiego. TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; W tym badaniu użyto transgenicznych myszy Trp53Δex2-10/Δex2-10 10 (patrz tabela materiałów). W razie potrzeby etapy protokołu mogą być modyfikowane dla różnych gatunków zwierząt. Wykorzystano tu dwanaście myszy, w tym sześć samic i sześć samców, o średnim wieku 93 dni.
1. Przygotowanie eksperymentalne
- Włącz system ultrasonograficzny (patrz Spis materiałów) i utwórz nowy folder do przechwytywania obrazów i zbierania danych. Wybierz sondę liniową 40 MHz i kliknij wzór tkanki powierzchownej, aby aktywować przetwornik tkanek powierzchownych. Użyj "trybu B" do obrazowania tarczycy (Rysunek 1A).
UWAGA: Tryb B to podstawowy tryb obrazowania ultrasonograficznego. Wygląd obrazów ultrasonograficznych opiera się na fizycznych interakcjach dźwięku z tkankami w ciele. Obrazy w trybie B są tworzone jako szare obrazy11,12. - Trzymaj myszy w specjalnych klatkach ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Umieść klatkę na dodatkowym urządzeniu grzewczym (patrz Tabela materiałów), aby zapewnić termoregulację.
- Upewnij się, że wystarczająca ilość izofluranu w parowniku iO2 w zbiorniku. Jeśli zapasy są niewystarczające, wymień zbiorniki na nowe.
- Wyczyść platformę do obrazowania zwierząt sterylną solą fizjologiczną i włącz przycisk podgrzewania. Sprawdź, czy temperatura wynosi 38-40 °C przed umieszczeniem zwierzęcia na platformie (Rysunek 1C).
2. Przygotowanie zwierząt do obrazowania
- Włącz waporyzator izofluranu. Przenieś mysz z klatki do pudełka znieczulającego.
- Znieczulenie zwierzęcia za pomocą mieszaniny 1%-2% izofluranu z parownika i tlenu płynącego z prędkością 0,8 l/min.
- Nałóż krem do depilacji od klatki piersiowej do szyi, odczekaj 30 sekund, a następnie całkowicie zetrzyj krem i sierść. Dokładnie spłucz obszar i otaczające go futro ciepłą sterylną solą fizjologiczną.
- Umieść znieczulone zwierzę na podgrzewanej platformie. Zakryj pysk stożkiem nosowym podłączonym do wylotu znieczulenia (Rysunek 2A, B).
UWAGA: Mysz musi być całkowicie uspokojona w ciągu 1-2 minut. Jeśli zwierzę jest nadal aktywne, należy przeprowadzić przedłużoną indukcję izofluranu do momentu, gdy zwierzę przestanie wykazywać odruch odstawienia pedału. Upewnij się, że zwierzę oddycha stabilnie. - Podczas obrazowania monitoruj tętno myszy przez podgrzewaną platformę.
UWAGA: System obrazowania ultrasonograficznego wyposażony jest w monitor pracy serca. - Użyj taśmy klejącej, aby przymocować kończyny myszy do podgrzewanej platformy, tak aby zwierzę znajdowało się w pozycji leżącej. Upewnij się, że stożek nosowy jest stabilnie ustawiony ze stałym przepływem gazu znieczulającego (1.5 l/min).
- Chroń oczy, nakładając maść okulistyczną.
3. Obrazowanie guza
- Dostosuj system obrazowania, aby zoptymalizować rozdzielczość. Ustaw następujące parametry: wzmocnienie dwuwymiarowe, 25-30 dB; głębia obrazu, 10 mm; liczba stref ogniskowych, 3; i środek, 3-6 mm.
UWAGA: W niniejszym badaniu użyto sondy 40 MHz. Tryb B został określony do akwizycji danych. - Obficie nałóż żel ultradźwiękowy (patrz Tabela materiałów) na obszar gołej skóry.
- Przytrzymaj sondę i umieść ją w kontakcie z żelem ultrasonograficznym na klatce piersiowej, a następnie zeskanuj od klatki piersiowej w kierunku szyi, aby zlokalizować tarczycę (Rysunek 2C).
UWAGA: Delikatnie dociśnij podczas skanowania; Nadmierny nacisk na szyję zwierzęcia może powodować sapanie lub bezdech. Protokół ten został opracowany w oparciu o skanowanie ręczne, ale skanowanie zmechanizowane można również wykonać za pomocą maszyny do prowadzenia sondy, takiej jak platforma do obrazowania zwierząt, która porusza się wzdłuż osi x i y. - Skanuj w górę i w dół, aby zidentyfikować granice guza i ocenić jego rozmiar i kształt.
UWAGA: Zdrowa tarczyca zwykle pojawia się jako hipoechogeniczna, jednorodna struktura przed tchawicą. Guzy anaplastyczne powodują, że tarczyca wydaje się znacznie większa, co można łatwo zidentyfikować za pomocą skanowania szyi (Ryc. 3). - Zidentyfikuj guzy ATC na podstawie tchawicy i mięśni paskowych w zależności od lokalizacji anatomicznej i echa ultrasonograficznego.
UWAGA: Mięśnie paska znajdują się przed tarczycą i tchawicą, a także za tarczycą. Echo ultradźwiękowe mięśni taśmy wydaje się wyższe niż w ATC, podczas gdy tłumienie występuje za tchawicą13.- Na podstawie wycisku całego guza potwierdź wycinek obrazu o największej średnicy guza od lewej do prawej. Naciśnij przycisk zamrażania i zmierz średnicę guza przednio-tylnego i od lewej do prawej za pomocą suwmiarki ultradźwiękowej.
UWAGA: Średnica przednio-tylna musi być mierzona prostopadle do średnicy guza od lewej do prawej (Rysunek 4). Wielkość guza ATC obliczono, mnożąc średnicę przednio-tylną przez średnicę guza od lewej do prawej14. Ponieważ wielkość guzów po lewej i prawej stronie była niespójna, każda strona guza została obliczona osobno. Całkowitą wielkość guzów uzyskano przez dodanie guzów obustronnych. Rozmiary zostały zarejestrowane w celu obserwacji krzywej wzrostu ATC.
- Na podstawie wycisku całego guza potwierdź wycinek obrazu o największej średnicy guza od lewej do prawej. Naciśnij przycisk zamrażania i zmierz średnicę guza przednio-tylnego i od lewej do prawej za pomocą suwmiarki ultradźwiękowej.
- Zapisz nagranie jako pętlę cine, która ułatwia przeglądanie wybranych obrazów.
4. Odzyskiwanie zwierząt
- Po skanowaniu należy wytrzeć żel do ultradźwięków i usunąć taśmę krępującą z kończyn zwierzęcia.
- Umieść mysz na dodatkowym urządzeniu grzewczym (krok 1.2). Połóż zwierzę na boku (Rysunek 2D).
- Gdy mysz dojdzie do siebie (~5 min), przenieś ją z powrotem do klatki.
- Wyczyść system ultrasonograficzny, sondę i platformę za pomocą miękkiej szmatki i chusteczek nasączonych alkoholem izopropylowym lub aldehydem glutarowym.
- Wyłącz system obrazowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Średnia wielkość prawego ATC na początku badania wynosiła 4,867 mm2, a średnia wielkość lewego ATC wynosiła 5,189 mm2. Podczas czwartego pomiaru średnia wielkość prawego ATC wzrosła do 11,844 mm2, natomiast wielkość guza w lewym płacie wzrosła do 9,280 mm2. Całkowita wielkość ATC zwiększyła się z 10,057 mm2 do 15,843 mm2. W późniejszej fazie badania ATC rósł gwałtownie. W przypadku myszy oznaczonej jako „P92” (Tabela 1), wielkość guza podc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten wykorzystuje ultrasonografię o wysokiej rozdzielczości do analizy ortotopowych guzów ATC w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy. Model transgeniczny, z genotypem TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53Δex2-10/Δex2-10, został opracowany w naszym laboratorium. Zwierzęta mają nadekspresję BrafV600E i brakuje im Trp53; Dootrzewnowe wstrzyknięcie tamoksyfenu zwierzętom prowadzi do wzrostu guza po około 1 miesiącu10. Guzy rosną szybko i osiągają ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie nie otrzymało żadnego konkretnego grantu od publicznych, komercyjnych czy nienastawionych na zysk agencji finansujących.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Taśma klejąca | Winner | ||
| System anestezjologiczny | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt myszy | Współpraca z Instytutem Nauk Przyrodniczych, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, Chiny | ||
| Komora do indukcji znieczulenia | RWDlifescience | ||
| Waciki bawełniane | Winner Krem | ||
| depilacji | Veet | ||
| Elektryczny koc grzewczy | Petbee | ||
| Waporyzator izofluranowy | RWDlifescience | ||
| Rękawiczki medyczne | Winner | ||
| Ręczniki papierowe | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 myszy | Współpraca z Instytutem Nauk Przyrodniczych, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, Chiny | ||
| Trp53flox/wt mice | Współpraca z Instytutem Nauk Przyrodniczych, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, Chiny | ||
| Żel do ultrasonografii | Keppler | KL-250 | |
| Aparat ultrasonograficzny | VisualSonics | Vevo 3100 |
Bibliografia
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527(2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731(2017).
- Renault, G., et al. High-resolution ultrasound imaging of the mouse. Journal of Radiologie. 87, 1937-1945 (2006).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M. Basic principles of ultrasonic diagnosis. GEN. 39 (4), 283-289 (1985).
- Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35, 131-137 (2007).
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
