Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmu mlecznego przy użyciu podejścia łączącego metody statyczne i dynamiczne

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64619

⸱

9 grudnia 2022

 ,  ,  , 
1Département des Sciences des Aliments, Institut sur la Nutrition et les Aliments Fonctionnels, Université Laval

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje podejście łączące metody statyczne i dynamiczne do oceny skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmów w przemyśle mleczarskim. Podejście to może być również wykorzystane do testowania skuteczności nowych preparatów biologicznych lub chemicznych w zwalczaniu biofilmów.

Streszczenie

Obecność biofilmów w przemyśle mleczarskim jest poważnym problemem, ponieważ mogą one prowadzić do produkcji niebezpiecznych i zmienionych produktów mlecznych ze względu na ich wysoką odporność na większość procedur czyszczenia na miejscu () często stosowanych w zakładach przetwórczych. Dlatego konieczne jest opracowanie nowych strategii kontroli biofilmu dla przemysłu mleczarskiego. Protokół ten ma na celu ocenę skuteczności organicznych nadtlenokwasów (kwasu nadoctowego, perpropionowego i nadmlekowego oraz dostępnego w handlu środka dezynfekującego na bazie kwasu nadoctowego) w zwalczaniu biofilmów mlecznych przy użyciu kombinacji metod statycznych i dynamicznych. Wszystkie środki dezynfekcyjne zostały przetestowane na najsilniejszych bakteriach wytwarzających biofilm w pojedynczym lub mieszanym biofilmie przy użyciu testu minimalnego stężenia eliminacji biofilmu (MBEC), statycznej metody przesiewowej o wysokiej przepustowości. Czas kontaktu ze środkami dezynfekującymi w zalecanych stężeniach wynoszący 5 minut skutecznie wyeliminował zarówno pojedyncze, jak i mieszane biofilmy. Obecnie trwają badania mające na celu potwierdzenie tych obserwacji przy użyciu reaktora biofilmu Centrum Kontroli Chorób (CDC), dynamicznej metody naśladowania warunków in situ. Ten typ bioreaktora umożliwia wykorzystanie powierzchni ze stali nierdzewnej, która stanowi większość urządzeń i powierzchni przemysłowych. Wstępne wyniki badań reaktora wydają się potwierdzać skuteczność organicznych nadtlenokwasów w walce z biofilmami. Podejście łączone opisane w tym badaniu może być wykorzystane do opracowania i przetestowania nowych preparatów biologicznych lub chemicznych do zwalczania biofilmów i zwalczania mikroorganizmów.

Wprowadzenie

Przemysł mleczarski jest głównym sektorem przemysłowym na całym świecie, w tym w Kanadzie, gdzie istnieje ponad 10 500 gospodarstw mlecznych produkujących prawie 90 milionów hL mleka rocznie1. Pomimo rygorystycznych wymogów higienicznych nałożonych w przemyśle mleczarskim, w tym w zakładach przetwórczych, mleko stanowi doskonałą pożywkę dla mikroorganizmów, a co za tym idzie, produkty mleczne mogą zawierać mikroorganizmy, w tym mikroorganizmy psujące się lub chorobotwórcze. Te patogeny mogą powodować różne choroby; na przykład Salmonella sp. i Listeria monocytogenes mogą powodować odpowiednio zapalenie żołądka i jelit oraz zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych2. Mikroorganizmy powodujące psucie się mogą wpływać na jakość i właściwości organoleptyczne produktów mlecznych poprzez wytwarzanie gazów, enzymów zewnątrzkomórkowych lub kwasów3. Wygląd i kolor mleka mogą być również zmieniane, na przykład przez Pseudomonas spp.4.

Niektóre z tych mikroorganizmów mogą tworzyć biofilmy na różnych powierzchniach, w tym na stali nierdzewnej. Takie biofilmy umożliwiają utrzymywanie się i namnażanie mikroorganizmów na powierzchni urządzenia, a tym samym zanieczyszczenie produktów mlecznych5. Biofilmy są również problematyczne ze względu na ich zdolność do utrudniania wymiany ciepła i przyspieszania korozji sprzętu, co prowadzi do przedwczesnej wymiany sprzętu, a tym samym do strat ekonomicznych6.

Procedury czyszczenia na miejscu () pozwalają przemysłowi spożywczemu kontrolować rozwój mikroorganizmów. Procedury te polegają na sekwencyjnym stosowaniu wodorotlenku sodu, kwasu azotowego, a czasami środków odkażających zawierających kwas podchlorawy i kwas nadoctowy7,8. Chociaż kwas podchlorawy jest bardzo skuteczny przeciwko mikroorganizmom, reaguje również z naturalną materią organiczną, powodując powstawanie toksycznych produktów ubocznych9. Kwas nadoctowy nie wytwarza szkodliwych produktów ubocznych10; Jednak jego skuteczność w walce z biofilmami w przemyśle spożywczym jest bardzo zmienna10,< klasa SUP = 'xref'>11. Ostatnio inne nadtlenokwasy, w tym kwas perpropionowy i nadmlekowy, zostały przebadane pod kątem ich aktywności przeciwdrobnoustrojowej i wydają się być dobrą alternatywą dla kontroli wzrostu drobnoustrojów w biofilmach12,13.

Dlatego to badanie miało na celu ocenę skuteczności organicznych nadtlenokwasów (kwasów nadoctowego, perpropionowego i nadmlekowego oraz środka dezynfekującego na bazie kwasu nadoctowego) w zwalczaniu biofilmów mlecznych przy użyciu podejścia łączącego test minimalnego stężenia eliminacji biofilmu (MBEC), statyczną metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego oraz reaktor biofilmu Centrum Kontroli Chorób (CDC), dynamiczną metodę naśladującą in situ Warunki. Test MBEC jest dalej określany w protokole jako "płytki do mikromiareczkowania biofilmu". Przedstawiony tutaj protokół i reprezentatywne wyniki wskazują na skuteczność organicznych nadtlenokwasów i ich potencjalne zastosowanie w kontrolowaniu biofilmów mikrobiologicznych w przemyśle mleczarskim.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Praca opisana w niniejszym artykule wymaga laboratorium o 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego i została wcześniej zatwierdzona (numer projektu 119689) przez instytucjonalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego Université Laval.

UWAGA: Schemat blokowy na Rysunku 1 stanowi podsumowanie metodologii łączącej podejścia statyczne i dynamiczne, która została zastosowana do oceny skuteczności organicznych nadtlenowców w usuwaniu biofilmów.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Izolaty drobnoustrojów
    1. Włącz komorę z laminarnym przepływem powietrza (BSC) na 15 min przed użyciem i oczyść ją 70% (v/v) roztworem alkoholu.
    2. Po sterylizacji BSC umieść w niej fiolkę z izolatem drobnoustrojów do badania (Pseudomonas azotoformans lub Brevundimonas vesicularis w niniejszym badaniu), pętlę do szczepienia, probówkę 15 mL wypełnioną 10 mL sterylnego bulionu sojowo-tryptykowego (TSB) oraz mikser Vortex. Przed umieszczeniem w BSC wszystkie materiały zdezynfekuj alkoholem.
    3. Wymieszaj fiolkę z izolatem drobnoustrojów za pomocą miksera Vortex w celu homogenizacji kultury.
    4. Aseptycznie przenieś 20 µL izolatu drobnoustrojów do 10 mL sterylnego TSB w probówce 15 mL i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 16-24 h przy wytrząsaniu z prędkością 160 rpm.
      OSTRZEŻENIE: B. vesicularis musi być używany w laboratorium o 2. stopniu bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z wytycznymi dotyczącymi postępowania z organizmami patogennymi. Osoba przeprowadzająca badanie musi być odpowiednio przeszkolona i musi nosić okulary ochronne, rękawiczki oraz fartuch.
  2. Dezynfekcjanty
    1. Aby przygotować roztwór organicznego nadtlenku kwasu (60 mL), dodaj 24 mL nadtlenku wodoru i 36 mL kwasu (octowego, propionowego lub mlekowego) do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 mL. Następnie dodaj określoną objętość 10 M kwasu siarkowego (655 µL dla kwasu nadoctowego, 635 µL dla kwasu nadpropionowego lub 715 µL dla kwasu nadmlekowego). Delikatnie wstrząśnij kolbą, aby wymieszać składniki, i umieść ją w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C ustawionej w dygestorium chemicznym. Inkubuj kolbę przez 2 dni, delikatnie mieszając każdego ranka.
      UWAGA: Komercyjny środek dezynfekcyjny na bazie kwasu nadoctowego (patrz Tabela materiałów) został dostarczony bezpośrednio przez producenta.
      OSTRZEŻENIE: Dezynfekcjanty muszą być używane pod dygestorium chemicznym. Przez cały czas trwania eksperymentu należy nosić okulary ochronne i rękawiczki. Aby uzyskać więcej informacji na temat środków dezynfekcyjnych, zapoznaj się z odpowiednią Kartą Charakterystyki Substancji.
    2. Przeprowadź miareczkowanie nadtlenku wodoru zgodnie z poniższym opisem.
      1. Umieść pusty zlew o pojemności 300 mL na wadze analitycznej (patrz Tabela materiałów) i wytaruj wagę. Odważ około 0,23 g dezynfekcjantu do zlewka i zapisz dokładną masę. Dodaj do zlewka 100 g zimnego 1 N roztworu kwasu siarkowego, włóż mieszadło magnetyczne i umieść zlew na mieszalce magnetycznej.
      2. Mieszaj roztwór do całkowitej homogenizacji. Następnie dodaj do zlewka trzy krople roztworu wskaźnika ferroinowego (0,1% masy w H2O) i miareczkuj 0,1 N roztworem siarczanu ceru, aż roztwór zmieni kolor z łososiowo-różowego na jasnoniebieski. Zapisz objętość dodanego roztworu siarczanu ceru.
      3. Oblicz procentową zawartość nadtlenku wodoru, korzystając z następującego wzoru:
        Wzór na stężenie nadtlenku wodoru, %H2O2=(S×N×0.017/W)×100, równanie chemiczne. Równ. (1)
        gdzie S to objętość dodanego roztworu siarczanu ceru, N to normalność roztworu siarczanu ceru (0,1 N), W to masa próbki (~0,2300 g), a 0,017 = (1 mol H2O2/2 mol Ce) × (34,0147 g H2O2 /1 mol H2O)2 × (1 L/1,000 mL)
    3. Przeprowadź miareczkowanie organicznych nadtlenków kwasów zgodnie z poniższym opisem.
      1. Dodaj 20 mL 7,5% (w/v) roztworu jodku potasu do zlewka. Miareczkuj powoli 0,1 N roztworem tiosiarczanu sodu, aż niebieski kolor roztworu zacznie zmieniać się w blado-brązowy/pomarańczowy.
      2. Dodaj 2 mL roztworu skrobi (1% masy w H2O) do zlewka i miareczkuj 0,1 N roztworem tiosiarczanu sodu, aż roztwór zmieni kolor z czarnego na pomarańczowy. Zapisz objętość zużytego roztworu tiosiarczanu sodu.
      3. Oblicz procentową zawartość organicznego nadtlenku kwasu za pomocą następującego wzoru:
        Wzór na organiczny nadtlenek kwasu, metoda obliczania procentowego, schemat równania chemicznego. Równ. (2)
        gdzie T to objętość zużytego roztworu tiosiarczanu sodu, N to normalność roztworu tiosiarczanu sodu (0,1 N), W to masa próbki (~0,2300 g), a 0,038 = (1 mol CH3COOOH/1 mol I2) × (1 mol I2/2 mol S2O3) × (76,06 g/1 mol CH3COOOH) × (1 L/1,000 mL)
        UWAGA: Powtórz krok 1.2.2 i krok 1.2.3 na dwóch kolejnych próbkach, aby każdy test przeprowadzić w trzech powtórzeniach.

2. Tworzenie biofilmów pojedynczych i mieszanych

  1. Mikropłytki do badania biofilmu
    1. Wymieszaj na wortexie probówkę zawierającą kulturę bakteryjną (20 µL szczepu + 10 mL pożywki TSB, przygotowaną w kroku 1.1.4). Przeprowadź rozcieńczenia seryjne i wysiej na agar sojowy z tryptonem (TSA), aby oznaczyć liczbę komórek bakteryjnych (jtk) w kulturze nocnej. Następnie aseptycznie przenieś 100 µL kultury do 10 mL sterylnej pożywki TSB (aby uzyskać końcowe stężenie około 2 x 107 jtk/mL).
      UWAGA: W przypadku analizy z użyciem bioreaktora, objętość 100 µL izolatu drobnoustrojowego przenosi się do 100 mL sterylnej pożywki TSB.
    2. Wymieszaj probówkę na wortexie. Dla każdego rodzaju bakterii przenieś rozcieńczoną kulturę bakteryjną na mikropłytkę do badania biofilmu (150 µL na studzienkę) w trzech powtórzeniach, używając pipety wielokanałowej. Do trzech nowych studzienek wlej 150 µL pożywki TSB, które będą służyć jako kontrole. Inkubuj mikropłytkę do badania biofilmu (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 30 °C przez 24 h bez wytrząsania.
      UWAGA: W przypadku analiz biofilmu mieszanego dodaj 75 µL każdej zawiesiny, aby uzyskać objętość całkowitą 150 µL. Mikropłytka do badania biofilmu posiada w pokrywach kołki, na których tworzą się biofilmy.
  2. Bioreaktor
    1. Wyczyść i wysusz na powietrzu elementy bioreaktora (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie przygotuj reaktor zgodnie z poniższym opisem.
      1. Najpierw umieść płaskie mieszadło wewnątrz szklanego zlewka 1 L (bioreaktora), który jest przymocowany do uchwytu za pomocą pręta magnetycznego, i utrzymuj zestaw w pozycji pionowej za pomocą plastikowego pręta przymocowanego do wewnętrznej strony pokrywy bioreaktora.
      2. Za pomocą śrubokręta umieść kupony lub szkiełka ze stali nierdzewnej (patrz Tabela materiałów) na ich polipropylowych prętach i wsuń je w otwory w pokrywie, nie umieszczając pinów wyrównawczych w wycięciach, aby umożliwić ucieczkę pary podczas sterylizacji.
      3. Przykryj wszystkie otwory wentylacyjne bioreaktora folią aluminiową i owiń folią aluminiową pozostałe elementy wyposażenia, mianowicie przewody L/S 18 (ID = 7.9 mm) i L/S 16 (ID = 3.1 mm), szklany tłumik przepływu, nakrętki pojemników, śrubokręty, pęsety oraz filtry 0.2 µm.
        UWAGA: Wsuń rurkę silikonową (patrz Tabela materiałów) w króciec znajdujący się na wewnętrznej powierzchni nakrętki pojemnika z pożywką.
      4. Autoklawuj zestaw bioreaktora w cyklu suchym w temperaturze 121 °C przez 20 min.
    2. Przeprowadź formowanie biofilmu w bioreaktorze w trybie okresowym (pierwszy etap).
      1. W komorze BSC podłącz jeden koniec przewodu L/S 18 do wylewki wylotowej bioreaktora, a drugi koniec pozostaw owinięty folią aluminiową w celu zachowania sterylności.
      2. Wyjmij jeden uchwyt kuponu lub szkiełka z pokrywy bioreaktora i umieść go w sterylnej probówce 50 mL. Następnie, przez otwór, w którym znajdował się pręt, nalej do zlewka bioreaktora 340 mL pożywki TSB o stężeniu 300 mg/L, używając pipety serologicznej 50 mL.
      3. Zaszczep pożywkę w bioreaktorze, dodając 1 mL roztworu bakteryjnego (~108 jtk/mL P. azotoformans) za pomocą pipety 5 mL przez ten sam otwór co wcześniej, a następnie ponownie umieść pręt w jego pierwotnej pozycji. Ustaw pręty już znajdujące się w otworach pokrywy tak, aby piny pasowały do odpowiednich wycięć.
      4. Umieść bakteryjny filtr napowietrzający 0.2 µm na końcu rurki o najmniejszej średnicy, znajdującej się na pokrywie bioreaktora. Druga rurka o tej samej średnicy pozostaje na stałe zamknięta metalową nakrętką śrubową lub silikonowym korkiem zapewniającym szczelne zamknięcie.
      5. Umieść bioreaktor na 24 h na płycie grzewczej ustawionej na 30 °C i mieszaj z prędkością 130 rpm.
        UWAGA: W przypadku formowania biofilmu wielogatunkowego użyj równych objętości różnych kultur bakteryjnych, aby uzyskać całkowitą objętość 1 mL dla inokulum.
    3. Przeprowadź formowanie biofilmu w bioreaktorze w trybie przepływu ciągłego (drugi etap).
      1. Umieść w komorze BSC gąsior zawierający 18 L sterylnej wody destylowanej i dodaj 2 L pożywki TSB o stężeniu 1,000 mg/L, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mg/L.
      2. Przykryj pojemnik sterylną nakrętką, do której podłączone są dwie rurki. Pierwsza to rurka silikonowa zamocowana na wewnętrznej stronie nakrętki, służąca do pompowania pożywki. Druga rurka (L/S 16) jest podłączona do portu zewnętrznego, umożliwiając przepływ cieczy w stronę bioreaktora. W drugiej rurce na pokrywie pojemnika z pożywką umieść filtr 0.2 µm.
      3. Podłącz tę drugą rurkę do pompy perystaltycznej, a drugi koniec połącz z szklanym tłumikiem przepływu, który następnie wsuń do większej rurki na pokrywie bioreaktora.
      4. Użyj innego gąsiora 20 L do zbierania effluentu z bioreaktora. Podłącz koniec rurki połączonej z wylewką wylotową bioreaktora do nakrętki pojemnika na odpady. W rurce dostępnej na pokrywie tego pojemnika umieść filtr 0.2 µm.
      5. Uruchom pompę perystaltyczną z prędkością przepływu 11.3 mL/min i pozostaw system w działaniu przez 24 h.
        UWAGA: Prędkość przepływu (11.3 mL/min) pożywki lub mleka używanego podczas formowania biofilmu w bioreaktorze została określona poprzez podzielenie 340 mL (co odpowiada objętości cieczy w reaktorze) przez czas przebywania wynoszący 30 min.
    4. Odzyskaj biofilm bakteryjny.
      1. Wyłącz pompę perystaltyczną oraz zatrzymaj mieszanie i ogrzewanie bioreaktora.
      2. Ostrożnie wyjmij każdy pręt z bioreaktora i wypłucz kupony lub szkiełka 3x w 40 mL PBS, aby usunąć bakterie planktoniczne. Następnie, za pomocą odpowiedniego śrubokręta, przenieś kupony lub szkiełka do sterylnych stożkowych probówek 50 mL zawierających 40 mL PBS. Wymieszaj probówki na wortexie przez 30 s, przenieś je na statyw umieszczony w kąpieli sonikacyjnej i poddaj sonikacji w częstotliwości 40 kHz przez 30 s (wymagana moc 110 W). Powtórz tę operację 3x.
      3. Zbierz 40 mL zawiesin biofilmu do sterylnych stożkowych probówek 50 mL, a następnie wypłucz kupony lub szkiełka 2 mL sterylnego roztworu PBS. Odzyskaj tę ciecz płuczącą i dodaj ją do już zebranych zawiesin biofilmu.
    5. Oznacz liczbę żywych bakterii w biofilmie: Z otrzymanej zawiesiny biofilmu wykonaj 10-krotne rozcieńczenia seryjne, a następnie wysiej 100 µL rozcieńczeń 10−5 i 10−6 na TSA w trzech powtórzeniach. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 24 h. Policz liczbę kolonii obecnych na płytkach agarowych i oblicz gęstość bakteryjną na kuponach i szkiełkach (żywe bakterie sesyjne) zgodnie z normą ASTM E2562-1714, stosując następujący wzór:
      Wzór na liczbę drobnoustrojów, skala logarytmiczna, dla standaryzacji jednostek tworzących kolonie, równanie. Równ. (3)
      gdzie X to liczba jednostek tworzących kolonie (CFU), B to objętość wysiana (0.1 mL), V to objętość, w której zawieszony jest biofilm (roztwór zapasowy), A to powierzchnia kuponu lub szkiełka pokryta biofilmem, a D to czynnik rozcieńczenia.

3. Ilościowa ocena skuteczności organicznych nadtlenokwasów w usuwaniu biofilmów

  1. Płytki mikrotitracyjne do biofilmu
    1. Wlej 200 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (1x PBS) do trzech dołków płytki 96-dołkowej.
    2. Przenieś pokrywkę płytki do biofilmu, na której kołkach utworzyły się biofilmy, do płytki 96-dołkowej zawierającej PBS na 10 s, aby wypłukać biofilmy i usunąć bakterie planktoniczne.
    3. Przygotuj środki dezynfekcyjne w wymaganych stężeniach (np. 25 ppm, 50 ppm, 500 ppm, 1 000 ppm, 5 000 ppm, 10 000 ppm i 25 000 ppm substancji czynnej).
      UWAGA: Wszystkie rozcieńczenia należy przygotować aseptycznie, używając sterylnej wody destylowanej.
    4. Wlej 200 µL każdego stężenia środka dezynfekcyjnego do dołków nowej płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej w trzech powtórzeniach. Przenieś pokrywkę płytki mikrotitracyjnej do biofilmu na tę 96-dołkową płytkę zawierającą środki dezynfekcyjne i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez wymagany czas ekspozycji.
    5. Wlej 200 µL neutralizującego bulionu Dey-Engley do dołków nowej płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej. Przenieś pokrywkę płytki mikrotitracyjnej do biofilmu na płytkę 96-dołkową zawierającą bulion neutralizujący. Uszczelnij płytkę mikrotitracyjną parafilmem i umieść ją w myjce ultradźwiękowej przy 40 kHz na 30 min.
    6. Po 30 min wyjmij płytkę mikrotitracyjną z myjki i usuń parafilm. Przenieś 100 µL z pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej zawierającej biofilmy oddzielone w wyniku sonikacji do pierwszego rzędu nowej płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej.
    7. Wlej 180 µL sterylnego 1x PBS do dołków nowej płytki 96-dołkowej (przygotowanej w kroku 3.1.6), z wyjątkiem pierwszego rzędu. Przenieś 20 µL roztworu biofilmu z pierwszego rzędu do dołków w drugim rzędzie zawierających 180 µL 1x PBS (Rząd 2, rozcieńczenie: 10−1). Następnie przenieś 20 µL cieczy z drugiego rzędu do dołków w kolejnym rzędzie zawierających 180 µL 1x PBS (Rząd 3, rozcieńczenie: 10−2). Powtórz tę procedurę, aby uzyskać rozcieńczenia od 10−5 do 10−7.
    8. Zaszczep 100 µL rozcieńczeń na podłożu TSA i inkubuj płytki zgodnie z parametrami wymaganymi dla wzrostu danej bakterii.
    9. Po inkubacji policz jednostki tworzące kolonie (cfu) i oblicz gęstość log10 dla każdego kołka oraz redukcję log10 dla każdego stężenia środka dezynfekcyjnego, korzystając z następujących równań:
      Wzór równowagi statycznej, log10 CFU/mm² = log10(X/B × V/A × D), analiza mikrobiologiczna. Równ. (4)
      gdzie X to liczba policzonych jednostek tworzących kolonie w punkcie, B to objętość naniesiona na płytkę (0,01 mL), V to objętość dołka (0,20 mL), A to powierzchnia kołka (46,63 mm2), a D to rozcieńczenie.
      Wzór redukcji: log₁₀(Średnia z nieleczonych kołków kontrolnych - Średnia z kołków leczonych); analiza równania. Równ. (5)
    10. Powtórz każdy eksperyment 3x w niezależne dni.
      UWAGA: „Minimalne stężenie środka dezynfekcyjnego, które eliminuje biofilm”, czyli MBEC, odpowiada najniższemu stężeniu środka dezynfekcyjnego, przy którym nie stwierdzono wzrostu bakterii.
  2. Bioreaktor
    UWAGA: W celu przeprowadzenia tego testu z P. azotoformans PFlA1 zastosowano procedurę zgodną z normą ASTM E2871-1915.
    1. Rozpocznij od utworzenia biofilmów na kuponach w bioreaktorze, zgodnie z opisem w kroku 2.2. Następnie wyjmij pręt utrzymujący kupony i wypłucz go w probówce stożkowej zawierającej 30 mL PBS.
    2. Przełóż każdy kupon do sterylnej probówki stożkowej 50 mL za pomocą śrubokręta, a następnie dodaj 4 mL odpowiedniego roztworu organicznego nadtlenku kwasu lub PBS dla kontroli. Inkubuj przez 5 min, a następnie dodaj 36 mL neutralizującego bulionu Dey-Engley. Mieszaj w wirówce vortex przez 30 s, a następnie sonikuj przy 40 kHz przez 30 s w myjce ultradźwiękowej. Powtórz ten proces 3x, aby uzyskać zawiesinę biofilmu.
    3. W ten sam sposób wypłucz wszystkie pozostałe pręty i odzyskaj biofilmy z kuponów. Wykonaj rozcieńczenia seryjne zawiesiny biofilmu i nanieś 0,1 mL na podłoże TSA. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 24 h.
    4. Po inkubacji policz jednostki tworzące kolonie (cfu), a następnie oblicz gęstość biofilmu dla każdego kupona (Równ. 6), średnią gęstość log (LD) dla każdego zestawu trzech kuponów z tego samego pręta, w tym dla próbek leczonych i kontrolnych (Równ. 7) oraz redukcję log dla środka dezynfekcyjnego (Równ. 8), korzystając z następujących równań:
      Diagram równania logarytmicznego; obliczanie jednostek tworzących kolonie; ilościowa analiza mikrobiologiczna. Równ. (6)
      gdzie X to średnia liczba policzonych jednostek tworzących kolonie na kupon, B to objętość naniesiona na płytkę (0,1 mL), V to objętość środka dezynfekcyjnego lub PBS wraz z neutralizatorem (40 mL), a D to rozcieńczenie.
      Wzór obliczania średniego LD, równowaga statyczna, równanie, zastosowanie edukacyjne, analiza statystyczna. Równ. (7)
      Wzór redukcji logarytmicznej, obliczanie redukcji log10, równanie matematyczne, wzór analizy danych Równ. (8)

4. Jakościowa ocena skuteczności organicznych kwasów nadnadbytowych w usuwaniu biofilmu

UWAGA: Po zastosowaniu środków dezynfekcyjnych (krok 3.1.1 do kroku 3.1.5), *P. azotoformans* biofilmy, które utworzyły się na wypustkach płytki mikrotytracyjnej do biofilmu w metodzie statycznej, zostały przygotowane i przeanalizowane za pomocą obserwacji pod mikroskopem elektronowym skaningowym oraz konfokalnym.

  1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
    1. Do trzech dołków mikropłytki 96-dołkowej dodać 200 µL 1x PBS. Przenieść pokrywkę z płytki mikrotytrycznej z biofilmem (krok 3.1.5) na mikropłytkę 96-dołkową zawierającą PBS i pozostawić w temperaturze pokojowej przez 10 s w celu usunięcia neutralizującego bulionu Dey-Engley.
    2. Wyjąć piny z płytki mikrotytrycznej z biofilmem za pomocą wysterylizowanych szczypiec półokrągłych. Umieścić każdy pin w pustej probówce pod dygestorium i do każdej probówki dodać utrwalacz pierwotny (5% glutaraldehydu w 0,1 M buforze kاكodylanowym Na o pH 7,5). Zakręcić probówki i inkubować je w temperaturze 4 °C przez 24 h.
    3. Po inkubacji odlać utrwalacz za pomocą pipety i zutylizować wszystkie odpady ciekłe w odpowiednim pojemniku. Zdjąć nakrętki z probówek i umieścić je pod dygestorium do wysuszenia przez 72 h.
    4. Zamocować próbki na stubach aluminiowych (patrz Tabela Materiałów), nakładając żywicę epoksydową (patrz Tabela Materiałów) na płaską górną powierzchnię każdego stuba. Następnie ostrożnie przytwierdzić piny do stubów za pomocą pęsety.
    5. Naparować metal na próbki za pomocą naparowarki złota EMS950x + 350s (patrz Tabela Materiałów) przez 4 min przy ciśnieniu argonu 2 x 10−1 bar i prądzie 20 mA. Wykonać odpowiednie uziemienie, malując bok pinu nieeksponowany na złoto farbą srebrową (patrz Tabela Materiałów).
    6. Przechwycić obrazy za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, korzystając z interfejsu sterującego SEM w wersji 6.28 (patrz Tabela Materiałów). Napięcie przyspieszające zastosowane w badaniu wynosiło 15 kV, a powiększenia 300x oraz 2 000x.
  2. Mikroskopia konfokalna
    1. Do trzech dołków płytki mikrotytrycznej 96-dołkowej dodać 200 µL 1x PBS. Przenieść pokrywkę z mikropłytki z biofilmem na płytkę 96-dołkową zawierającą PBS i pozostawić przez 10 s w celu usunięcia neutralizującego bulionu Dey-Engley.
    2. Przygotować roztwory barwników fluorescencyjnych, dodając 3 µL zielonego barwnika fluorescencyjnego i 3 µL czerwonego barwnika fluorescencyjnego (patrz Tabela Materiałów) do 1 mL sterylnej wody.
    3. Do jednego dołka płytki mikrotytrycznej 96-dołkowej dodać 200 µL roztworu barwiącego. Przenieść pokrywkę z płytki mikrotytrycznej z biofilmem na płytkę 96-dołkową zawierającą roztwór barwiący. Przykryć płytkę mikrotytryczną z biofilmem folią aluminiową i inkubować próbkę przez 20-30 min w temperaturze pokojowej.
    4. Do dołków mikropłytki 96-dołkowej dodać 200 µL sterylnej wody. Następnie przenieść pokrywkę z mikropłytki z biofilmem na mikropłytkę 96-dołkową zawierającą wodę i pozostawić do czasu obserwacji.
    5. Wizualizować biofilmy utworzone na pinach za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (patrz Tabela Materiałów) z obiektywem olejowym DIC 63x/1,40. Przechwycić obrazy za pomocą powiązanego oprogramowania (patrz Tabela Materiałów). Długości fal wzbudzenia fluorescencji dla zielonego i czerwonego barwnika fluorescencyjnego wynosiły odpowiednio 482 nm i 490 nm.
      UWAGA: Dla uzyskania najlepszych wyników przeciąć pin, umieścić go w 60 mm czarce Petriego i wypełnić czarkę sterylną wodą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza SEM wykazuje obecność biofilmów wytworzonych przez P. azotoformans PFl1A na wypustkach mikropłytki do biofilmów (Rysunek 2A). Można zaobserwować trójwymiarową strukturę biofilmu. P. azotoformans PFl1A został wcześniej zidentyfikowany jako silny producent biofilmu (A570 > 1,5) z wykorzystaniem mikropłytek miareczkowych z 96 dołkami12.

Dodatkowo biofilm P. azotoformans PFl1A, który utworzył się...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test MBEC (test mikropłytek biofilmu) był pierwszą metodą, która została uznana przez ASTM17 za standardowy test eliminacji biofilmu. Nasze i inne badania wykazały, że istnieją dwa krytyczne etapy podczas korzystania z tego testu: etap sonikacji (czas i moc) oraz czas leczenia środkiem dezynfekującym18. Stewart i Parker zasugerowali również inne parametry, które mogą wpłynąć na wynik testu, takie jak gatunki drobnoustrojów, wiek biofilmu, stosunek powierzchni do objętości <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ)(2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc, oraz Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17). Dziękujemy Teresie Paniconi za krytyczną recenzję manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; M Filtry Corning09-754-28średnica: 50 mm, PTFE- Membrana
316 dysk ze stali nierdzewnejBiosurface Technologies CorporationRD128-316
316 kupon ślizgowy ze stali nierdzewnejBiosurface Technologies CorporationCBR 2128-316
96-mikropłytka do miareczkowaniaCorning07-200-89Mikropłytka z płaskim dnem poddana działaniu kultur komórkowych 
Kwas octowySigma Aldrich27225sklep w RT
Aluminiowe króćceMikroskopia elektronowa Nauka75830-1032x5mm
Wodny aldehyd glutarowy EM Grade 25%Mikroskopia elektronowa Sciences16220przechowuj przy -20 ° C
AB204-S/FACT Waga analitycznaMettler ToledoAB204-S
Bakteryjny filtr odpowietrzający (0,45 &mikro; m)Biosurface Technologies CorporationBST 02915
BioDestroyGroupe Sani Marc09-10215komercyjny środek dezynfekujący na bazie kwasu nadoctowego, przechowywać w RT
Carboy LDPE 20 LCole Parmer06031-52
Reaktor biofilmu CDCBiosurface Technologies CorporationCRB 90
Siarczan ceru (IV)Thermo Scientific35650-K2sklep w RT
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy  LSM 700ZeissLSM 700
Dey-Engley bulion neutralizującyMilliporeD3435-500Gprzechowywać w 4 stopniach; C
EMS950x + 350s złoto napylanie Mikroskopia elektronowa Sciences
Żywica epoksydowaMikroskopia elektronowa Sciences14121z
BDMA Alkohol etylowy 95%, globalny sklep P016EA95 USPGreenfieldw RT
Roztwór wskaźnika żelazoinySigma Aldrich318922-100MLsklep w RT
Korek napełniający/odpowietrzającyCole ParmerRK-06258-00
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability KitInvitrogenL10316(SYTO 9: zielone barwienie fluorescencyjne, jodek propidy: czerwone barwienie fluorescencyjne), przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Szklana bariera przepływowaBiosurface Technologies CorporationFB 50
Gold ze srebrną farbą Mikroskopia elektronowa Sciences12684-15
Zestaw płyt grzewczychBiosurface Technologies Corporation110V Mieszadło Śrubokręt
sześciokątnyBiosurface Technologies CorporationCBR 5497
Nadtlenekwodoru Sigma216763sklep pod adresem 4 stopni; C
Pętle inokulacyjneVWR12000-812sterylne, 10 i mikro; l
Kwas mlekowyLaboratoire MATLU-0200przechowywać w RT
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 z pompą perystaltyczną EASY-LOAD II i głowicą 77200-50Cole Parmer77200-60
MBEC (minimalne stężenie eliminacji biofilmu) inokulator biofilmu z 96-dołkową podstawąInnovotech19111Płytka do mikromiareczkowania Biofilm
na bazie agaru OxfordThermo ScientificOXCM0856Bprzechowywać w temperaturze 4 & deg; C
Plastikowy uchwyt na kuponyBiosurface Technologies CorporationCBR 2203
Plastikowy pręt uchwytu ślizgowegoBiosurface Technologies CorporationCBR 2203-GL
Jodek potasuFisher ChemicalP410-500sklep w RT
Precyzyjny śrubokręt płaski (1,5 mm x 40 mm)Wiha26015
Kwas propionowyLaboratoire MATPF-0221sklep pod adresem RT
Sartorius BCE822-1S Entris® II Podstawowa niezbędna równowaga ładowana od góryCole Parmer  UZ-11976-3
Skaningowy mikroskop elektronowy JSM-6360LV modelJEOLJSM-6360LVSEM i interfejs sterowania użytkownika Rurka
z nakrętką, 15 mlSarstedt62.554.205(LxØ): 120 x 17 mm, materiał: PP, stożkowa podstawa, przezroczysta, HD-PE
Rurka z nakrętką, 50 mlSarstedt62.547.205(LxØ): 114 x 28 mm, materiał: PP, stożkowa podstawa, przezroczysta, HD-PE
Kakodylan sodu Trójwodnymikroskopia elektronowa Nauki  12300Sklep przy -20 ° C
Tiosiarczan soduThermo ScientificAC124270010przechowywać w RT
Kąpiel sonikocyjnaFisher15-336-1225,7 L
Roztwór skrobiAnachemiaAC8615przechowywać w RT
Kwas siarkowySigma Aldrich258105-500MLprzechowywać w RT
Tryptyczny agar sojowyBD BactoDF0369-17-6przechowywać w RT
Tryptyczny bulion sojowyBD BactoDF0370-17-3przechowywać w RT
Rurki Masterflex L/S 16 25'Cole ParmerMFX0642416
Rurki Masterflex L/S 18 25'Cole ParmerMFX0642418
Tygon SPT-3350 rurki silikonowe Saint-GobainABW18NSFIDx OD: 1/4 cala x 7/16 cala
VortexCole ParmerUZ-04724-00
Łaźnia wodna Oprogramowanie Zen VWR89202-970
Zeiss
Zestaw do żywotności komórek fluorescencyjnych

Bibliografia

  1. Canada's dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre. , Available from: https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance (2017).
  2. Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. A. Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment: food safety and public health implications. Foodborne Pathogens and Disease. 2 (2), 115-129 (2005).
  3. Fondation de technologie laitière du Québec. Science et technologie du lait. 3rd edn. , Les Presses de l'Université Laval. Quebec. (2018).
  4. Evanowski, R., et al. Short communication: Pseudomonas azotoformans causes gray discoloration in HTST fluid milk. Journal of dairy science. 100, 7906-7909 (2017).
  5. Bower, C. K., McGuire, J., Daeschel, M. A. The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces. Trends in Food Science & Technology. 7 (5), 152-157 (1996).
  6. Gupta, S., Anand, S. Induction of pitting corrosion on stainless steel (grades 304 and 316) used in dairy industry by biofilms of common sporeformers. International Journal of Dairy Technology. 71 (2), 519-531 (2018).
  7. Marchand, S., et al. Biofilm formation in milk production and processing environments; Influence on milk quality and safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 11 (2), 133-147 (2012).
  8. Silva, H. O., et al. Efficiency of different disinfectants on Bacillus cereus sensu stricto biofilms on stainless-steel surfaces in contact with milk. Frontiers in Microbiology. 9, 2934(2018).
  9. Sedlak, D. L., von Gunten, U. Chemistry. The chlorine dilemma. Science. 331 (6013), 42-43 (2011).
  10. vander Veen, S., Abee, T. Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid. International Journal of Food Microbiology. 144 (3), 421-431 (2011).
  11. Saa Ibusquiza, P., Herrera, J. J., Cabo, M. L. Resistance to benzalkonium chloride, peracetic acid and nisin during formation of mature biofilms by Listeria monocytogenes. Food Microbiology. 28 (3), 418-425 (2011).
  12. Goetz, C., Larouche, J., Velez Aristizabal, M., Niboucha, N., Jean, J. Efficacy of organic peroxyacids for eliminating biofilm preformed by microorganisms isolated from dairy processing plants. Applied and Environmental Microbiology. 88 (4), 0188921(2022).
  13. Vimont, A., Fliss, I., Jean, J. Study of the virucidal potential of organic peroxyacids against norovirus on food-contact surfaces. Food and Environmental Virology. 7 (1), 49-57 (2015).
  14. ASTM International. ASTM E2562-17. Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. Available from: https://www.astm.org/e2562-17.html (2017).
  15. ASTM International. ASTM E2871-19. Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. Available from: https://www.astm.org/e2871-19.html (2019).
  16. Niboucha, N., et al. Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor. Frontiers in Microbiology. 13, 892181(2022).
  17. ASTM International. ASTM E2799-17. Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay. ASTM International. , West Conshohocken, PA. Available from: https://www.astm.org/e2799-17.html (2022).
  18. Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. Journal of Microbiological Methods. 102, 55-64 (2014).
  19. Stewart, P. S., Parker, A. E. Measuring antimicrobial efficacy against biofilms: A meta-analysis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (5), 00020(2019).
  20. Lindsay, D. K., Fouhy, K., Loh, M., Malakar, P. The CDC biofilm bioreactor is a suitable method to grow biofilms, and test their sanitiser susceptibilities, in the dairy context. International Dairy Journal. 126, 105264(2022).
  21. Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 236-244 (2007).
  22. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology (Reading). 151, 757-762 (2005).
  23. Williams, D. L., Woodbury, K. L., Haymond, B. S., Parker, A. E., Bloebaum, R. D. A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application. Current Microbiology. 62 (6), 1657-1663 (2011).
  24. Pieranski, M. K., Rychlowski, M., Grinholc, M. Optimization of Streptococcus agalactiae biofilm culture in a continuous flow system for photoinactivation studies. Pathogens. 10 (9), 1212(2021).
  25. Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm. Food Microbiology. 92, 103592(2020).
  26. Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. L. Nutrient level determines biofilm characteristics and subsequent impact on microbial corrosion and biocide effectiveness. Applied and Environmental Microbiology. 86 (7), 02885(2020).
  27. Goeres, D. M., et al. Design and Fabrication of Biofilm Reactors. Recent Trends in Biofilm Science and Technology. Simoes, M., Borges, A., Chaves Simoes, L. , Academic Press. Cambridge, MA. 71-88 (2020).
  28. Fjeld, C. S., Schüller, R. B. Biofilm formation during hexadecane degradation and the effects of flow field and shear stresses. Annual Transactions - The Nordic Rheology Society. 21, 341-346 (2013).
  29. Gilmore, B. F., Hamill, T. M., Jones, D. S., Gorman, S. P. Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).
  30. Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow. Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Eradykacja biofilmuprzesiewanie statycznetest MBECreaktor biofilmu CDCpowierzchnie ze stali nierdzewnejPseudomonas azotoformansstrategie kontroli biofilmu
Ocena skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmu mlecznego przy użyciu podejścia łączącego metody statyczne i dynamiczne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.