Artykuł metodologiczny

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

DOI:

10.3791/64626

⸱

11 listopada 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Harold C. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 5Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 6Division of Medical Oncology, Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy są niezawodną metodą modelowania tkanek narządowych ze względu na ich właściwości samoorganizujące się oraz zachowanie funkcji i architektury po rozmnażaniu z pierwotnej tkanki lub komórek macierzystych. Ta metoda generowania organoidów rezygnuje z różnicowania pojedynczych komórek przez wiele pasaży, a zamiast tego wykorzystuje wirowanie różnicowe do izolowania organoidów nabłonka sutka z mechanicznie i enzymatycznie zdysocjowanych tkanek. Protokół ten zapewnia usprawnioną technikę szybkiego wytwarzania małych i dużych organoidów nabłonkowych zarówno z mysich, jak i ludzkich tkanek sutka, a także techniki osadzania organoidów w kolagenie i podstawowej macierzy zewnątrzkomórkowej. Ponadto znajdują się instrukcje dotyczące utrwalania w żelu i barwienia immunofluorescencyjnego w celu wizualizacji morfologii i gęstości organoidów. Metodologie te są odpowiednie dla niezliczonych analiz końcowych, takich jak kohodowla z komórkami odpornościowymi i modelowanie przerzutów ex vivo za pomocą testu inwazji kolagenu. Analizy te służą lepszemu wyjaśnieniu zachowania komórka-komórka i stworzeniu pełniejszego zrozumienia interakcji w mikrośrodowisku guza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do modelowania komórek nabłonkowych in vitro jest podstawą nowoczesnych badań biomedycznych, ponieważ rejestruje cechy komórkowe, które nie są dostępne in vivo. Na przykład, rosnące linie komórek nabłonka w płaszczyźnie dwuwymiarowej mogą zapewnić ocenę zmian molekularnych, które zachodzą w komórce nabłonkowej podczas proliferacji1. Co więcej, pomiar dynamicznej regulacji między sygnalizacją a ekspresją genów jest ograniczony w systemach in vivo2. W badaniach nad rakiem modelowanie linii komórkowych nabłonka nowotworowego umożliwiło identyfikację molekularnych czynników progresji choroby i potencjalnych celów leków3. Jednak rosnące linie komórek nabłonka raka na płaszczyźnie dwuwymiarowej mają ograniczenia, ponieważ większość z nich jest genetycznie unieśmiertelniona i zmodyfikowana, często o charakterze klonalnym, wyselekcjonowana ze względu na ich zdolność do wzrostu w warunkach niefizjologicznych, ograniczona w ocenie trójwymiarowej (3D) architektury tkanki nowotworowej i nie modeluje odpowiednio interakcji mikrośrodowiskowych w realistycznym środowisku tkankowym4. Ograniczenia te są szczególnie widoczne w modelowaniu przerzutów, które in vivo obejmuje kilka odrębnych etapów biologicznych, w tym inwazję, rozprzestrzenianie się, krążenie i kolonizację w odległym miejscu narządu5.

Organoidy nabłonkowe nowotworów zostały opracowane, aby lepiej odwzorować środowisko 3D i zachowanie nowotworów6,7,8. Organoidy zostały po raz pierwszy opracowane z pojedynczych komórek krypty jelitowej LRG5 + i zróżnicowane w celu przedstawienia struktury 3D jednostek krypto-kosmków, które utrzymywały hierarchiczną strukturę jelita cienkiego in vitro9. Podejście to umożliwiło wizualizację i charakterystykę samoorganizującej się architektury tkanek w warunkach homeostazy i stresu. Jako naturalne rozszerzenie, organoidy nabłonkowe nowotworów zostały opracowane w celu modelowania wielu różnych typów nowotworów, w tym colorectal10, pancreatic11, breast12, liver13, lung14, brain15 i raki żołądka16. Organoidy nabłonkowe nowotworów zostały wykorzystane do scharakteryzowania ewolucji raka17,18 i przerzutowe zachowania czasoprzestrzenne19,20 i zbadaj heterogeniczność guza21, oraz przetestuj chemoterapię22. Organoidy nabłonkowe raka zostały również wyizolowane i zebrane podczas trwających badań klinicznych w celu przewidywania reakcji pacjenta na środki przeciwnowotworowe i radioterapię ex vivo8,23,24,25. Co więcej, systemy zawierające organoidy nabłonka nowotworowego mogą być łączone z innymi komórkami nienowotworowymi, takimi jak komórki odpornościowe, w celu stworzenia bardziej kompleksowego modelu mikrośrodowiska guza, aby wizualizować interakcje w czasie rzeczywistym, odkrywać, w jaki sposób komórki nabłonkowe raka zmieniają fundamentalną naturę cytotoksycznych efektorowych komórek odpornościowych, takich jak komórki NK oraz testować potencjalne immunoterapie i aktywność cytotoksyczną zależną od przeciwciał i leków26,27,28. W artykule przedstawiono metodę generowania organoidów nabłonkowych bez pasażowania i osadzania w kolagenie i podstawowej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Ponadto udostępniono również techniki dalszego obrazowania izolowanych organoidów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie tkanki myszy użyte w tym manuskrypcie zostały etycznie zebrane zgodnie z przepisami i wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) University of Texas Southwestern Medical Center. Podobnie, wszyscy pacjenci wyrazili zgodę przed oddaniem tkanek pod nadzorem Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB), a próbki zostały pozbawione elementów identyfikujących.

UWAGA: Ten protokół opisuje tworzenie organoidów z pierwotnej tkanki.

1. Przygotowanie materiałów przez noc

  1. W celu zatopienia w macierzy zewnątrzkomórkowej podłoża (BECM) należy rozmrozić podwielokrotność BECM, pozostawiając ją w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie roztworu powlekającego kolagenazę i albuminę surowicy bydlęcej (BSA)

  1. Przygotować 2,64% roztwór powlekający BSA/PBS (roztwór BSA): Sterylny filtr 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 4,10 ml 30% roztworu BSA przy użyciu kolby filtracyjnej o pojemności 50 ml/0,2 μm. To rozwiązanie BSA można przefiltrować i ponownie użyć.
  2. Przygotuj roztwór kolagenazy dla tkanki sutka myszy: Sterylny filtr 27 ml pożywki z komórek podstawnych, 1,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 30 μl 50 mg/ml gentamycyny, 15 μl insuliny 10 mg/mL, 600 μl 0,1 g/ml kolagenazy A i 600 μl 0,1 g/ml trypsyny za pomocą kolby filtracyjnej 50 ml/0,2 μm. Przydziel od 10 ml do 30 ml roztworu kolagenazy na mysz, w zależności od masy tkanki.
  3. Przygotuj roztwór kolagenazy dla ludzkiej tkanki piersi: sterylny filtr 18 ml RPMI-1640, 200 μl 100x roztwór penicyliny-streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec), 200 μl 10 mM buforu kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1 ml FBS i 400 μl 0,1 g/ml kolagenazy A przy użyciu kolby filtracyjnej o pojemności 50 ml/0,2 μm. Przydziel od 10 ml do 20 ml na próbkę tkanki, w zależności od masy tkanki.

3. Przygotowanie mediów

  1. Przygotować pożywkę organoidową: Sterylne filtrowane podłoże z komórek podstawnych z 1% piórem/paciorkowcami i 1% insulinotransferyny-selenu (ITS) przy użyciu kolby filtracyjnej o pojemności 50 ml/0,2 μm. Aby wytworzyć pożywkę z organoidalnego czynnika wzrostu, dodaj zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) do końcowego stężenia 2,5 nM.
  2. Przygotuj pożywkę nabłonkową sutka: Aby przygotować 100 ml podłoża nabłonkowego sutka, sterylnego filtra o wysokiej zawartości glukozy z 1 ml 100x suplementu glutaminy, 1 ml wstrzykiwacza/paciorkowca, 1 ml 10 mM buforu HEPES (7,3 pH), 250 μL 30% zapasu BSA, 1 μL 1 mg/ml wywaru z toksyną, 1 ml bulionu hydrokortyzonu o stężeniu 50 μg/ml w PBS, 50 μl roztworu insuliny ludzkiej o stężeniu 10 mg/mL, 10 μl roztworu naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) o stężeniu 50 μg/ml i 1% FBS przy użyciu kolby filtracyjnej o pojemności 150 ml/0,2 μm. Przechowuj podłoże w temperaturze 4 °C i używaj do 2 tygodni.
  3. Przygotować płukanie amfoterycyną: Sterylny filtr PBS z 2% wstrzykiwaczem/paciorkowcem i 2% amfoterycyną B. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Zbieranie i trawienie tkanek

  1. Tkanka sutka myszy
    1. Poddaj mysz eutanazji, umieszczając ją w komorze CO2 na 2-5 minut, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Z brzuszną stroną skierowaną do góry, rozłóż kończyny myszy i użyj czterech igieł 19 G, aby przypiąć mysz za łapy do deski pokrytej chłonną podkładką. Spryskaj 70% etanolem, aby wygładzić sierść i zdezynfekować skórę. Zetrzyj kał gazikiem lub chusteczką.
    2. Zaczynając tuż nad okolicą odbytu i narządów płciowych, odetnij w górę od linii środkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych, uważając, aby nie przebić otrzewnej. Po dotarciu do podbródka wykonaj boczne nacięcia zarówno obojczyki, jak i tylne nogi, a następnie przypnij skórę myszy napiętą do deski, aby odsłonić poduszeczki tłuszczowe sutka.
    3. Zlokalizuj pachwinowe poduszeczki tłuszczowe sutka u myszy typu dzikiego, identyfikując pachwinowy węzeł chłonny znajdujący się w pobliżu kończyn tylnych. Zlokalizuj poduszeczki tłuszczowe piersi sutka u myszy typu dzikiego jako grubszą, unaczynioną tkankę pod przednimi kończynami.
    4. Użyj kleszczy, aby podnieść poduszeczkę tłuszczową sutka. Unikaj zbierania leżących pod spodem mięśni. Używając końca ostrych, nożyczek, utwórz kieszeń pod poduszką tłuszczową sutka, z dala od skóry. Odetnij poduszeczkę tłuszczową sutka w jednym kawałku.
    5. Po usunięciu poduszeczek tłuszczowych sutka spłucz je w PBS przed umieszczeniem ich w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych. Szybko przenieść do kaptura do hodowli tkankowych.
      UWAGA: W przypadku guzów sutka użyj bawełnianego wacika zwilżonego PBS, aby delikatnie odtoczyć guz od skóry. Pamiętaj, aby unikać ciemnych lub miękkich obszarów, ponieważ ciemne przebarwienia wskazują na martwicę, która nie da zdrowych organoidów.
    6. Zmiel guzy sutka skalpelem #10 lub #11, aby rozluźnić tkankę, aż osiągnie konsystencję pasty. Przenieś zmieloną tkankę do stożkowej probówki zawierającej 10-30 ml roztworu kolagenazy za pomocą skalpela. Aby upewnić się, że cała tkanka została pobrana, należy pobrać pipetą 1 ml roztworu kolagenazy na płytkę do hodowli tkankowej i z powrotem do stożkowej probówki.
      UWAGA: Aby wytworzyć większe organoidy, należy zminimalizować trawienie mechaniczne, pozostawiając nienaruszone małe widoczne kawałki tkanki. Alternatywnie, tkanka może być przechowywana w stanie zamrożonym w celu późniejszego przygotowania organoidów przy minimalnej utracie żywotności. W tym celu umyj tkankę w roztworze PBS lub pożywki z komórek podstawnych + 1% FBS, a następnie grubo zmielić, aby zwiększyć powierzchnię (utrzymując tkankę w jednym lub dwóch stałych kawałkach). Przenieść tkankę do kriofiolki, na wierzchu z pożywką do zamrażania (90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO)). Zamrozić fiolki w pojemniku do zamrażania o kontrolowanej szybkości przez noc przed przeniesieniem do przechowywania w ciekłym azocie.
    7. Umieścić probówkę stożkową w inkubatorze laboratoryjnym o temperaturze 37 °C z prędkością 180 obr./min, aż tkanka stanie się żylasta, a roztwór kolagenazy stanie się mętny. Na przykład duża masa tkankowa (około 500-800 mg) z guza zajmuje 30-60 minut. Mniejsza masa tkankowa (około 100-300 mg) z poduszek tłuszczowych sutka typu dzikiego zajmuje około 20-30 minut. Jeśli nie masz pewności, sprawdzaj w odstępach 5-minutowych.
    8. Po inkubacji odwirować stożkową probówkę przez 10 minut przy 550 x g w temperaturze pokojowej (RT).
    9. Ostrożnie odessać supernatant z rurki stożkowej.
      UWAGA: Idąc dalej, wszystkie końcówki pipet, pipety serologiczne i probówki stożkowe należy wstępnie pokryć roztworem BSA, aby uniknąć utraty organoidów w wyniku przylegania do tworzywa sztucznego.
    10. Dodać 8 ml pożywki dla komórek podstawnych i 80 μl roztworu DNazy [2 U/μL] do probówki. Delikatnie odwróć przez 1-3 min.
    11. Dodać 12 ml pożywki z komórek podstawowych do probówki i ostrożnie wymieszać pipetując lub delikatnie obrócić probówkę 15 razy, aby wymieszać.
    12. Wirować przez 10 minut przy 550 x g przy suchej smołce.
    13. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 12 ml podłoża z komórek podstawnych.
    14. Niech najcięższe fragmenty tkanek osiądą na dnie. Zebrać supernatant za pomocą pipety serologicznej i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zawiesina ta zawiera organoidy nabłonkowe i komórki zrębowe/odpornościowe.
  2. Ludzka tkanka piersi
    1. Próbki tkanki piersi ludzkiej należy przetworzyć na organoidy lub przechowywać je w ciągu 24 godzin od pobrania. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w pożywce niezależnej od CO2 z 1% 100-krotnym antybiotykiem przeciwgrzybiczym.
    2. Przenieś tkankę na płytkę do hodowli tkankowej. Przechylić płytkę i odessać nadmiar pożywki magazynującej, a następnie przepłukać tkankę 5 ml roztworu amfoterycyny B do płukania. Natychmiast usunąć amfoterycynę B do płukania.
    3. Zmiel próbkę tkanki skalpelem #10 lub #11, aby poluzować tkankę, aż osiągnie konsystencję pasty. Przenieś zmieloną tkankę do stożkowej probówki zawierającej 10-30 ml roztworu kolagenazy za pomocą skalpela. Aby upewnić się, że cała tkanka została pobrana, należy pobrać pipetą 1 ml roztworu kolagenazy na płytkę do hodowli tkankowej i włożyć z powrotem do stożkowej probówki.
      UWAGA: Aby wytworzyć większe organoidy, należy zminimalizować trawienie mechaniczne, pozostawiając nienaruszone małe widoczne kawałki tkanki. Wyjściowa masa tkankowa dla tego protokołu wahała się między 100-250 mg. Alternatywnie, tkanka może być przechowywana zamrożona w celu późniejszego przygotowania organoidów z minimalną utratą żywotności po kroku 4.2.2 w 90% FBS + 10% DMSO, jak powyżej.
    4. Umieścić probówkę stożkową w inkubatorze laboratoryjnym o temperaturze 37 °C z prędkością 180 obr./min, aż tkanka stanie się mniejsza, a kolagenaza stanie się mętna. Sprawdzaj tkankę w odstępach 5 minut. Dysocjacja kolagenazy w próbkach ludzkich trwa około 5-20 minut.
    5. Po inkubacji wirować stożkową rurkę przez 10 minut przy 550 x g przy smotej smołce.
    6. Ostrożnie odessać supernatant z rurki stożkowej.
      UWAGA: Idąc dalej, wszystkie końcówki pipet, pipety serologiczne i probówki stożkowe należy wstępnie pokryć roztworem BSA, aby uniknąć utraty organoidów z powodu przylegania do tworzywa sztucznego.
    7. Dodać 4 ml pożywki z komórek podstawnych i 40 μl roztworu DNazy [2 U/μL] do stożkowej probówki. Delikatnie odwracaj przez 3 minuty.
    8. Dodać 6 ml pożywki z komórek podstawowych do probówki i ostrożnie wymieszać, pipetując lub delikatnie obrócić stożkową rurkę 15 razy, aby wymieszać.
    9. Wirować przez 10 minut przy 550 x g przy suchej smołce.
    10. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 10 ml podłoża z komórek podstawnych.
    11. Niech najcięższe fragmenty tkanek osiądą na dnie. Zebrać supernatant i przenieść go do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zawiesina ta zawiera organoidy nabłonkowe i komórki zrębowe/odpornościowe.

5. Wirowanie różnicowe

  1. Pulsować do 550 x g przez 3-4 s w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml podłoża z komórek podstawnych. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy (w sumie cztery obroty).
  2. Po każdym odwirowaniu upewnij się, że osad staje się coraz bardziej nieprzezroczysty. Ta pozostała osadka będzie organoidami nabłonkowymi.

6. Zbieranie małych organoidów

  1. Pulsować do 80-100 x g przez 3 s w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant do świeżej probówki pokrytej BSA, a następnie pulsować do 550 x g przez 3 s w temperaturze pokojowej, aby osadzać małe organoidy.

7. Osadzanie organoidów w BECM

  1. Podwielokrotność odpowiedniej zawiesiny organoidów w probówkach do mikrowirówek zgodnie z gęstością organoidów w stosunku do ilości BECM na studzienkę (tabela 1). Na przykład użyj 50-100 organoidów na 20 μl BECM w jednym dołku na 96-dołkowej płytce.
    UWAGA: Gęstość organoidów można obliczyć za pomocą następującego wzoru: ((średnia liczba organoidów)/50 μl) x współczynnik rozcieńczenia.
  2. Wykonaj wszystkie kroki na lodzie. Umieść rozmrożony BECM na lodzie w kapturze do hodowli tkankowych. Przygotowując kaptur, umieść wszystkie końcówki pipet na lodzie, aby ostygły.
  3. Odwirować probówki do mikrowirówek przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant z probówek. Przenieść probówki z granulkami organoidów do lodu i dodać odpowiednią objętość BECM do każdej probówki do mikrowirówki (Tabela 1).
    UWAGA: Ponieważ BECM jest lepki, dodaj dodatkowe objętości (około 10%-20% więcej objętości kopuły) BECM, aby uwzględnić ubytek w końcówce pipety.
  4. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić organoidy w BECM, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków.
  5. Powoli i ostrożnie pipetować organoidy zawieszone w BECM na powierzchni poszycia. Podczas pipetowania powoli podnieś pipetę, aby utworzyć kopułę. Napełnij wszystkie puste studzienki PBS, aby utrzymać wilgotność.
  6. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę, aby umożliwić BECM zastygnięcie, a następnie przykryć odpowiednią ilością pożywki (Tabela 1).

8. Osadzanie organoidów w kolagenie

  1. Wykonaj wszystkie kroki na lodzie. Przygotuj roztwór kolagenu, łącząc w kolejności sekwencyjnej 375 μl 10x DMEM, 100 μl 1 N wodorotlenku sodu (NaOH) i 3 ml roztworu I kolagenu z ogona szczura w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wymieszaj pipetą, uważając, aby nie powstały bąbelki. Miareczkować roztwór do pH 7,2-7,4 małymi ilościami (przyrosty 1-3 μl) NaOH lub 10x DMEM, w zależności od potrzeb.
  2. Pokryj dno studzienek minimalną ilością kolagenu wymaganą do pełnego pokrycia dna studzienki. Jednym ze sposobów jest umieszczenie niewielkiej ilości kolagenu i kołysanie płytką z boku na bok w celu uzyskania powłoki. Pozostaw podkłady kolagenowe do zastygnięcia w temperaturze 37 °C przez 30 min-2 godziny.
  3. Podwielokrotnić odpowiednią zawiesinę organoidów do probówek do mikrowirówek zgodnie z gęstością organoidów w stosunku do ilości kolagenu w basenie (Tabela 1). Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  4. Roztwór kolagenu należy przechowywać w temperaturze 4 °C i monitorować polimeryzację, sprawdzając pod mikroskopem co 10 minut, czy tworzą się włókna. Kolagen osiągnie odpowiednią polimeryzację między 30 min-2 h.
    UWAGA: Prawidłową polimeryzację można określić na podstawie obecności włókien rozgałęziających się w całej matrycy. Przejdź do kroku 8.5 natychmiast po zaobserwowaniu kilku włókien w polu widzenia.
  5. Odwirować probówki do mikrowirówek o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant z probówek. Przenieś granulki organoidów na lód i dodaj odpowiednią objętość kolagenu do każdej probówki do mikrowirówki (Tabela 1).
    UWAGA: Ponieważ kolagen jest lepki, dodaj dodatkowe objętości (około 10%-20% więcej objętości kopuły) kolagenu, aby zrekompensować ubytek w końcówce pipety.
  6. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić organoidy w kolagenie, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków.
  7. Powoli i ostrożnie odpipetować organoidy zawieszone w kolagenie na powierzchnię poszycia. Podczas pipetowania powoli podnieś pipetę, aby utworzyć kopułę. Napełnij wszystkie puste studzienki PBS, aby utrzymać wilgotność.
  8. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę, aby kolagen mógł zastygnąć, a następnie przykryć odpowiednią ilością pożywki (Tabela 1).
  9. UWAGA: Organoidy zachowują żywotność w matrycy 3D do 7 dni. Jeśli do analizy używane jest obrazowanie, przejdź do kroków 9 i 10.

9. Naprawianie osadzonych organoidów

  1. Użyj pipety, aby usunąć wszystkie media ze studzienek bez kontaktu z kopułami ECM.
  2. Utrwalać 4% roztworem paraformaldehydu (PFA)/PBS przez 5 min.
  3. Umyj dwa do trzech razy, nakładając PBS na studzienki po umieszczeniu ich na wolno poruszającym się shakerze. Po umyciu nałóż świeży PBS na kopuły i przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C.

10. Barwienie immunofluorescencyjne osadzonych organoidów

  1. Przygotowanie roztworów do barwienia immunofluorescencyjnego
    1. Bufor przepuszczalny: Przygotować roztwór PBS z 10% Triton X-100.
    2. Bufor blokujący: Przygotuj roztwór PBS zawierający 10% FBS i 0,2% Triton X-100.
    3. Bufor do rozcieńczania przeciwciał: Przygotować roztwór PBS z 2% FBS i 0,2% Triton X-100.
  2. Przepuszczalność i blokowanie
    1. Odpipetować wystarczającą ilość bufora przepuszczalnego, aby pokryć kopuły ECM. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wolno poruszającym się wytrząsarce.
    2. Usunąć bufor permeabilizacyjny za pomocą pipety i nakładać tę samą objętość buforu blokującego na 3 godziny.
  3. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Usunąć bufor blokujący za pomocą pipety i nałożyć bufor rozcieńczający przeciwciała zawierający przeciwciało pierwszorzędowe w stężeniach określonych przez producenta. Inkubować próbkę w temperaturze 4 °C przez 12-16 godzin na wolno poruszającym się wytrząsarce.
    2. Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć próbki trzy razy przez 10 minut za pomocą PBS w temperaturze RT na wolno poruszającym się wytrząsaczu.
  4. Wtórna inkubacja przeciwciał i barwienie jądrowe
    1. Odessać pozostały płyn do płukania PBS i nałożyć bufor rozcieńczający przeciwciała zawierający przeciwciała drugorzędowe w stężeniach określonych przez producenta. Dodatkowo dodać DAPI lub Hoechst (do znakowania jąder) lub falloidyny (do oznaczania aktyny) do buforu w stosunku 1:250. Inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej na wolno poruszającym się wytrząsarce.
    2. Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć próbki trzy razy przez 10 minut w PBS w temperaturze RT na wytrząsarce. Próbki należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do czasu rozpoczęcia badania obrazowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazy zamieszczone w Rysunek 1 przedstawia przykład dzikich i nowotworowych organoidów nabłonkowych sutka z tkanek ludzkich i mysich. Ilustracja na pierwszy rzut oka metody izolowania organoidów nabłonkowych poprzez wirowanie różnicowe znajduje się w przepływie pracy rysunkowym w Rysunek 1A, pokazując, że pierwotne tkanki różnych gatunków mogą być przetwarzane w prawie identyczny sposób, uzyskując tkankę nabłonkową, jak pokazano na obrazach w jasnym polu (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W literaturze opisano różne metody generowania organoidów nowotworowych. Protokół ten podkreśla metodę generowania organoidów nowotworowych bezpośrednio z guza bez pasażowania. Stosując tę metodę, organoidy nowotworowe są wytwarzane w ciągu kilku godzin od rozpoczęcia procedury i generują blisko 100% żywotnych organoidów w porównaniu z 70% opisanymi w literaturze31. Dla porównania, inne metody wymagają seryjnego pasażowania komórek do organoidów przez kilka tygodni. W ten sposób dalsze zastosowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez fundusze zapewnione przez METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation oraz NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Doceniamy pomoc ze strony University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, wspólnego zasobu w Simmons Comprehensive Cancer Center, który jest częściowo wspierany przez National Cancer Institute pod numerem nagrody P30 CA142543. Specjalne podziękowania dla wszystkich członków Chan Lab.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor HEPES 10 mMGibco 
100x Antybiotyk-Antybiotyk Gibco 15240-096
100x Technologie GlutamaxLife 35050-061Suplement glutaminy
100x Insulina-Transferyna-Selen (ITS) Technologie życiowe 51500-056
100x Penicylina/Streptomycyna (Pióro/Paciorkowiec)Sigma P4333
10x DMEMSigma D2429
50 ml/0,2 i mikro; m kolba filtracyjnaFisher #564-0020
Amfoterycyna BLife Technologies 15290-018
bFGFSigmaF0291
Roztwór BSA (32%)Sigma 
Toksyna Sigma C8052
CO2-Niezależny średni Gibco18045-088
Kolagenaza A Sigma C2139
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej (DNaza)SigmaD4263
DMEM z 4500 mg/L glukozy, pirogronianem sodu i wodorowęglanem sodu, bez L-glutaminy, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowychSigmaD6546Zwykłe podłoże podstawowe
D-MEM/F12 Technologie życiowe #10565-018Pożywka z komórek podstawowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS) Sigma#D8662PBS
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma 
Gentamycyna Technologie życiowe #15750-060
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Sigma E9644
Hydrokortyzon Sigma H0396
Insulina Sigma 
Matrigel Corning #354230Macierz zewnątrzkomórkowa piwnicy (BECM)
NaOH (1 N)Sigma S2770
Kolagen z ogona szczura ICorning 
RPMI-1640 MediaFisher 
Trypsyna Technologie życiowe Numer katalogowy 27250-018
15630080#A9576#F0926#I9278354236SH3002701

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  2. Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698(2021).
  3. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  4. Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
  5. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  6. Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  7. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  8. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  9. Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
  10. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  11. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  12. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  13. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  14. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991(2019).
  15. Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  16. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  17. Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285(2017).
  18. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  19. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  20. Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
  21. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  23. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  24. Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398(2021).
  25. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  26. Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134(2020).
  27. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  28. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762(2022).
  29. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  30. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  31. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
  32. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
  33. Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Centryfugacja r nicowazatapianie organoid wmacierz kolagenowabarwienie immunofluorescencyjnemikro rodowisko nowotworutest inwazji organoid wkokultura organoid wobrazowanie organoid w

Powiązane artykuły