Method Article

Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

DOI:

10.3791/64633

⸱

February 17th, 2023

 ,  ,  , 
1Merk Sharp & Dohme LLC, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje możliwości i podstawowe metody hodowli Open-Top Organ-Chip do pomyślnego zakładania i dojrzewania pełnogrubych kultur narządów na chipach tkanek pierwotnych (skóry, pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i jelit), dając możliwość zbadania różnych funkcjonalnych aspektów interfejsu ludzkiej nabłonka/mezenchymalnej i niszy naczyniowej in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawie wszystkie ludzkie organy są pokryte tkankami nabłonkowymi, składającymi się z jednej lub wielu warstw ściśle połączonych komórek zorganizowanych w trójwymiarowe (3D) struktury. Jedną z głównych funkcji nabłonka jest tworzenie barier, które chronią tkanki podszycia przed fizycznymi i chemicznymi urazami oraz czynnikami zakaźnymi. Ponadto nabłonek pośredniczy w transporcie składników odżywczych, hormonów i innych cząsteczek sygnałowych, często tworząc gradienty biochemiczne, które kierują pozycjonowaniem komórek i podziałem na przedziały w narządzie. Ze względu na ich kluczową rolę w określaniu struktury i funkcji narządów, nabłonki są ważnymi celami terapeutycznymi dla wielu chorób ludzkich, które nie zawsze są wychwytywane przez modele zwierzęce. Oprócz oczywistych różnic między gatunkami, prowadzenie badań naukowych nad funkcją bariery i właściwościami transportowymi nabłonka u zwierząt jest dodatkowo utrudnione przez trudności w dostępie do tych tkanek w żywym systemie. Chociaż dwuwymiarowe (2D) hodowle komórek ludzkich są przydatne do udzielania odpowiedzi na podstawowe pytania naukowe, często dają słabe prognozy in vivo. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w ciągu ostatniej dekady pojawiło się mnóstwo mikroinżynieryjnych platform biomimetycznych, znanych jako narządy na chipie, które stanowią obiecującą alternatywę dla tradycyjnych testów in vitro i testów na zwierzętach. W tym miejscu opisujemy Open-Top Organ-Chip (lub Open-Top Chip), platformę przeznaczoną do modelowania tkanek nabłonkowych specyficznych dla narządów, w tym skóry, płuc i jelit. Chip ten oferuje nowe możliwości odtworzenia wielokomórkowej architektury i funkcji tkanek nabłonkowych, w tym możliwość odtworzenia komponentu zrębu 3D poprzez włączenie specyficznych tkankowo fibroblastów i komórek śródbłonka do systemu aktywnego mechanicznie. Ten otwarty chip zapewnia bezprecedensowe narzędzie do badania interakcji nabłonkowych/mezenchymalnych i naczyniowych w wielu skalach rozdzielczości, od pojedynczych komórek po wielowarstwowe konstrukty tkankowe, umożliwiając w ten sposób molekularną analizę przesłuchów międzykomórkowych nabłonkowych narządów w zdrowiu i chorobie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Historycznie rzecz biorąc, naukowcy polegali na przedklinicznych testach na zwierzętach w celu odkrywania leków, ale coraz więcej tych metod było kwestionowanych z powodu słabej korelacji z ludzkimi wynikami1. Wdrożenie zasad "3R" w celu zastąpienia, zmniejszenia i udoskonalenia eksperymentów na zwierzętach zachęca naukowców do znalezienia nowych alternatywnych metod in vitro w celu wsparcia przedklinicznej oceny ryzyka toksykologii leków i chemicznych2. Jednak wielu opracowanym do tej pory modelom in vitro brakuje architektury biologicznej, złożoności komórkowej i środowiska mechanicznego niezbędnego do podsumowania dynamicznej natury ludzkich żywych organów3,4.

Konwencjonalne systemy przedkliniczne in vitro zazwyczaj wykorzystują monokultury 2D komórek ludzkich hodowanych na sztywnej powierzchni z tworzywa sztucznego. Metody te stanowią narzędzie do prowadzenia prostych badań mechanistycznych i umożliwiają szybkie badania przesiewowe kandydatów na leki. Ze względu na ich stosunkowo niski koszt i wysoką wytrzymałość, modele 2D są często łączone z automatycznymi systemami o wysokiej przepustowości i wykorzystywane do szybkiej identyfikacji potencjalnych kandydatów na leki na wczesnym etapie procesu opracowywania leku5,6. Jednak takie modele 2D nie zapewniają translacyjnego podejścia do modelowania odpowiedzi na poziomie tkanki, narządów lub ogólnoustrojowych na kandydatów terapeutycznych, co jest potrzebne do dokładnego przewidywania bezpieczeństwa i skuteczności leków na etapie przedklinicznym ich opracowywania. Płaskie hodowle komórkowe nie podsumowują natywnego mikrośrodowiska tkankowego, w tym złożonej interakcji wielokomórkowej, właściwości biomechanicznych i trójwymiarowej (3D) architektury tkanek ludzkich7. Komórki rosnące na płaskiej powierzchni często nie osiągają dojrzałego fenotypu, a zatem nie mogą reagować na bodźce farmakologiczne, tak jak w tkance natywnej. Na przykład pierwotne ludzkie komórki nabłonka pęcherzyków płucnych hodowane in vitro wykazują fenotyp płaskonabłonkowy i tracą kluczowe markery fenotypowe, w tym białka powierzchniowo czynne C i B (SP-C i SP-B)8. Oprócz niewystarczającego różnicowania, komórki pierwotne często stają się niewrażliwe na stresory biologiczne in vitro, ponieważ pewne szlaki biochemiczne związane z zapaleniem tkanek stają się niefunkcjonalne9. Taka utrata funkcji komórek wydaje się być przede wszystkim związana ze stosowaniem sztywnych substratów, a także z brakiem rozpuszczalnych czynników naturalnie uwalnianych przez tkankowo specyficzne komórki zrębu, takie jak fibroblasty płuc i komórki mięśni gładkich10,11.

Zrozumienie, że brak chemiczno-fizycznej i biologicznej złożoności ogranicza fizjologiczne zachowanie komórek in vitro, przyczyniło się do rozwoju bardziej wyrafinowanych modeli wielokomórkowych, które okazały się lepiej uchwycić złożoność ludzkich tkanek poza ciałem12,13. Od czasu stworzenia pierwszych modeli kokultur na początku lat siedemdziesiątych XX wieku14, wprowadzenie syntetycznych i naturalnych hydrożeli znacznie poprawiło zdolność do naśladowania natywnych mikrośrodowisk tkanek i stało się nieocenionym narzędziem do stymulowania różnicowania komórek, kierowania samoorganizacją komórek w struktury podobne do tkanek i przywracania natywnych funkcji tkanek15,16. Na przykład, gdy są hodowane na odpowiednim rusztowaniu 3D, ludzkie komórki mogą samoorganizować się w funkcjonalne struktury, takie jak sferoidy lub organoidy, wyrażając markery komórek macierzystych i są zdolne do samoodnawiania się17. W przeciwieństwie do tego, ludzkie komórki (w tym komórki macierzyste), gdy są hodowane na tradycyjnych podłożach 2D, szybko starzeją się i ulegają starzeniu po kilku przejściach18. Ponadto hydrożele mogą być "dostosowane" do określonych właściwości tkanki, takich jak porowatość, wielkość porów, grubość włókien, lepkosprężystość, topografia i sztywność, lub dalej modyfikowane przy użyciu składników komórkowych pochodzenia tkankowego i/lub bioaktywnych cząsteczek umożliwiających emulację stanów fizjologicznych lub patologicznych19,20. Pomimo ich ogromnego potencjału do testowania leków, modele 3D oparte na hydrożelu stosowane w badaniach farmaceutycznych nie oddają w pełni złożonej cytoarchitektury tkanek in vivo i brakuje im ważnych bodźców hemodynamicznych i mechanicznych normalnie obecnych w ludzkim ciele, w tym ciśnienia hydrostatycznego, cyklicznego rozciągania i ścinania płynów21.

Systemy mikrofizjologiczne (MPS), takie jak narządy na chipach (OOC), pojawiły się ostatnio jako narzędzia zdolne do rejestrowania złożonych reakcji fizjologicznych in vitro22,23. Modele te często wykorzystują platformy mikroprzepływowe, które umożliwiają modelowanie dynamicznego mikrośrodowiska żywych narządów.

Połączyliśmy zasady bioinżynierii tkankowej 3D i mechanobiologii, aby stworzyć model Open-Top Chip złożonej ludzkiej tkanki nabłonkowej. Pozwoliło nam to na dokładne odtworzenie wielokomórkowego i dynamicznego mikrośrodowiska tkanek nabłonkowych. Obejmuje to specyficzne dla tkanek sygnały biochemiczne i biomechaniczne naturalnie występujące w żywych organach, ale często zaniedbywane przez tradycyjne modele in vitro24. Open-Top Chip składa się z dwóch przedziałów: komory naczyniowej (Rysunek 1A) i komora zrębowa (Rysunek 1B) oddzielone porowatą membraną, co pozwala na dyfuzję składników odżywczych między dwiema komorami (Rysunek 1C). Przedział naczyniowy jest narażony na ciągły przepływ płynu w celu podsumowania fizjologicznego naprężenia ścinającego, a rozciągliwa konstrukcja komory zrębu pozwala na modelowanie obciążenia mechanicznego związanego z ruchami oddechowymi lub perystaltyką jelit. W komorze zrębu znajduje się przestrajalne rusztowanie hydrożelowe 3D zaprojektowane w celu wspierania fizjologicznego wzrostu fibroblastów specyficznych dla tkanki. Posiada zdejmowaną pokrywę, która ułatwia ustanowienie granicy faz powietrze-ciecz, warunek, który umożliwia lepsze naśladowanie ludzkiej fizjologii tkanek błony śluzowej, a także bezpośredni dostęp do tkanki w celu podawania leków bezpośrednio na warstwę nabłonkową. Rysunek uzupełniający 1 przedstawia niektóre z kluczowych elementów konstrukcji chipa Open-Top, w tym wymiary i przedziały biologiczne (rysunek uzupełniający 1A-D), a także główne kroki techniczne opisane w tym protokole (rysunek uzupełniający 1E).

Perfuzja układu Open-Top jest osiągana za pomocą programowalnej pompy perystaltycznej (Rysunek 1D). Konfiguracja pompy perystaltycznej pozwala na jednoczesne perfuzję 12 chipów Open-Top. W większości inkubatorów można umieścić dwie konfiguracje, które umożliwiają hodowlę do 24 chipów na inkubator. Rozciąganie mechaniczne odbywa się za pomocą specjalnie zaprojektowanego programowalnego regulatora ciśnienia podciśnienia (Rysunek 1E). Składa się z elektropneumatycznego regulatora podciśnienia sterowanego elektronicznie przez przetwornik cyfrowo-analogowy. Innymi słowy, elektropneumatyczny regulator podciśnienia generuje sinusoidalny profil podciśnienia o amplitudzie i częstotliwości określanej przez użytkownika. Odkształcenie cykliczne w zakresie od 0% do 15% jest generowane przez przyłożenie podciśnienia do kanału próżniowego układu Open-Top Chip o amplitudzie w zakresie od 0 do -90 kPa i częstotliwości 0,2 Hz. Jest to system wykonany na zamówienie, równoważny dostępnemu na rynku Flexcell Strain Unit, który został wcześniej przyjęty i opisany w innych artykułach25. Aby naśladować mechaniczne odkształcenie tkanki związane na przykład z ruchem oddechowym płuc lub perystaltyką jelita, siłownik pneumatyczny stosuje sinusoidalne fale próżniowe/odkształceniowe, których wielkość i amplitudę można dostosować do fizjologicznego poziomu naprężenia i częstotliwości, jakich ludzkie komórki doświadczają w swojej rodzimej tkance.

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną metodę inżynierii i hodowli odpowiedników nabłonka organotypowego na prototypowej platformie Open-Top Chip. Umożliwia generowanie złożonych modeli narządów, takich jak skóra, pęcherzyki zębodołowe, drogi oddechowe i okrężnica, przy jednoczesnej integracji przepływu płynu naczyniowego i mechanicznego rozciągania. Przedstawimy kluczowe aspekty techniczne, które muszą być brane pod uwagę przy wdrażaniu zasad inżynierii tkankowej do generowania złożonych modeli nabłonkowych. Omówimy zalety i możliwe ograniczenia obecnego projektu.

Przegląd głównych etapów stosowanych do osiągnięcia dojrzałości tkanek i narządów, w tym parametrów przepływu i rozciągania, jest podany w: Rysunek 2 dla skóry, Rysunek 3 dla pęcherzyka płucnego, Rysunek 4 dla dróg oddechowych, oraz Rysunek 5 dla jelita. Dodatkowe informacje dotyczące składu pożywek i odczynników stosowanych do hodowli różnych modeli narządów znajdują się w tabelach uzupełniających (tabela uzupełniająca 1 dla skóry; Tabela uzupełniająca 2 dla zębodołu; Tabela uzupełniająca 3 dla dróg oddechowych i tabela uzupełniająca 4 dla jelita).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie kolonoidy uzyskano z resekcji jelit zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego Szpitala Dziecięcego w Cincinnati (IBC 2017-2011).

1. Aktywacja powierzchni

  1. Przygotowanie buforu aktywacyjnego
    1. Umieść odczynniki sieciujące i bufor rozpuszczalnika pod komorą bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i pozwól im zrównoważyć się w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut przed użyciem.
    2. Rozpuść 5 mg środka sieciującego w 5 ml buforu rozpuszczalnika, używając sterylnego pojemnika nieprzepuszczającego światła lub przezroczystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml owiniętej folią aluminiową w celu ochrony roztworu sieciującego przed bezpośrednim działaniem światła.
    3. Wirować roztwór przez 1 minutę, aby usunąć wszystkie grudki, a następnie pipetować 50 μl roztworu sieciującego bezpośrednio do dolnego kanału chipa i 150 μl do komory otwartej.
    4. Usunąć nadmiar roztworu sieciującego z powierzchni chipa za pomocą aspiratora. Następnie odpipetować dodatkowe 50 μl roztworu sieciującego bezpośrednio do dolnego kanału chipa i 150 μl do komory otwartej, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza.
  2. Aktywacja za pomocą sieciownika UV
    1. Delikatnie zdejmij pokrywkę z chipa pod BSC i przechowuj go w sterylnym pojemniku.
    2. Przenieś wióry zawierające roztwór sieciujący na szalkę Petriego, zamknij szalkę Petriego, aby uniknąć zanieczyszczenia, i umieść szalkę z wiórami pod maszyną do sieciowania UV.
      UWAGA: Zdejmij pokrywkę szalki Petriego, aby zmaksymalizować ekspozycję na promieniowanie UV.
    3. Ustaw maszynę do sieciowania UV o szczytowej długości fali 365 nm o intensywności 100 μJ/cm2 i włącz światło UV na 20 min.
      UWAGA: Po 20 minutach obróbki UV roztwór sieciujący będzie wyglądał na ciemniejszy (brązowy).
    4. Umieść wióry z powrotem pod BSC i odessaj utleniony roztwór sieciujący. Następnie przepłucz wszystkie wióry trzykrotnie buforem rozpuszczalnika i pozwól wiórom wyschnąć pod BSC przez 5-10 minut, aby zakończyć chemiczną funkcjonalizację powierzchni polidimetylosiloksanu (PDMS).

2. Przygotowanie odpowiednika zrębu

  1. Przygotowanie 10x buforu rekonstrukcyjnego (100 ml)
    1. Rozpuścić 2,2 g wodorowęglanu sodu w 75 ml 0,067 M NaOH w wodzie podwójnie destylowanej.
    2. Dodać 4,76 g HEPES i doprowadzić objętość do 100 ml za pomocą podwójnie destylowanej wody.
    3. Sterylnie przefiltrować roztwór pod BSC za pomocą jednorazowego sterylnego filtra butelkowego z membraną 0,22 μm.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny przez około 6 miesięcy przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
  2. Oznaczanie objętości roztworu przed żelem
    1. Pomnóż liczbę wiórów potrzebnych do eksperymentu przez 150 μl (wewnętrzna objętość centralnej komory otwartej), aby oszacować ilość roztworu wstępnego żelu wymaganą do eksperymentu:
      Wymagana objętość = (liczba żetonów x 150) μL
    2. Przygotować roztwór żelu wstępnego kolagenu na lodzie przez zmieszanie: 1 objętość 10x EMEM zawierającej wybrane komórki, 1 objętość 10x buforu rekonstrukcyjnego (patrz krok 2.1), 8 objętości roztworu kolagenu I (10 mg/ml) i 1 μl 1 μl roztworu 1 N NaOH na każdy mg kolagenu I.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie dodatkowego wolumenu +15% w celu uwzględnienia błędów eksperymentalnych; Przykład opisany w sekcji 2.2 zawiera szczegółową procedurę krok po kroku dotyczącą przygotowania wystarczającej ilości roztworu wstępnego żelu na 12 chipsów i dodatkowe 15% objętości.
  3. Przygotowanie roztworu pre-żelu do odpowiednika zrębu (na 12 wiórów)
    1. Wprowadzić następujące roztwory pod BSC na lodzie: 10x EMEM; 10x Bufor rekonstrukcyjny (patrz krok 2.1); Roztwór kolagenu I (10 mg/ml); i sterylny roztwór 1 N NaOH.
    2. Hoduj tkankowo specyficzne komórki mezenchymalne zgodnie z zaleceniami dostawców do 80%-90% zlewania się, a następnie dysocjuj komórki za pomocą trypsyny lub innych metod zalecanych przez dostawcę komórek. Zebrać komórki w postaci osadu przez odwirowanie w temperaturze 250 x g przez 5 minut w temperaturze 24 °C.
    3. Zawiesić osad komórkowy w 225 μl lodowatego 10x EMEM i dodać 225 μl lodowatego buforu do rekonstrukcji 10x (patrz krok 2.1). Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie dodaj 1 800 μl lodowatego roztworu kolagenu I.
    4. Pipetuj w górę i w dół 5-6 razy, unikając pęcherzyków w celu wymieszania roztworu żelu na lodzie.
  4. Włączenie odpowiednika zrębu na chipie (dla 12 chipów)
    1. Zneutralizować roztwór żelu wstępnego za pomocą 18 μl 1 N NaOH. Delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 5-6 razy, a następnie odpipetuj 150 μl hydrożelu wypełnionego komórkami do centralnej komory Open-Top Chip, unikając pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Jeśli wymagane jest mikrowzory, przejdź do następnego kroku (sekcja 3).
    2. Zgrupować frytki na oddzielnych szalkach Petriego, w tym w nasadce probówki wirówkowej wypełnionej 2 ml sterylnego ddH2O na każdej szalce Petriego, i inkubować szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: Po 90 minutach hydrożel obciążony komórkami zostanie całkowicie spolimeryzowany.

3. Mikrowzory powierzchni (opcjonalnie)

  1. Wykonaj mikrowzór powierzchni hydrożelu zrębowego po pipetowaniu zneutralizowanego hydrożelu kolagenowego (nadal w stanie ciekłym) za pomocą stempli wydrukowanych w 3D.
    UWAGA: Stemple drukowane w 3D można uzyskać w różnych konfigurowalnych wzorach, jak opisano wcześniej w innym miejscu24.
  2. Odpipetować 20 μl zneutralizowanego roztworu żelu wstępnego kolagenu I na wzorzystą powierzchnię sterylnego stempla wydrukowanego w 3D i włożyć stempel do (na górze) komory otwartej, podczas gdy hydrożel zrębu jest jeszcze w postaci płynnej.
  3. Usuń wszelkie pozostałości hydrożelu, które mogą z górnej części komory otwartej, za pomocą aspiratora (lub pipety). Zgrupuj wszystkie wiórki na oddzielnych szalkach Petriego i umieść wirówkę o pojemności 15 ml w stożkowej probówce wypełnionej 2 ml sterylnego ddH2O na każdej szalce Petriego.
  4. Inkubować wszystkie szalki Petriego w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 90 minut, a następnie umieścić wiórki z powrotem pod BSC i delikatnie usunąć odciski za pomocą precyzyjnej pęsety, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia hydrożelu.

4. Powlekanie powierzchni nabłonka i naczyń krwionośnych specyficznymi tkankowo białkami ECM

  1. Powlekanie naczyniowej komory mikroprzepływowej białkami macierzy zewnątrzkomórkowej
    1. Pomnóż liczbę wiórów potrzebnych do eksperymentu przez 20 μl (objętość kanału naczyniowego), aby oszacować objętość roztworu do powlekania naczyń ECM wymaganego w eksperymencie:
      Wymagana objętość = (liczba żetonów x 20) μL
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie dodatkowych 15% objętości w celu uwzględnienia błędów eksperymentalnych.
    2. Przygotuj naczyniowy roztwór do powlekania ECM dla wszystkich wiórów (na przykład 300 μl na 12 chipsów) za pomocą lodowatego PBS lub HBSS.
      UWAGA: Zapoznaj się z tabelą protokołów dotyczących poszczególnych narządów w sekcji dotyczącej materiałów uzupełniających (Tabela uzupełniająca 1 dla skóry; Tabela uzupełniająca 2 dla zębodołu; Tabela uzupełniająca 2 dla dróg oddechowych i tabela uzupełniająca 4 dla jelita) w celu określenia konkretnych odczynników i zalecanego składu ECM.
    3. Odpipetować 20 μl naczyniowego roztworu powlekającego ECM do kanału naczyniowego każdego chipa.
  2. Pokrycie wierzchołkowej powierzchni odpowiednika zrębu białkami macierzy zewnątrzkomórkowej
    1. Pomnóż liczbę wiórów potrzebnych do eksperymentu przez 50 μL (objętość kanału naczyniowego), aby oszacować objętość roztworu do powlekania nabłonka ECM wymaganego w doświadczeniu:
      Wymagana objętość = (liczba wiórów x 50) μL
      UWAGA: zaleca się przygotowanie dodatkowych 15% objętości w celu uwzględnienia błędów eksperymentalnych.
    2. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu do powlekania ECM dla wszystkich wiórów (na przykład 750 μl na 12 wiórów) w lodowatym PBS lub HBSS i przenieś 50 μl nabłonkowego roztworu do powlekania ECM bezpośrednio na powierzchnię hydrożelu.
      UWAGA: Zapoznaj się z tabelą protokołów dotyczących poszczególnych narządów w sekcji dotyczącej materiałów uzupełniających (Tabela uzupełniająca 1 dla skóry; Tabela uzupełniająca 2 dla zębodołu; Tabela uzupełniająca 2 dla dróg oddechowych i tabela uzupełniająca 4 dla jelita) w celu określenia konkretnych odczynników i zalecanego składu ECM.
    3. Zgrupować frytki na oddzielnych szalkach Petriego, w tym na stożkowej nasadce probówki wirówki o pojemności 15 ml wypełnionej 2 ml sterylnego ddH2O na każdej szalce Petriego, a następnie inkubować szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny przed przystąpieniem do wysiewu komórek nabłonkowych.

5. Wysiewanie komórek nabłonkowych na odpowiedniku zrębu

  1. Hodowla komórek nabłonkowych
    1. Hoduj komórki nabłonkowe specyficzne tkankowo zgodnie z zaleceniami dostawców, aż do 80%-90% zlewu.
    2. Dysocjuj komórki za pomocą procedur enzymów proteolitycznych zgodnie z zaleceniami dostawcy komórek.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy zebrać komórki nabłonkowe przy niskim pasażu (P1-P2) w fazie aktywnego wzrostu, gdy osiągną one zbieżność między 70% a 90%.
    3. Po dysocjacji odwiruj komórki i zbierz je w postaci osadu.
    4. Zawiesić komórki nabłonkowe do odpowiedniej gęstości komórek/fragmentów, jak wskazano w tabeli protokołu specyficznego narządu.
      UWAGA: W tym badaniu roztwór komórkowy stosowano o gęstości 3 x 106 komórek/ml dla skóry, 1 x 106 komórek/ml dla pęcherzyka płucnego, 6 x 106 komórek/ml dla dróg oddechowych i 8 x 106 fragmentów/ml dla jelita.
  2. Wysiewanie komórek nabłonkowych
    1. Przenieś wióry z inkubatora do BSC. Odessać roztwór powlekający z kanału naczyniowego i trzykrotnie przepłukać naczyniowy kanał mikroprzepływowy 50 μl świeżej pożywki do hodowli komórek śródbłonka.
    2. Odessać roztwór powlekający z powierzchni hydrożelu i trzykrotnie przepłukać powierzchnię zrębu 100 μl świeżej pożywki do hodowli komórek nabłonkowych, aby usunąć nadmiar roztworu powlekającego.
    3. Odessać wyrastające podłoże i wysiać na powierzchnię hydrożelu 50 μl zawiesiny komórek nabłonka przy odpowiedniej gęstości komórek, jak wskazano w tabelach dodatkowych, a następnie przenieść wióry z powrotem do inkubatora na 2 godziny (lub na noc w przypadku kolonoidów).
    4. Delikatnie spłucz powierzchnię hydrożelu pożywką do hodowli komórkowych dwukrotnie, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Na koniec odświeżyć pożywkę przez autoklawowanie w szczelnych pojemnikach autoklawowalnych i podłączyć wióry do pompy perystaltycznej.

6. Łączenie chipów z przepływem

  1. Przygotowanie części fluidycznych
    1. Wytnij 2 cale biokompatybilnej rurki przesyłowej z elastomeru termoplastycznego (TPE) na bazie polipropylenu (TPE) (tabela materiałów), aby przygotować krótką rurkę mikroprzepływową, która jest wymagana do podłączenia chipów do zbiorników mediów.
    2. Wytnij 7,5 cala biokompatybilnych rurek przesyłowych TPE, aby uzyskać długie rurki mikroprzepływowe.
    3. Przygotuj wystarczającą ilość metalowych łączników 18 G i 19 G (tabela materiałów).
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie i wysterylizowanie przewodów i złączy opisanych w krokach 6.1.1 i 6.1.2 co najmniej 1 dzień przed podłączeniem chipów Open-Top do pomp perystaltycznych.
    4. Przekłuć pokrywę każdego zbiornika pożywki 4-calową igłą podskórną (tabela materiałów).
  2. Odgazowanie medium
    1. Pozwól, aby pożywka do hodowli komórkowej zrównoważyła się do temperatury pokojowej (RT).
    2. Przenieś potrzebną objętość pożywki do stożkowej rurki filtrującej.
    3. Zastosuj podciśnienie -20 PSI, aby odgazować medium (filtracja sterowana próżnią).
      UWAGA: Jeśli próżnia nie jest dostępna, pożywkę do hodowli komórkowej można pozostawić w inkubatorze do zrównoważenia na noc, aby osiągnąć podobne wyniki.
  3. Przygotuj chip Open-Top do przepływu płynu
    1. Umieść wióry i sterylne części płynne pod BSC i wyrównaj pokrywę (górną część) chipa Open-Top w celu uszczelnienia prototypu chipa Open-Top przed rozpoczęciem przepływu płynu.
    2. Odpipetować 200 μl odgazowanej pożywki do hodowli komórkowych (patrz tabele specyficzne dla narządów) do portu wlotowego zarówno górnego, jak i dolnego kanału chipa, zwracając uwagę, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
    3. Odpipetować 300 μl pożywki hodowlanej do krótkiej rurki mikroprzepływowej, aby zagruntować wewnętrzną powierzchnię probówek i podłączyć krótkie rurki do wlotów górnego i dolnego kanału chipa.
  4. Połączyć i zagruntować powierzchnie mikroprzepływowe
    1. Umieść zbiorniki pożywki w stojaku hodowlanym, podłącz igłę podskórną do dolnego wlotu wiórów, a na koniec umieść wszystkie wióry w nośniku (nośnikach) obudowy wewnątrz inkubatora.
    2. Podłącz chipy do pompy perystaltycznej, a następnie sprawdź wszystkie złącza, aby upewnić się, że wszystkie chipy są prawidłowo podłączone i że nie ma widocznych wycieków pożywki do hodowli komórkowych.
    3. Użyj przycisku Przedmuchiwanie na pompie i przytrzymaj go przez około 15 sekund lub do momentu, gdy kropelki pożywki do hodowli komórkowych pojawią się na końcu rurki odpływowej.
    4. Użyj systemu sterowania na pompie, aby ustawić odpowiednie natężenie przepływu chipa narządu (Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5).

7. Konserwacja chipów

  1. Konserwacja chipów narządowych
    1. Przygotować świeżą pożywkę do hodowli komórkowych nabłonka i/lub śródbłonka i przeprowadzić etapy odgazowywania (jak opisano wcześniej w kroku 6.2).
    2. Wstrzymaj pompę perystaltyczną, ostrożnie odłącz wióry od pompy i wyjmij nośnik(i) obudowy wiórów. Przenieś wióry z inkubatora do BSC i usuń objętość pożywki pozostałą w zbiornikach.
    3. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowych w górnym i dolnym zbiorniku wlotowym 5 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych i umieść nośnik(i) obudowę chipa z powrotem w inkubatorze. Podłącz wióry do pompy perystaltycznej i uruchom ponownie przepływ.
      UWAGA: Zaleca się korzystanie z funkcji Purge w celu szybkiego odświeżenia pożywki do komory naczyniowej i zmniejszenia ryzyka powstania pęcherzyków powietrza.
    4. Powtarzaj kroki 7.1.1-7.1.3 co drugi dzień, zgodnie z Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5.
  2. Ustanawianie granicy faz powietrze-ciecz (ALI)
    1. Wstrzymaj pompę perystaltyczną, ostrożnie odłącz wióry od pompy i wyjmij nośnik(i) obudowy wiórów. Przenieś wióry z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i usuń pozostałą objętość pożywki do górnego zbiornika.
    2. Delikatnie zassać całe medium z górnego kanału mikroprzepływowego i zacisnąć krótkie rurki mikroprzepływowe podłączone do górnych wlotów za pomocą zacisków do segregatorów, aby zmniejszyć parowanie mediów i konserwację ALI.
    3. Umieść chip Open-Top na nośniku (nośnikach) obudowy z powrotem do inkubatora i ponownie podłącz chipy do pompy perystaltycznej.
      UWAGA: Zaleca się korzystanie z funkcji Purge w celu szybkiego odświeżenia pożywki do komory naczyniowej i zmniejszenia ryzyka powstania pęcherzyków powietrza.
    4. Wznów przepływ, uruchamiając pompę perystaltyczną.
  3. Rozciąganie (opcjonalnie)
    1. Wstrzymaj pompę perystaltyczną i podłącz porty próżniowe chipów do modułu próżniowego za pomocą dwóch długich rurek mikroprzepływowych na chip.
    2. Użyj modułu próżniowego, aby dostosować ustawienie rozciągania do stanu zalecanego dla każdego narządu, jak określono w tabelach protokołów narządowych: Tabela uzupełniająca 1 dla skóry; Tabela uzupełniająca 2 dla zębodołu; Tabela uzupełniająca 2 dotycząca dróg oddechowych; oraz Tabela Uzupełniająca 4 dla jelita.
    3. Sprawdź wzrokowo połączenia rur, aby upewnić się, że wszystkie wióry są prawidłowo podłączone i nie ma widocznych kropel kapiącego medium.
    4. Wznów przepływ, uruchamiając pompę perystaltyczną.

8. Wysiewanie komórek śródbłonka w przedziale naczyniowym

  1. Przygotuj komórki i wióry do wysiewu komórek naczyniowych
    1. Hoduj komórki śródbłonka specyficzne tkankowo zgodnie z zaleceniami dostawców, aż do 80%-90% zlewania się. Oddzielić komórki za pomocą procedury enzymów proteolitycznych (zgodnie z zaleceniami lekarza) i na koniec ponownie zawiesić komórki śródbłonka w roztworze 3 x 106 komórek/ml.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, zbierz komórki śródbłonka przy niskim pasażu (P2-P4) w fazie aktywnego wzrostu, gdy osiągną zbieg między 70% a 90%.
    2. Wstrzymaj pompę perystaltyczną. Przenieś wióry z inkubatora do BSC, odłącz wióry od zbiorników pożywki i wszelkich podłączonych przewodów, a następnie zgrupuj wióry na oddzielnych szalkach Petriego.
    3. Odświeżyć pożywkę do hodowli komórkowych kompartmentu nabłonkowego świeżą pożywką do hodowli komórek nabłonkowych. Dwukrotnie przepłukać kanał naczyniowy świeżą pożywką do hodowli komórek śródbłonka, a następnie odessać pożywkę z przedziału naczyniowego.
  2. Wysiewanie komórek śródbłonka
    1. Zasiej dolny (naczyniowy) kanał 25 μl zawiesiny komórek śródbłonka (3 x 106 komórek/ml), odwróć wióry do góry nogami, aby komórki śródbłonka mogły przyczepić się do górnej powierzchni komory mikroprzepływowej.
      UWAGA: Dodać 50 μl zawiesiny komórek na chip (600 μl na 12 chipsów).
    2. Ułóż frytki na szalkach Petriego. Umieścić je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i pozwolić komórkom śródbłonka przyczepić się na 1 godzinę.
    3. Po 1 godzinie przenieś wióry z inkubatora do BSC. Dwukrotnie przepłucz kanał naczyniowy pożywką do hodowli komórek śródbłonka, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
    4. Powtórzyć kroki 8.2.1-8.2.2, aby ponownie zasiać kanał naczyniowy komórkami śródbłonka i ułożyć wióry płasko, aby ułatwić przyleganie komórek śródbłonka do dolnej powierzchni kanału naczyniowego.
  3. Podłącz ponownie chip do przepływu
    1. Napełnić zbiornik pożywki naczyniowej odgazowaną pożywką do hodowli komórek naczyniowych pod BSC.
    2. Umieść wióry z powrotem w pojemniku (nośnikach) obudowy wiórów i ponownie podłącz je do zbiorników medium na jednym końcu do pompy perystaltycznej na drugim końcu.
      UWAGA: Zaleca się korzystanie z funkcji Purge w celu szybkiego odświeżenia pożywki do komory naczyniowej i zmniejszenia ryzyka powstania pęcherzyków powietrza.
    3. Sprawdź wzrokowo połączenia mikroprzepływowe, aby upewnić się, że wszystkie chipy są prawidłowo podłączone i nie ma widocznych kropel kapiącego medium. Następnie wznów przepływ płynu, uruchamiając pompę perystaltyczną.

9. Typowe testy punktów końcowych

  1. Odłączanie chipów do testów punktów końcowych
    1. Wstrzymaj pompę perystaltyczną, ostrożnie odłącz wióry od pompy i wyjmij nośnik(i) obudowy wiórów. Przenieś nośnik(i) obudowy wiórów z inkubatora do BSC i uwolnij wióry.
    2. Delikatnie umyj centralną komorę Open-Top Chip pożywką do hodowli komórek nabłonkowych, a kanał naczyniowy pożywką do hodowli śródbłonka dwukrotnie, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia komórkowe.
    3. Zdejmij pokrywę chipa Open-Top, aby uzyskać dostęp do górnej komory chipa za pomocą pęsety.
  2. Barwienie immunologiczne w mikroskopii fluorescencyjnej
    1. Kontynuuj konwencjonalne utrwalanie, przepuszczalność i blokowanie próbki.
      UWAGA: W tym badaniu próbki utrwalono w 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 1 godzinę, a następnie spłukiwano PBS, permeabilizacją w 0,1% Triton X-100 przez 40 minut i blokowano w 1% albuminie surowicy bydlęcej przez 1 godzinę.
    2. Inkubować chipsy z przeciwciałami pierwszorzędowymi (tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie dwukrotnie przemyć nabłonek i śródbłonek chipów 200 μl PBS. Następnie należy postępować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi dla 2 h.
      UWAGA: Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe i przeciwciała drugorzędowe w PBS + 1% BSA w rozcieńczeniu 1:100 (przeciwciało pierwszorzędowe) i 1:200 (przeciwciało drugorzędowe).
  3. Immunohistochemia
    1. Za pomocą pęsety wyekstrahuj zrębowe odpowiedniki z głównej komory Open-Top Chip, zbierz je do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 10% neutralną buforowaną formaliną i inkubuj przez co najmniej 24 godziny.
    2. Przenieś stały odpowiednik zrębu do procesora tkanek i postępuj zgodnie z poniższymi krokami, aby uzyskać optymalne odwodnienie próbki.
      1. Zanurz hydrożel w 70% etanolu na 90 minut.
      2. Usuń 70% etanolu i zanurz hydrożel w 80% etanolu na 90 minut.
      3. Usuń 80% etanolu i zanurz hydrożel w 95% etanolu na 90 minut.
      4. Usuń 95% etanolu i zanurz hydrożel w 100% etanolu na 90 minut dwa razy.
      5. Usuń 100% etanol i zanurz hydrożel w roztworze ksylenu na 120 minut dwukrotnie.
      6. Usunąć roztwór ksylenu i dwukrotnie naciekać przetworzone odpowiedniki zrębu w wosku parafinowym przez 120 minut (~2 h).
    3. Osadź infiltrowane odpowiedniki zrębu w sekcyjnych blokach parafinowych.
    4. W tym momencie ich odpowiedniki zrębu można podzielić na bloki parafinowe za pomocą mikrotomu i przetworzyć zgodnie z konwencjonalnymi technikami histologicznymi26.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrowzory powierzchniowe
Mikrowzorce macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) można wykorzystać do odtworzenia konfiguracji przestrzennej interfejsu krypty jelitowej. Konfiguracja Open-Top Chip może być modyfikowana w celu zintegrowania mikrowzorzystych stempli specjalnie zaprojektowanych do naśladowania naturalnej topografii interfejsu nabłonka-zrębu okrężnicy (Rysunek 6A, B) i krypt jelitowych w skali mikrometra ( Rysunek 6C-E

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Open-Top Chip stanowi platformę umożliwiającą badanie złożonych interakcji komórkowych zachodzących między śródbłonkiem, zrębem i nabłonkiem w kontrolowanym mikrośrodowisku, w czasie rzeczywistym. Technologia ta oferuje kluczowe korzyści w porównaniu z konwencjonalnymi hodowlami organotypowymi i organoidowymi, takie jak integracja fizycznych i biochemicznych wskazówek, które są istotne dla odtworzenia mikrośrodowiska tkanek ludzkich, w tym płynne ścinanie (przepływ), cykliczne rozciąganie i rekonstrukcja topografii powie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują następujące interesy finansowe/osobiste powiązania, które można uznać za potencjalnie konkurencyjne interesy: Varone Antonio jest byłym pracownikiem Emulate Inc. i może posiadać udziały w Emulate.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x EMEM Lonza12-684FŚredni; Stroma
18 Gauge igłaMicroGroup316H18RWRurka ze stali nierdzewnej 316 spawana, 18RW Full Hard 
Igła o rozmiarze 19MicroGroup316H19RWRurka ze stali nierdzewnej 316 spawana, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT Cole-Palmer EW-95723-12Tubka, 0,25 mm, 12/opakowanie
70% etanolu i chusteczki  -  - Do sterylizacji powierzchni 
8-bromoadenozyna 3&,5′-cykliczna sól sodowa monofosforanu (8-Br-cAMP)SigmaB7880Średni suplement 
A-83-01 Tocris 2939
AdenineSigmaA9795
Zaawansowany DMEM/F12 Thermo12634010
Komórki nabłonka dróg oddechowych Technologiakomórek LifelineFC-0016
Folia aluminiowa  -  -  -
Komórki pęcherzyków płucnychCell BiologicsH6621
Anty-ABCA3   ABCAM AB24751 Mysie przeciwciało monoklonalne [3C9] 
Anty-Akwaporyna5 Alexa Fluor 647 ABCAM AB215225   Przeciwciało monoklonalne królika [EPR3747]   
Anty-akwaporyna5 ABCAM AB92320 Przeciwciało monoklonalne królika [EPR3747] 
Tubulina anty-beta IV   ABCAM AB11315 Mysie przeciwciało monoklonalne [ONS.1A6] 
Anty-CD31 (PECAM-1) ABCAM AB9498 Mysie przeciwciało monoklonalne [JC/70A]   
Anty-CK5   ABCAM AB75869 Rekombinowany monoklonalny preparat królików [AY1E6] 
Anty-cytokeratyna 10   ThermoFisher MA5-13705 Mysie przeciwciało monoklonalne (DE-K10) 
Anty-cytokeratyna 14   ABCAM AB7800 Mysie przeciwciało monoklonalne 
Anty-E-Kadheryna   ABCAM AB1416   Mysie przeciwciało monoklonalne 
Anty-Filaggrin   ThermoFisher PA5-79267 Przeciwciało poliklonalne królika   
Anty-HTI-56 Taras Biotech TB-29AHT1-56   Mysie przeciwciało monoklonalne (IgG1) 
Anty-HTII-280 Taras Biotech TB-27AHT2-280 Mysie przeciwciało monoklonalne (IgM) 
Anty-inwolucyna   ThermoFisher MA5-11803 Mysie przeciwciało monoklonalne (SY5) 
Antyizoformy TA p63-α, -β, -γ    Biolengend 618902 Przeciwciało poliklonalne królika   
Anty-Ki67   ABCAM AB8191 Mysie przeciwciało monoklonalne [B126.1] 
Anty-LAMP3   ABCAM AB111090 Przeciwciało poliklonalne królika 
Przeciw dojrzewaniu SP-B Siedem Wzgórza WRAB-48604 Przeciwciało poliklonalne królika 
Anty-MUC5AC   ThermoFisher PA5-34612 Przeciwciało poliklonalne królika   
Anty-Mucyna-2 SantaCruz Biotechnologysc-7314Mysie przeciwciało monoklonalne (IgG1) 
Anty-p63   Dako GA662 Mysie przeciwciało monoklonalne p63 Białko (Dako Omnis)  Klon DAK-p63 
Anty-PCNA   ThermoFisher PA5-32541 Przeciwciało poliklonalne królika   
Anty-podoplanina (AT-1α)   ABCAM AB128994 Przeciwciało poliklonalne królika 
Anti-Pro+ Dojrzały Białko Surfaktantu B ABCAM AB40876 Przeciwciało poliklonalne królika 
Anty-Surfaktant C     Siedem Wzgórza   WRAB-9337   Przeciwciało poliklonalne królika 
Anty-Uteroglobina/SCGB1A1 Hycult Biotech HM2178 Mysie przeciwciało monoklonalne [AY1E6] 
Anty-VE-kadheryna   ABCAM AB33168 Przeciwciało poliklonalne królika   
Anty-ZO-1   ThermoFisher 33-9100 Mysie przeciwciało monoklonalne [1A12] 
Kwas askorbinowySigmaA4544
Pipety zasysające Corning / Sokół 357558 2 ml, polistyren, pakowany pojedynczo 
Końcówki zasysające  -  - Sterylne (autoklawowane) 
B27Thermo17504044
Blocker BSA (10X) w roztworze PBS   ThermoFisher 37525 Środek blokujący 
Chlorek wapniaSigmaC7902
CHIR 99021Tocris4423
Kolagen IZaawansowany Biomatrix513310 mg/ml (Stroma)
Kolagen I Advanced BioMatrix50053 mg/ml (naczyniowy ECM)
Kolagen IVSigma  C5533
Kolagen-IVSigma C5533-5MG Kolagen z łożyska ludzkiego, 5 mg proszek, rozpuszcza się do 1 mg/ml 
Fibroblasty jelita grubego Biologia komórkowa  H6231
Komórki śródbłonka mikronaczyniowego okrężnicy  Biologia komórkowaH6203 
Rury stożkowe    -  - 15 ml i 50 ml  polipropylen, sterylny 
Środek sieciujący (ER-1) Naśladować 104615 mg proszek 
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, mleczan)   ThermoFisher D3571 Sonda DNA 
Fibroblasty skórneATCCPCS-201-010
Komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóryATCC CRL-3243
DeksametazonSigmaD4902
DMEMThermoFisher11054020
DMEM/F-12 GIBCO 
DMEM/F-12, GlutaMAX   GIBCO Numer katalogowy 10565-018 Pożywka podstawowa dla pożywki ALI 
Osioł Przeciw Myszom IgG H& L (Alexa Fluor 488)   ABCAM AB150105 Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła   
Osioł Przeciw Myszom IgG H& L (Alexa Fluor 568)   ABCAM AB175472 Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła 
Osioł Przeciw Myszom IgG H& L (Alexa Fluor 647)   ABCAM AB150107 Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła 
Osioł Anty-Królik IgG H& L (Alexa Fluor 488)   ABCAM   AB150073 Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła 
Osioł Anty-Królik IgG H& L (Alexa Fluor 568)   ABCAM AB175470 Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła 
Osioł Anty-Królik IgG H& L (Alexa Fluor 647)   ABCAM AB150075 Przeciwciało wtórne przeciw myszom osła 
Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (bez Ca2+, Mg2+) Corning 21-031-CV 1x 
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) ludzki, rekombinowany w E. coliPromoCellC-60170Średni suplement 
F-12 Szynka" sInvitrogen 21700-108Do naczyniowego
ECM FibriCol Zaawansowana BioMatrix 5133-20ML Roztwór kolagenu I (10 mg/ml)
FibronectinCorning356008
Fibronektyna, Ludzka, Naturalna,   Corning Numer telefonu 47743-654 Fibronektyna w osoczu ludzkim 
Precyzyjna pęseta z cienką końcówką Aven18056Stany Zjednoczone Technik Style 5B-SA Precyzyjna pęseta ze stali nierdzewnej
GlutamaxInvitrogen 21700-108
Glutamax Invitrogen 
Koza Anty-Mysia IgG H& L (Alexa Fluor 594)   ABCAM AB150080 Przeciwciało wtórne Goat Anti-Mysi   
Kozia Anty-Mysia IgG H& L (Alexa Fluor 647)   ABCAM AB150115 Przeciwciało wtórne Goat Anti-Mysi   
Kozia Anty-Mysia IgG H& L (FITC)   ABCAM AB6785 Przeciwciało wtórne Goat Anti-Mysi   
Kozia Anty-Mysia IgG1 Alexa Fluor 568   ThermoFisher A-21124 Przeciwciało wtórne kozie anty-mysie IgG1 
Kozia IgM Przeciw Myszom Alexa Fluor 488   ThermoFisher A-21042 Przeciwciało wtórne kozie anty-mysie IgM 
Ręczny aspirator próżniowy Corning 4930  - 
Inaktywowany termicznie Hyklon FetalSerum klonu II (FCS) Hemocytometr GE Healthcare Life SciencesSH30066.03
  -  - - 
Heparyna sól sodowa z błony śluzowej jelit świńSigmaH3149
HEPESThermo15630080
Human [Leu15] - Gastrin SigmaG9145
Kolonoidy ludzkieUzyskiwane z resekcjiUzyskiwane z resekcji klinicznych
Białko rekombinowane Ludzkie EGF TermoPHG0311L
czynnik wzrostu ludzkiego nabłonka Termo 
HyClone FetalKlon II Serum (USA)  GE Healthcare SH30066.02CZEŚĆ   Sterylne FBS  Inaktywowane termicznie 
Sól sodowa 21-hemibursztynianu hydrokortyzonuSigmaH4881
Hydrokortyzon Komórka promocyjna   C-64420 Średni suplement   
Wiaderko na lód  -  -  - 
Ismatec IPC-N Cole-PalmerEW-78000-41Cyfrowa pompa perystaltyczna o niskiej prędkości; q24-kanałowy (1 na 12 chipów)
ITESBioWhittaker17-839Z
Czynnik wzrostu keratynocytów (KGF), znany również jako podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów 7 (FGF-7), ludzki, rekombinowany w HEKPromoCellC-63821
KeratynocytyATCCPCS-200-010
Laminina BiolaminaCT521-0501 
Laminina, 521 KTG (CT521) Biolamina   CT521-0501 ludzka rekombinowana laminina 521       
Lung FibroblastCell BiologicsH6013
Technologia komórek linii życia fibroblastów płucFC-0049
Komórki śródbłonka mikronaczyniowego płucLonzaCC-2527
Komórki mięśni gładkich płucTechnologia komórek LifelineFC-0046
Licznik ręczny  -  -  -
Rurki przesyłowe Masterflex (TPE) Cole-PalmerFV-96880-02PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, bez czerwieni fenolowejTermo 
Probówka do mikrowirówek  -    -   1,5 mL, sterylne 
Mikroskop (z kamerą)  -  - Do obrazowania w jasnym polu 
N2Sigma17502001
N-acetylocysteinaSigmaA5099
Noggin (pożywka kondycjonowana HEK293T)SigmaN17001
Normalna surowica kozia   ThermoFisher 50062Z Rozwiązanie blokujące   
O-fosfosryloetanoloamina SigmaP0503
Paraformaldehyd (4% wag./obj.)   EMS Numer katalogowy: 15710 Środek utrwalający 
Penicylina StreptomycynaGIBCO15140122
Penicylina-streptomycyna Sigma P4333 10 000 j./ml; 10 mg/ml 
Końcówki do pipet    -  - P20, P200 oraz P1000  sterylna pipeta o niskiej przyczepności
 Gilson   F167380 P20, P200 oraz P1000 
Wymiana surowicy PluriQ (lub alternatywnie wymiana surowicy KO)AMSBIO (lub Thermo)N/A (lub C1910828010)
Poly-L-Lizyna powlekana   Sigma P0425 Szkiełka szklane 
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProgesteronSigmaP8783
ProLong Gold   ThermoFisher P36931 Mocowanie zapobiegające blaknięciu z DAPI 
Kwas retinowy Inhibitor SigmaR2625
ROCK (Y27632)TocrisTB1254-GMP/10
R-spondyna (pożywka kondycjonowana HEK293T)Suplementy SigmaSCC111
SAGM SingleQuots LonzaCC-4124
SAGMTM Pożywka do wzrostu komórek nabłonka małych dróg oddechowych BulletKitTM Lonza CC-4124 Średnie suplementy 
SB2001190 Tocris 1264/10
Pipety serologiczne  -  - 2 ml, 5 ml, 10 ml i 25 ml o niskiej zawartości endotoksyny, sterylne 
Pożywka do wzrostu komórek nabłonka małych dróg oddechowych (SAGM)Lonza CC-4124 
Bufor rozpuszczalnikowy (ER-2) Naśladować 10462Butelka 25 ml 
Steriflip-HV MilliporeSE1M003M00Sterylna stożkowa rurka filtrująca
Sterilin 100 mm Kwadratowe szalki PetriegoThermo103Sterylne, 1 na 6 chipsów 
Kolby T25  -  -  -
Kolby T75  -  -  - 
Tri-jodotyroninaSigmaT5516
Triton X-100 (0,3% (vol/vol)   Sigma T8787 Środek permeabilizacyjny 
Błękit trypanowy Sigma 93595 0,4% roztwór 
Rozwiązanie TrypEE Sigma 12604013 Rozwiązanie do odłączania komórek 
TWEEN-20 Sigma P2287 Środek permeabilizacyjny 
Piekarnik ze światłem UV (szczytowa częstotliwość 365 nm, intensywność 100 &mikro; J/cm2)VWR21474-598UVP, dalekiego zasięgu UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Konfiguracja próżni  -  - Ciśnienie minimalne: -70 kPa
Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego 165 (VEGF-165) ludzki, rekombinowany w E. coliPromoCellC-64420
VEGF-165   Komórka promocyjna   C-64420 Średni suplement 
Czynnik von Willebranda sprzężony FITC   ABCAM AB8822 Przeciwciało poliklonalne owiec 
Kąpiel wodna (lub koraliki)  -  - Ustaw na 37 ° C 
Wnt3A (medium kondycjonowane L-Wnt3A)ATCCCRL-2647
1132008235050061 klinicznych PHG031111043023Szkiełka mikroskopowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
  2. Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953(2021).
  3. Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  4. Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
  5. MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  6. Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  7. Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322(2020).
  8. Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288(2015).
  9. Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
  10. Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
  11. Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
  12. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  13. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  14. Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
  15. Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
  16. Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
  17. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  18. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  19. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323(2019).
  20. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  21. Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
  22. Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139(2021).
  23. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  24. Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957(2021).
  25. Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  26. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
  27. Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
  28. Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
  29. Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  30. Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
  31. Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Open Top Organ ChipEpithelial Tissue ModelsMicrofluidic PlatformBarrier FunctionStromal HydrogelEndothelial CellsSurface MicropatterningAir Liquid InterfaceMultilayered EpitheliumVascular Channel

Related Articles