Method Article

Metody i protokoły obrazowania na żywo w fazie rozwoju

DOI:

10.3791/64642

⸱

January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OMÓWIONE ARTYKUŁY:

Januschke, J., Loyer, N. Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila z skrzepami fibryny do obrazowania na żywo. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego montażu obwodów węchowych u Drosophila. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw danio pręgowanego i osobników młodocianych poprzez usunięcie czaszki i skóry. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Równoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z komorą na próbki. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (163), 10.3791/61713 (2020).

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS obrazowanie żywych komórek podczas rozwoju neuronów. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (168), 10.3791/62165 (2021).

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans przy użyciu stymulowanej mikroskopii rozpraszania Ramana. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w gastruli danio pręgowanego. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój charakteryzuje się dynamiczną zmianą struktur na poziomie organelli, komórek i narządów. Zdolność obrazowania poklatkowego do zbierania czterowymiarowych informacji z tej samej struktury w jej stanie fizjologicznym sprawia, że jest to idealna technika do badania dynamicznego procesu rozwoju 1,2,3,4,5,6. Ogromna ilość danych zebranych za pomocą obrazowania na żywo umożliwia również ilościową analizę rozwoju. Chociaż obrazowanie poklatkowe jest szerzej stosowane w jednowarstwowych hodowlach komórkowych, obrazowanie trójwymiarowych żywych tkanek lub zwierząt jest znacznie trudniejsze ze względu na trudności techniczne, takie jak rozpraszanie światła żywych tkanek, opracowanie odpowiedniej strategii montażu i metody znakowania, utrzymanie prawidłowego stanu fizjologicznego podczas intensywnego okresu obrazowania, dostęp do odpowiedniego mikroskopu, itd. Wyzwania te ograniczają wykorzystanie obrazowania na żywo w wielu laboratoriach. W tym zbiorze metod w siedmiu artykułach opisano nowe metody przygotowywania żywych próbek, etykietowania i manipulacji laserowej. Wszystkie te metody ułatwiają obrazowanie na żywo procesów rozwojowych pod różnymi kątami.

Bezpośrednie obrazowanie głębokich obszarów jest technicznie trudne ze względu na silne rozproszenie żywych tkanek. To rozpraszanie można zminimalizować poprzez odsłonięcie narządów wewnętrznych poprzez rozwarstwienie, poprawiając w ten sposób rozdzielczość przestrzenną obrazów. W tej kolekcji Januschke i Loyer7 opisali protokół preparowania mózgów larw Drosophila oraz metodę montażu przy użyciu skrzepów fibryny. Ta strategia montażu pozwoliła na obrazowanie poklatkowe przy użyciu odwróconych mikroskopów wielu próbek na tej samej czaszy, ponieważ wymagała jedynie dodania fibrynogenu i trombiny. Li i Luo8 przedstawili protokół preparacji eksplantatu czułkowo-mózgowego z poczwarek much i warunków hodowli ex vivo , które utrzymywały prawidłowy rozwój obwodu węchowego przez 24 godziny. Opracowany przez nich system umożliwił wizualizację celowania aksonalnego i dendrytycznego podczas montażu obwodu węchowego muchy na podstawie jej stanu fizjologicznego. Ten system eksplantatów nadaje się do mikroskopu dwufotonowego i mikroskopu siatkowego z arkuszami świetlnymi z obrazowaniem opartym na optyce adaptatywnej, umożliwiając zarówno długotrwałe obrazowanie ciągłe, jak i szybkie obrazowanie z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w krótkim czasie. Schramm i wsp.9 opracowali minimalnie inwazyjną procedurę chirurgiczną polegającą na usunięciu skóry i miękkiej chrząstki czaszki danio pręgowanego poprzez mikropeeling. Pozwoliło im to zaobserwować niektóre kluczowe zdarzenia w późniejszych stadiach rozwoju, w tym różnicowanie neuronów, dojrzewanie, plastyczność i przejściowość Ca2+ do 30 dni po zapłodnieniu. Umożliwiło im to również wykonanie obrazowania na żywo po pigmentacji skór larw danio pręgowanego. Oprócz preparacji, odpowiednie mocowanie próbek ma również kluczowe znaczenie dla obrazowania na żywo. Ratke i wsp.10 przedstawili ramy eksperymentalne do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu zarodków much za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten zwiększył ogólną przepustowość i jest idealny do badań porównawczych.

Oprócz przygotowania próbki, nowe metody znakowania ułatwiają wizualizację określonych struktur w żywych tkankach. Terzi i wsp.11 opisali genetycznie kodowany bioczujnik specyficzny dlaH2O2, roGFP2-Orp1, do obrazowania wewnątrzkomórkowych poziomówH2O2 z hodowanych neuronów danio pręgowanego i całych larw podczas rozwoju. Jedną z ważnych zalet tego genetycznie kodowanego biosensora H2O2 była poprawa rozdzielczości czasowej i przestrzennej wykrywania H2O2. Inne badanie przeprowadzone przez Mutlu i wsp.12 opisało mikroskopię stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS), bezznacznikową metodę obrazowania chemicznego do szybkiego i ilościowego wykrywania lipidów w żywych komórkach z rozdzielczością subkomórkową. ZarównoH2O2, jak i lipidy są łatwo tracone podczas utrwalania próbki. Opracowanie metod znakowania lub obrazowania w żywych tkankach nie tylko pozwoliło obejść to wyzwanie, ale także zachowało informacje przestrzenne i czasowe o tych strukturach w procesach biologicznych.

Wreszcie, światło może być również używane do ablacji komórek. Boutillon i wsp.13 pokazali metodę ablacji głębokich i przestrzennie dobrze zdefiniowanych objętości u danio pręgowanego za pomocą mikroskopu dwufotonowego. W porównaniu z ablacjami komórkowymi opartymi na laserze ultrafioletowym, laser dwufotonowy poprawił rozdzielczość osiową i penetrację tkanek. Protokół ten zapewnił strategię perturbacyjną do badania interakcji między komórkami podczas rozwoju.

Postęp technologii mikroskopowych pozwolił nam zrozumieć wiele procesów rozwojowych w czterech wymiarach. Protokoły zawarte w tym zbiorze pomogą większej liczbie naukowców pokonać barierę techniczną związaną z obrazowaniem na żywo w różnych systemach biologicznych. Przewidujemy, że w przyszłości powstaną kolejne metody ułatwiające obrazowanie na żywo.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten problem z kolekcją JoVE Method został sfinansowany przez NIH 1K99DC01883001. Dziękuję mojemu mentorowi podoktorskiemu Liqun Luo, moim współpracownikom Ericowi Betzigowi i Tian-Ming Fu za silne wsparcie w rozwijaniu mojego zainteresowania obrazowaniem poklatkowym podczas mojego projektu podoktorskiego. Dziękuję również School of Brain Science and Brain Medicine na Uniwersytecie Zhejiang za rekrutację i wsparcie w kontynuowaniu badań nad obrazowaniem poklatkowym w moim własnym laboratorium.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rieger, S., Wang, F., Sagasti, A. Time-lapse imaging of neural development: zebrafish lead the way into the fourth dimension. Genesis. 49 (7), 534-545 (2011).
  2. Wong, C., Chen, A. A., Behr, B., Shen, S. Time-lapse microscopy and image analysis in basic and clinical embryo development research. Reproductive Biomedicine Online. 26 (2), 120-129 (2013).
  3. Ezin, M., Fraser, S. Time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  4. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Current Opinion in Cell Biology. 17 (6), 676-681 (2005).
  5. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  6. Christen, P., Muller, R. In vivo visualisation and quantification of bone resorption and bone formation from time-lapse imaging. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 311-317 (2017).
  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Live ImagingDrosophilaImmobilizationTime lapse ImagingOlfactory Circuit AssemblyIn Vivo ImagingBrain TissueZebrafish LarvaeLight Sheet Fluorescence MicroscopyNeuronal DevelopmentROS ImagingLipid Storage DynamicsCaenorhabditis ElegansStimulated Raman Scattering MicroscopyTwo photon MicroscopeVolume Ablations

Related Articles