Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego

DOI:

10.3791/64644

⸱

12 maja 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół zmodyfikowanej techniki testu immunoenzymatycznego połączonego z enzymem kanapkowym do ilościowego pomiaru dwóch składników pozostałości po pułapkach zewnątrzkomórkowych neutrofili, kompleksów DNA sprzężonego z mieloperoksydazą i sprzężonego DNA elastazy neutrofilowej, pochodzących z aktywowanych neutrofili.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre bodźce, takie jak mikroorganizmy, powodują, że neutrofile uwalniają zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET), które są zasadniczo strukturami przypominającymi sieć, składającymi się z DNA z ziarnistymi białkami, takimi jak mieloperoksydaza (MPO) i elastaza neutrofilowa (NE) oraz białka cytoplazmatyczne i cytoszkieletowe. Chociaż zainteresowanie NET ostatnio wzrosło, nie jest dostępna żadna czuła, wiarygodna metoda testowa do pomiaru NET w warunkach klinicznych. W artykule opisano zmodyfikowany test immunoenzymatyczny sprzężony z enzymami kanapkowymi do ilościowego pomiaru dwóch składników krążących NET, kompleksów MPO-DNA i NE-DNA, które są specyficznymi składnikami NET i są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej jako produkty rozpadu NET. W teście wykorzystuje się specyficzne przeciwciała monoklonalne dla MPO lub NE jako przeciwciała wychwytujące i przeciwciało wykrywające specyficzne dla DNA. MPO lub NE wiąże się z jednym miejscem wychwytywania przeciwciała podczas początkowej inkubacji próbek zawierających kompleksy MPO-DNA lub NE-DNA. Test ten wykazuje dobrą liniowość i wysoką precyzję między testami i wewnątrz testów. Zastosowaliśmy go u 16 pacjentów z COVID-19 z towarzyszącym zespołem ostrej niewydolności oddechowej i stwierdziliśmy, że stężenia MPO-DNA i NE-DNA w osoczu były znacznie wyższe niż w osoczu uzyskanym od zdrowych osób z grupy kontrolnej. Ten test detekcyjny jest wiarygodną, wysoce czułą i użyteczną metodą badania charakterystyki NET w ludzkim osoczu i supernatantach hodowlanych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego określania powstawania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w płynach biologicznych za pomocą testu immunoenzymatycznego typu sandwich (ELISA) do wykrywania kompleksów mieloperoksydazy (MPO) i elastazy neutrofilowej (NE) za pomocą DNA1,2. NET składają się ze szkieletu DNA ozdobionego proteazami przeciwdrobnoustrojowymi pochodzącymi z granulek neutrofili3,4. Zarówno kompleksy MPO-DNA, jak i NE-DNA są ważnymi i specyficznymi składnikami NET i są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej jako produkty rozpadu NETs3,4.

Oprócz ich ważnej fizjologicznej roli w obronie przeciwdrobnoustrojowej3, NET mają również różne patologiczne skutki4,5, w tym promowanie trombogenezy6 i pogorszenie sepsy7. W związku z tym ostatnio coraz większą uwagę zyskują sieci NET. Niemniej jednak kwantyfikacja in vivo NET okazała się trudna ze względu na brak czułej, wiarygodnej metody oznaczania ilościowego.

Dostępnych jest kilka metod, w tym bezpośredni pomiar NET za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej8,9 i cytometria przepływowa10 oraz pośredni pomiar krążącego bezkomórkowego DNA, nukleosomów i cytrulinowanego histonu H3, ale każda metoda ma swoje zalety i ograniczenia11. Chociaż mikroskopowa metoda immunofluorescencyjna jest specyficzna dla NET i wyraźnie pokazuje lokalizację i stopień powstawania NET, próbki są ograniczone do tkanek biopsyjnych i wydzielanych materiałów. Co więcej, metoda ta musi być wykonywana przez wykwalifikowanych badaczy i wymaga długiego czasu na uzyskanie wyników. Pomiar poziomów krążących składników związanych z NET za pomocą cytometrii przepływowej jest łatwy i szybko dostarcza wyników; jednak metoda nie jest specyficzna dla NETs12.

My13 i inni1,2 opracowali wysoce czuły i niezawodny test do pomiaru krążących składników NET, DNA sprzężonego MPO lub NE, w ludzkim osoczu za pomocą zmodyfikowanej techniki ELISA, która wykorzystuje specyficzne przeciwciała dla MPO lub NE jako przeciwciała wychwytujące i przeciwciało wykrywające specyficzne dla DNA. Test ten może być również stosowany ex vivo do identyfikacji składników NET w supernatantach hodowli komórkowych uwalnianych przez aktywowane neutrofile w odpowiedzi na stymulację 12-mirystynianianem forbolu 13-octanu (PMA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez instytucjonalne komisje rewizyjne Uniwersytetu Medycznego w Aichi (2017-H341, 2019-H137). Od każdego uczestnika uzyskano pisemną świadomą zgodę.

1. Przygotowanie odczynnika

UWAGA: Aby przeprowadzić test ELISA typu sandwich, odczynniki są przygotowywane w sposób opisany poniżej.

  1. Bufor do powlekania:
    1. Aby uzyskać bufor węglanowo-wodorowęglanowy o stężeniu 0,1 mol/l, należy odważyć 10,6 g bezwodnego węglanu sodu (masa cząsteczkowa 106 g/mol) i 8,4 g wodorowęglanu sodu (masa cząsteczkowa 84 g/mol).
    2. Dodaj go do około 900 ml wody destylowanej w zlewce.
    3. Dostosować pH buforu do 9,6, dodając wymaganą ilość rozcieńczonego kwasu solnego lub wodorotlenku sodu.
    4. Sprawdź pH za pomocą pH-metru.
    5. Następnie dodaj wymaganą objętość wody destylowanej, aby uzyskać całkowitą objętość 1,000 ml.
    6. Przechowywać bufor węglanowo-wodorowęglanowy o stężeniu 0,1 mol/l w lodówce w temperaturze 4 °C.
  2. Bufor blokujący:
    1. Dodać około 250 μl 20% azydku sodu i 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 70 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) złożonej ze 137 mmol/L NaCl, 8,1 mmol/L Na2HPO4, 2,68 mmol/L KCl i 1,47 mol/L KH2PO4 (pH 7,4) i delikatnie wymieszać.
    2. Dodaj wodę destylowaną, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml. Końcowe stężenia albuminy surowicy bydlęcej i azydku sodu wynoszą odpowiednio 1% i 0,05%. Odczekaj 10 minut, a następnie roztwór jest gotowy do użycia.
  3. Roztwór myjący: Przygotować 0,5% eteru tert-oktylofenoksyetoksyetanolu t-oktylofenylowego glikolu polietylenowego (Triton X-100) w wodzie destylowanej.
    1. Rozcieńczyć 100% Triton X-100 do 10% wodą destylowaną i odstawić 10% roztwór na 1 dzień przed użyciem.
    2. Następnie ponownie rozcieńczyć 10% roztwór Triton X-100 20-krotnie wodą destylowaną, aby uzyskać stężenie 0,5%.
  4. Rozcieńczenie przeciwciał:
    1. Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące (przeciwciało anty-MPO [1 mg/ml] lub przeciwciało anty-NE [1 mg/ml]) w stosunku 1:2 000 w buforze otoczkowym (pH 9,6) przed użyciem w 1. dniu testu (patrz poniżej), a przeciwciało wykrywające (przeciwciało anty-DNA sprzężone z peroksydazą) do 1:40 z PBS przed użyciem w 3. dniu testu (patrz poniżej).
      UWAGA: W eksperymencie wstępnym rozcieńczyć przeciwciała typu izo (królik IgG [5 mg/ml] i mysi klon IgG1 Ci4 [0,5 mg/ml]) do 1:10 000 i 1:1 000 w buforze powlekającym (pH 9,6).
  5. Roztwór substratu ABTS: W zależności od liczby próbek rozpuścić jedną, dwie lub trzy tabletki kwasu 2,2'-azyno-bis(3 etylobenzotiazolino-6-sulfonowego (ABTS) w 5 ml, 10 ml lub 15 ml buforu ABTS (zawierającego nadboran sodu, kwas cytrynowy i wodorofosforan disodowy); na próbkę potrzeba 100 μl. Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 2-8 °C, chronić przed światłem. Roztwór jest stabilny do 3 miesięcy.

2. Pobieranie i przechowywanie próbek

  1. Izolacja plazmy:
    1. Pobrać 4 ml próbek krwi obwodowej do probówki do pobierania krwi z heparyną litową przez nakłucie żyły strzykawką 22 G i odwirować przy 1 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Przenieść supernatant do probówki z bezpiecznym zamkiem o pojemności 2 ml.
    3. Ponownie odwirować supernatant przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich pozostałości komórek.
    4. Zebrać supernatant do nowej probówki z bezpiecznym zamknięciem, nie naruszając osadu znajdującego się na dnie probówki.
    5. Otrzymane osocze należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Aby uzyskać wyniki o wysokiej przepustowości za pomocą tego testu, wymagane są próbki dobrej jakości. Jeśli używane są próbki osocza, należy przeprowadzić drugie wirowanie w celu usunięcia wszelkich pozostałości komórek. Należy unikać wielokrotnego rozmrażania próbek. Użyj heparyny jako antykoagulantu, ponieważ EDTA wpływa na aktywność DNazy.
  2. Izolacja wielojądrzastych neutrofili
    1. Pobrać próbki krwi obwodowej do probówki do pobierania krwi z heparyną litową przez nakłucie dożylne strzykawką 22 G.
    2. Warstwę 6 ml krwi na 6 ml jednoetapowych polimorfów i odwirować probówki o sile 1000 x g przez 45 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Zbierz trzecią warstwę kożucha zawierającą neutrofile i umyj ją trzykrotnie w wolnym od czerwieni fenolowej RPMI-1640 przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Ponownie zawiesić neutrofile w wolnym od czerwieni fenolowej RPMI-1640 zawierającym 2 mM L-glutaminę uzupełnioną 6% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i policzyć komórki w polu mikroskopu za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: Ta metoda daje czystość od 96% do 98% przy żywotności większej niż 95%, co oceniano przez wykluczenie barwnika błękitu trypanowego.
  3. Aktywacja wielojądrzastych neutrofili i NETozy in vitro
    1. Rozcieńczyć świeżo wyizolowane neutrofile wielojądrzaste do 1 × 105 komórek/ml w wolnym od czerwieni fenolowej RPMI-1640 zawierającym 2 mM L-glutaminę uzupełnioną 6% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i wysiewać je w szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm.
    2. Aby indukować NET, stymulować wielojądrzaste neutrofile za pomocą 25 nM PMA przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2/95% powietrzu.
    3. Po 4 godzinach inkubacji częściowo roztrawić NET, dodając 0,6 μg/ml DNazy I bezpośrednio do szalek hodowlanych przez 15 minut w temperaturze pokojowej i zatrzymać aktywność DNazy I, dodając 5 mM EDTA.
    4. Zebrać pożywkę zawierającą zsyntetyzowane sieci NET i odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
    5. Otrzymać supernatanty z czterech zdrowych prób kontrolnych, wymieszać i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Neutrofile stymulowane PMA trawione przez DNazę uzyskane z czterech zdrowych grup kontrolnych są używane jako standard NET1,14,15. Wygeneruj krzywą kalibracyjną z seryjnie rozcieńczonego wzorca NET za pomocą PBS i przypisz wartości gęstości optycznej (OD) uzyskane z nierozcieńczonego wzorca NET jako 100% NET.

3. Metoda oznaczania

UWAGA: Kroki do przeprowadzenia testu są szczegółowo opisane poniżej.

  1. Dzień 1
    1. Nałożyć łącznie 100 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-MPO lub anty-NE zawierającego 0,05 μg przeciwciała do każdego dołka płytki, w tym do studzienki ślepej.
      UWAGA: Bufor powlekający nie może zawierać żadnego rodzaju detergentu, ponieważ w przeciwnym razie przeciwciała mogą nie wiązać się równomiernie i płynnie ze ściankami każdej studzienki. Aby zapobiec efektowi haczyka, stężenie białka otoczki nie może przekraczać 20 μg/ml, ponieważ stężenia powyżej tego poziomu nasycą większość dostępnych miejsc na płytce do mikromiareczkowania. Typowy zakres stężeń roztworów do powlekania białek wynosi 2-10 μg/ml. Do wstępnego eksperymentu należy użyć rozcieńczonego przeciwciała kontrolnego izotypu IgG królika do powlekania zamiast specyficznych przeciwciał monoklonalnych przeciwko MPO. Do powlekania należy użyć rozcieńczonego mysiego przeciwciała kontrolnego IgG1 przeciwko swoistemu przeciwciału monoklonalnemu przeciwko NE.
    2. Przykryć płytkę przylepną osłoną z tworzywa sztucznego, aby zapobiec parowaniu próbki, i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić związanie przeciwciał wychwytujących.
  2. Dzień 2
    1. Wyrzuć rozcieńczony roztwór przeciwciała ze studzienek, a następnie odpipetuj 300 μl roztworu płuczącego na studzienkę i powtórz tę procedurę mycia trzy do czterech razy.
    2. Usuń nadmiar PBS, stukając płytką do sucha o ręcznik papierowy.
    3. Zablokować każdą studzienkę płytki ELISA 200 μl buforu blokującego.
    4. Przykryj płytkę szczelnie samoprzylepną plastikową osłoną i inkubuj ją przez 1,5-2 godziny w temperaturze pokojowej, aby zatkać studzienki.
    5. Całkowicie wyrzuć roztwór blokujący ze studzienek, a następnie odpipetuj 300 μl roztworu płuczącego na studzienkę i powtórz tę procedurę mycia trzy do czterech razy.
    6. Usuń nadmiar PBS, stukając płytką do sucha o ręcznik papierowy.
    7. Nałożyć łącznie 25 μl osocza lub pożywki na każdą studzienkę z wyjątkiem studzienki ślepej i dodać 75 μl PBS jako rozcieńczalnik, aby uzyskać końcową objętość 100 μl; dodać 100 μl PBS do studzienki ślepej próby.
    8. Następnie mieszać próbki w temperaturze pokojowej przez 10 s, umieszczając płytkę na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min.
    9. Nałożyć 2 μl 100-krotnie rozcieńczonej DNazy I (0,03 mg/ml) do każdej studzienki, w tym do studzienki ślepej (końcowe stężenie DNazy I w mieszaninie reakcyjnej: 0,6 μg/ml).
    10. Uszczelnić płytkę samoprzylepną plastikową osłoną i dokładnie mieszać próbki w temperaturze pokojowej przez 10 s, umieszczając płytkę na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min.
      UWAGA: Aby ocenić optymalne warunki trawienia DNA, podczas opracowywania testu, inkubowaliśmy próbki zawierające DNA związane z MPO od pacjentów z COVID-19 z 0-0,9 μg/ml DNazy I przez 15 minut w RT i użyliśmy płytek pokrytych specyficznym przeciwciałem wychwytującym dla MPO lub dopasowanym gatunkowo przeciwciałem kontrolnym ISO.
    11. Próbki należy inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Zdejmij samoprzylepną plastikową osłonę i nałóż 1 μl 0,5 M EDTA do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję DNazy.
    13. Ponownie uszczelnij płytkę samoprzylepną plastikową osłoną i potrząsaj nią z prędkością 15 sekund w temperaturze pokojowej, umieszczając ją na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min.
    14. Następnie inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić składnikom białkowym NET przyłączenie się do przeciwciał wychwytujących.
  3. Dzień 3
    1. Zdejmij samoprzylepną plastikową osłonę i wylej roztwór z dołków.
    2. Całkowicie wylać roztwór ze studzienek, a następnie odpipetować 300 μl roztworu płuczącego na studzienkę i powtórzyć tę procedurę mycia trzy do czterech razy.
    3. Do każdej studzienki należy nałożyć łącznie 100 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-DNA sprzężonego z peroksydazą.
    4. Szczelnie uszczelnić płytkę samoprzylepną plastikową osłoną i inkubować ją przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
    5. Całkowicie wyrzuć roztwór ze studzienek, a następnie pipetuj 300 μl roztworu płuczącego na studzienkę i powtórz tę procedurę mycia trzy do czterech razy.
    6. Ostrożnie usuń pozostały roztwór.
    7. Nałóż łącznie 100 μl roztworu podłoża ABTS na każdą studzienkę i przykryj płytkę samoprzylepną plastikową osłoną.
    8. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min.
      UWAGA: Monitoruj płytkę w odstępach 5-minutowych, aż do uzyskania żądanych odczytów OD.
    9. Dodaj w sumie 50 μl 2 M kwasu siarkowego, aby zatrzymać reakcję.
    10. Wymieszaj płynną zawartość studzienek, ostrożnie stukając w bok talerza.
    11. Włącz czytnik mikropłytek i podłącz go do komputera.
    12. Otwórz aplikację na komputerze.
    13. Na pasku stanu utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę.
    14. Ustaw wszystkie następujące parametry do odczytu płyty: Typ odczytu, Absorbancja; Tryb odczytu, punkt końcowy; Długości fal, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatyczne mieszanie i wygaszanie przed, wyłączone; Płyta wstępnie odczytana, wyłączona; Automatyczna kalibracja, włączona; Paski, Przeczytaj całą płytę; Priorytet długości fali kolumny, priorytet kolumny; Prędkość przewozu, normalna; i Odczyt automatyczny, Wył.
    15. Następnie włóż 96-dołkową płytkę zawierającą próbki do szuflady i zamknij ją.
    16. Na koniec wybierz przycisk Odczyt, aby płyta została natychmiast odczytana.
    17. Odczytać absorbancję każdej studzienki przy długości fali 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek (na tym etapie należy użyć długości fali 490 nm jako odniesienia).
    18. Wykonaj automatyczne odejmowanie wartości absorbancji samego podłoża testowego od wszystkich nieznanych próbek i zapisz dane.
      UWAGA: Użyj krzywej wzorcowej uzyskanej z seryjnie rozcieńczonego wzorca NET, aby obliczyć względne stężenie NET w próbce1,14,15. Tutaj końcowe wyniki są przedstawione jako "Kompleksy MPO lub NE-DNA (% standardu NET)". Granicę wykrywalności (LOD) obliczono na podstawie odchylenia standardowego (SD) i nachylenia krzywej kalibracyjnej (S) w następujący sposób: LOD = 3,3(SD/S).

4. Statystyki

  1. Wykonuj wszystkie analizy statystyczne za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej. Tutaj użyto SigmaPlot v14.5. Wartości procentowe i zmienne ciągłe są wyświetlane jako mediana z przedziałem międzykwartylowym ze względu na skośny rozkład większości parametrów.
  2. Porównaj poziomy MPO-DNA i NE-DNA w osoczu między pacjentami z COVID-19 a zdrowymi osobami z grupy kontrolnej za pomocą testu sumy rang Wilcoxona. Użyj analizy korelacji, aby zbadać związek między gęstością optyczną a procentem standardu NET.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda używała testu ELISA typu sandwich z przeciwciałami monoklonalnymi anty-MPO, anty-NE i anty-DNA do pomiaru DNA związanego z MPO i NE (Rysunek 1). W tej metodzie studzienki płytki mikromiareczkowej pokryto przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla MPO lub NE w celu wychwycenia MPO związanego z DNA i NE związanego z DNA, a także MPO i NE niezwiązanego z DNA. Aby obliczyć współczynnik zmienności wewnątrztestowej (CV), przeprowadzono podwójne pomiary na tej samej płytce dla 30 próbek pobranych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy metodę sandwich ELISA, w której MPO lub NE wiąże się z jednym miejscem wychwytu przeciwciała podczas początkowej inkubacji próbek zawierających kompleksy MPO-DNA lub NE-DNA. Po umyciu "kanapkę" uzupełnia się inkubacją próbek z przeciwciałem monoklonalnym anty-DNA związanym z peroksydazą. Po usunięciu niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego, związany koniugat peroksydazy jest wykrywany przez dodanie chromogennego substratu peroksydazy ABTS, który daje rozpuszczalny produkt końcowy, który można odczytać spektr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie dane wygenerowane i/lub przeanalizowane podczas tego badania są zawarte w tym opublikowanym artykule. Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Dr. Huq Muhammadowi Aminulowi za pomoc w recenzowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-etapowe polimorfyDokładna korporacja chemiczna i naukowaAN221725izolacji PMN z ludzkiej krwi.
96-dołkowa płytka do mikromiareczkowaniaThermo Fisher Scientific467466płaski denny
roztwór buforowy ABTSSigma-Aldrich Merck11 204 530 001Zawiera nadboran sodu, kwas cytrynowy i wodorofosforan disodowy. 
Tabletki ABTSSigma-Aldrich Merck11 204 521 001 Każda tabletka zawiera 5 mg substratu ABTS i 60 mg substancji nośnikowych.
Samoprzylepna osłona z tworzywa sztucznego, AxygenThermo Fisher Scientific14222348
Przeciwciało anty-MPOSigma-Aldrich Merck  07-496-I Przechowywaćw temperaturze 2-8 stopni Celsjusza przez 1 rok. Gatunkiem żywiciela jest królik.
Przeciwciało anty-NE, klon AHN-10Sigma-Aldrich MerckMABS461Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni Celsjusza. stabilny przez 1 rok. Gatunkiem żywiciela jest mysz.
Albumina surowicy bydlęcejNauki biomedyczneBR-220700081Albumina z frakcji bydlęcej V. Przechowywać pod adresem 2– 8 & st. C. stabilny przez 2 lata.
DNase INew England BioLabsM0303MSklep przy -20 & deg; C
IgG, królik, Kontrola izotypuGENETEX, Inc.GTX35035Przechowywać w postaci stężonego roztworu w temperaturze 2– 8 stopni Celsjusza.
IgG1, kontrola izotypu myszy, klon Ci4Merck MABC002Przechowywać w postaci stężonego roztworu w temperaturze 2– 8 stopni Celsjusza.
Probówka do pobierania krwi z heparyną litowąBecton Dickinson and Company
Jako jedna korporacjaNS-P
Czytnik mikropłytekUrządzenia molekularneSpectraMax 190 Dowolny czytnik płytek mikropłytkowych zdolny do odczytu długości fal od 405– Można użyć 490 nm.
Aplikacja czytnika mikropłytekUrządzenia molekularneSoftMax pro
Przeciwciało anty-DNA sprzężone z peroksydazą, Wykrywanie śmierci komórki ELISARoche Diagnostics1154467500  Butelka 2. Przechowuj pod adresem 2– 8 & st. C. stabilny przez 1 rok.
Phorbol 12-mirystynian 13-octanSigma-Aldrich MerckP8139Aktywacja PMN z ludzkiej krwi.
Roztwór buforowany fosforanamiTakara BioT9181Przechowywać w temperaturze pokojowej. Stabilny przez 6 miesięcy.
SigmaPlot v14.5  San Jose, CA, USA
Azydek soduFujifilm Wako Chemicals190-14901Przechowywać w temperaturze pokojowej.
t-oktylofenoksypolietylen t-oktylofetylowy, eter tert-oktylofenylowy glikolupolietylenowego Fujifilm Wako Chemicals9002-93-1Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Mikser mikropłytek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196(2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497(2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587(2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424(2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999(2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587(2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kompleksy MPO DNAkompleksy NE DNAtrawienie DNazprzeciwcia a wychwytuj ceoznaczanie ilo ciowe NET w osoczuczytnik mikrop ytek

Powiązane artykuły