$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Kość jest dynamiczną tkanką, która ulega ciągłej przebudowie, obejmującej osteoklasty resorbujące kości i osteoblasty tworzące kości. Co ważne, procesy te są sprzężone z innymi komórkami znajdującymi się w przestrzeni szpiku, takimi jak komórki krwiotwórcze i adipocyty szpiku kostnego. Rozłączenie w obrocie kostnym powoduje łamliwość szkieletu, a następnie wzrost liczby złamań1. Ostatnie badania wykazały znaczenie substratów metabolicznych i metabolizmu energetycznego w regulacji zarówno tworzenia kości, jak i resorpcji kości 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, Rozdział 16,17. Celowanie w szlaki metaboliczne jest stosowane w leczeniu różnych nowotworów i może być prowokacyjnym narzędziem, które można zastosować do zwalczania różnych schorzeń, które prowadzą do zwiększonej częstości złamań18. Z tego powodu ważne jest, aby mieć pełne zrozumienie metabolizmu komórkowego we wszystkich komórkach kostnych. Niestety, badanie komórek kostnych w ich naturalnym środowisku jest trudne ze względu na ich lokalizację w zmineralizowanej tkance. W porównaniu z tkankami niezmineralizowanymi, niezbędne etapy wymagane do przetwarzania kości utrudniają molekularne i mechanistyczne badania ich stanu metabolicznego. W związku z tym kolekcja ta ma na celu zwrócenie uwagi na uznane techniki stosowane do monitorowania szlaków metabolicznych w komórkach wyizolowanych z ich niszy kostnej.
"Osteoenergetyka" opisuje procesy metaboliczne i potencjał bioenergetyczny osteoblastów i pozostaje aktywnym obszarem zainteresowań i dociekań naukowych. Zanim jednak komórki uzyskają zdolność do wytwarzania i wykorzystywania ATP, najpierw należy pozyskać substraty energetyczne. Trzy artykuły z tej kolekcji przedstawiają metody stosowane do monitorowania losów określonych substratów w komórkach kostnych. Po pierwsze, Shen i Karneropisują techniki oceny zużycia aminokwasów w hodowanych komórkach in vitro lub izolowanych kościach ex vivo. W systemie in vitro hodowane komórki ST2 są inkubowane z L-[3,4-3 H]-glutaminą przez określony czas, a wychwyt glutaminy jest oznaczany ilościowo za pomocą licznika scyntylacyjnego. Podobnie w systemie ex vivo kości pobrane od nowonarodzonych myszy są inkubowane z aminokwasami znakowanymi radioaktywnie, a wychwyt aminokwasów szacuje się za pomocą licznika scyntylacyjnego. Metody te pozwalają na szybką i czułą ocenę wychwytu aminokwasów w komórkach kostnych lub w izolowanych kościach. Co ważne, metody te można łatwo modyfikować w celu oceny różnych aminokwasów lub innych substratów energetycznych oraz testowania różnych pytań naukowych.
Oprócz aminokwasów, glukoza i długołańcuchowe kwasy tłuszczowe (LCFA) stanowią gęste zaopatrzenie w energię komórkową lub ATP. W tym charakterze LCFA dostają się do mitochondriów przez palmitoilotransferazę karnityny (CPTI / II), gdzie są łatwo utleniane przez β-oksydację, a następnie mogą wejść do kwasu trikarboksylowego (TCA) lub cyklu fosforylacji oksydacyjnej, aby uzyskać ATP. Ta seria reakcji chemicznych ostatecznie prowadzi do uwolnienia węgla w postaci gazowego dwutlenku węgla (CO2 ), co jest trudne do oszacowania. Song i wsp. oraz Kim i wsp. fachowo opisują dwie powiązane ze sobą metody pomiaru metabolitów powstających w procesie utleniania20,21. Obie techniki wykorzystują substrat węglowy znakowany izotopem węgla 14C i bibułę filtracyjną jako narzędzie "pułapkowania" do ilościowego określenia uwolnionego 14CO2 . Jednak każda metoda jest równie ważna, ponieważ opisuje unikalne naczynia hodowlane i techniki normalizacji danych. Ponadto Song i wsp.20 opisują, jak obliczyć utlenianie substratu, podczas gdy Kim i wsp.21 zawierają dodatkową metodę pomiaru metabolitów rozpuszczalnych w kwasach.
Te badania śledzące pozwalają badaczowi określić losy metaboliczne różnych substratów. Jako uzupełnienie, Jayapalan i wsp.22 wykorzystują analizy strumienia metabolicznego do monitorowania procesów metabolicznych, w tym glikolizy i fosforylacji oksydacyjnej poprzez oddychanie mitochondrialne. To urządzenie zasadniczo mierzy tlen i pH w hodowlach żywych komórek w czasie rzeczywistym. W związku z tym, poprzez hodowlę pierwotnych komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) poprzez różnicowanie osteoblastów, można przeprowadzić różnorodne eksperymenty podczas monitorowania szlaków metabolicznych23. Technika ta może być wykonywana z czterema różnymi wstrzyknięciami, co pozwala naukowcom dostosować eksperymenty do konkretnych pytań naukowych, a jednocześnie jest w stanie przestrzegać standardowych protokołów, w tym szybkości ATP, wykorzystania paliwa / substratu, oddychania mitochondrialnego i testów szybkości glikolitów. Wreszcie, ponieważ wiele z tych eksperymentów ma charakter mechanistyczny, konieczne jest utrzymanie jednorodnej populacji komórek bez zanieczyszczenia innymi typami komórek. Systemy hodowli komórkowych in vitro stosowane do monitorowania procesów metabolicznych komórek kostnych mają wiele nieodłącznych ograniczeń. Guo i Wu24 oferują doskonały przegląd ograniczeń wprowadzanych podczas standardowych hodowli BMSC i wnoszą szczegółową metodę wzbogacania populacji komórek zrębu i minimalizacji zanieczyszczenia krwiotwórczego za pomocą hipoksji.
Podsumowując, kolekcja ta przedstawia techniki monitorowania wykorzystania substratów i zdolności bioenergetycznych w różnych modelach szkieletowych, zarówno in vitro, jak i ex vivo. Większość z tych metod jest wykonywana przy użyciu systemów hodowli komórkowych i dlatego mają ograniczenia wynikające ze sztucznego środowiska. Chociaż prawdą jest, że komórki pierwotne pozwalają na bardziej fizjologiczny system, komórki te są często hodowane w wysokiej zawartości tlenu w pożywkach zawierających nadmierne stężenia substratów metabolicznych, a czasami nawet z zanieczyszczającymi populacjami komórek. Dlatego tak ważne jest, aby te eksperymenty mechanistyczne były poparte dodatkowymi danymi in vivo. Niemniej jednak ten ekscytujący obszar badań już okazał się korzystny. W związku z tym dalsze charakteryzowanie "normalnych" i patologicznych procesów metabolicznych jest obiecującą niszą naukową. Co więcej, badanie osteoenergetyki i metabolizmu w celu zrozumienia, jak, dlaczego i kiedy komórki kostne wykorzystują różne substraty i jakie mają one wpływ na ogólny stan kości, otwiera szeroki obszar dla celów terapeutycznych. W tym celu stwierdzono, że przeciwresorpcyjne bisfosfoniany pierwszej generacji (tj. etidronian i klodronian) stosowane w leczeniu osteoporozy wpływają na energetykę osteoklastów. Te powszechnie przepisywane leki stanowią doskonały przykład tego, jak szlaki metaboliczne mogą być wykorzystane do wpływania na ogólny stan zdrowia kości i poprawy jakości życia pacjenta. Oprócz leczenia przeciwresorpcyjnego istnieją dwie zatwierdzone przez FDA terapie anaboliczne, teryparatyd i romozumab, które aktywują odpowiednio szlaki PTH i WNT. Zarówno PTH, jak i WNT stymulują wychwyt i metabolizm glutaminy w osteoblastach 6,11,25,26. Podkreślając terapeutyczne implikacje tego, hamowanie aktywności metabolizmu glutaminy, zarówno farmakologicznie, jak i genetycznie, zmniejsza tworzenie kości w odpowiedzi na leczenie WNT lub anabolicznym PTH 6,11. W związku z tym uzasadnione jest kontynuowanie badań w celu zbadania metabolizmu i bioenergetyki w komórkach kostnych. Techniki opisane w tej kolekcji stanowią podstawę do odpowiedzi na różne pytania naukowe związane z osteoenergetyką i metabolizmem w komórkach kostnych.