Artykuł metodologiczny

Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu

DOI:

10.3791/64651

⸱

10 lutego 2023

 , 
1Department of Biology, University of Louisville

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół obrazowania dynamiki 3-wymiarowej ściany komórkowej żywej tkanki mchu, umożliwiając wizualizację odrywania się ścian komórkowych u mutantów ggb i zagęszczania wzorów ścian komórkowych u typu dzikiego podczas rozwoju przez długi okres.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie poklatkowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pozwala na obserwację dynamicznych zmian wzrostu i rozwoju na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku obserwacji przez długi okres technika wymaga transformacji białka fluorescencyjnego; Jednak w przypadku większości systemów transformacja genetyczna jest albo czasochłonna, albo technicznie niedostępna. Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół obrazowania poklatkowego 3D dynamiki ściany komórkowej w okresie 3 dni przy użyciu barwnika kalkofluorowego (który barwi celulozę w ścianie komórkowej rośliny), opracowanego w mchu Physcomitrium patens. Sygnał barwnika kalkofluorowego ze ściany komórkowej jest stabilny i może trwać przez 1 tydzień bez widocznego rozpadu. Za pomocą tej metody wykazano, że oderwanie komórek w mutantach ggb (w których podjednostka beta geranylgeranylotransferazy-I białka) jest spowodowane nieuregulowaną ekspansją komórek i wadami integralności ściany komórkowej. Co więcej, wzory barwienia kalkofluorem zmieniają się w czasie; Mniej intensywnie zabarwione regiony korelują z przyszłymi miejscami ekspansji/rozgałęzień komórek w typie dzikim. Metodę tę można zastosować do wielu innych systemów, które zawierają ściany komórkowe i które mogą być barwione przez kalkofluor.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ściany komórkowe roślin ulegają dynamicznym zmianom podczas ekspansji i rozwoju komórek1,2,3. Utrzymanie integralności ściany komórkowej ma kluczowe znaczenie dla adhezji komórek roślinnych podczas wzrostu i rozwoju, a także dla odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Chociaż wizualizacja dynamiki ściany komórkowej żywych komórek w długim okresie czasu ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób adhezja komórek jest utrzymywana podczas rozwoju i adaptacji do zmian środowiskowych, obecne metody bezpośredniej obserwacji dynamiki ściany komórkowej są nadal trudne.

Obrazowanie poklatkowe zmian komórkowych może dostarczyć informacji o dynamice rozwoju organizmu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości4,5,6,7. Podczas gdy poklatkowe obrazowanie 3D ma ogromny potencjał do badania dynamicznych zmian kształtu komórki podczas wzrostu i rozwoju, technika ta zwykle wymaga transformacji białka fluorescencyjnego4,5,6,7. Jednak w przypadku większości systemów transformacje genetyczne są albo czasochłonne, albo trudne technicznie. Alternatywnie od dawna dostępne są barwniki fluorescencyjne, które przyczepiają się do składników komórkowych. Barwniki fluorescencyjne mogą emitować światło fluorescencyjne po naświetleniu światłem o określonej długości fali. Typowymi przykładami są Edu, DAPI, PI, FM4-64 i calcofluor white8,9,10. Jedną z głównych wad jest jednak to, że barwniki te mogą być zwykle używane tylko w utrwalonej tkance lub do krótkich eksperymentów, częściowo ze względu na szkody, jakie wyrządzają komórce8,9,10.

Zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem, sygnały calcofluoru są stabilne, gdy biel calcofluor jest mieszana z podłożem podczas eksperymentów poklatkowych na mchu P. patens. Korzystając z tej metody, zaobserwowano oderwanie komórek w mutantach ggb za pomocą obrazowania poklatkowego 3D w okresie 3 dni3 (Rysunek 1). Metodę tę można zastosować do wielu innych systemów, które zawierają ściany komórkowe i które mogą być barwione przez kalkofluor.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla listy materiałów i sprzętu oraz Tabelę 1 dla listy rozwiązań, które mają być użyte w tym protokole.

1. Przygotowanie roślin do naczyń ze szklanym dnem

  1. Hoduj tkankę protonemalną mchu w podłożu agarowym BCDAT na 13 cm szalce Petriego w stałym białym świetle (~50 μmol m-2 s-1) przez 7 dni w temperaturze 25 °C w komorze wzrostowej.
  2. Filtruj i sterylizuj calcofluor white i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Odczynnik jest stabilny przez kilka miesięcy.
  3. Rozproszyć 7-dniową tkankę mchu w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 20 μl wysterylizowanej wody. Upewnij się, że tkanka protonemalna mchu jest wystarczająco rozproszona w postaci małych kawałków w wodzie. W przypadku typu dzikiego (WT) użyj kleszczy, aby oddzielić protonemata; w przypadku mutanta GGB należy użyć pipety P-1000.
  4. Dodaj 10 μl wysterylizowanego białka kalkofluorowego do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i pozostaw mikroprobówkę pionowo w kapturze na 2 minuty w celu zabarwienia.
  5. Natychmiast po zabarwieniu wymieszaj rośliny z 200 μl schłodzonego BCDATG, zawierającego pożywkę BCDAT uzupełnioną 0,5% (w/v) glukozy i 0,4% (w/v) gumy gellan, pipetując pięciokrotnie pipetą P-1000.
    UWAGA: Upewnij się, że podłoże BCDATG jest wystarczająco schłodzone (tuż przed zestaleniem się podłoża), aby uniknąć stresu dla roślin.
  6. Przenieść mieszaninę zawierającą rośliny i pożywkę BCDATG do naczynia ze szklaną podstawą o średnicy 27 mm. Upewnij się, że objętość BCDATG do mieszania komórek nie przekracza 200 μl i że 200 μl BCDATG z próbkami jest równomiernie rozłożone na powierzchni naczynia ze szklanym dnem o średnicy 7 mm w celu wytworzenia cienkiej warstwy filmu, tak aby próbki znajdowały się w obiektywnej odległości roboczej podczas obrazowania.
  7. Po zestaleniu przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przykryj cienką warstwę 3 ml schłodzonego BCDATG i pozostaw na 10 minut, aby ponownie zastygł.
    UWAGA: Upewnij się, że kroki 1.2-1.5 są wykonywane w sterylnym kapturze, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  8. Na dnie naczynia narysuj dziewięć linii, każda w kierunku równoległym i prostopadłym (Rysunek 2). Zaznacz wiersze znakami od a do h i oznacz kolumny liczbami od 1 do 8. Użyj górnego, dolnego, prawego, środkowego i lewego, aby zaznaczyć pozycje w każdym kwadracie. Na przykład, jeśli roślina znajduje się w kwadracie w drugim rzędzie i szóstej kolumnie i jest umieszczona w lewej górnej części kwadratu, wówczas roślina ta otrzymuje nazwę "b6_upper_left".
  9. Naczynie ze szklanym dnem zawierające rośliny należy hodować pod czerwonym światłem przez 5 dni w temperaturze 25 °C w komorze wzrostowej, a następnie w świetle białym przez 1-2 dni, a następnie poddawać obrazowaniu poklatkowemu codziennie przez okres do 3 dni. W przypadku WT należy wstępnie wyhodować rośliny w słabym czerwonym świetle (0,5 μmol m-2 s-1) od góry przez 5 dni, aby wywołać odpowiedź fototropową protonematy, tak aby rośliny mogły przyczepić się do dna szalek11.
    UWAGA: Słabe czerwone światło jest zapewniane przez przepuszczenie białego światła przez czerwony filtr z tworzywa akrylowego o grubości 3 mm do odpornych na światło pudełek. W przypadku mutantów ggb hodowla wstępna w czerwonym świetle jest opcjonalna, ponieważ mutanty ggb nie mają odpowiedzi fototropowej3.

2. Obrazowanie i rekonstrukcja 3D

  1. Umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające rośliny na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego, ze szklanym dnem skierowanym w stronę obiektywu. Użyj mikroskopu konfokalnego do wizualizacji kalkofluoru za pomocą soczewki obiektywowej 20x. Rób zdjęcia laserem 405 nm, otworkiem przy 1,0, wzmocnieniem HV przy 100, regulacją przesunięcia tła na 0, mocą lasera 5%-7%, rozmiarem skanowania 1,024 x 1,024 i prędkością skanowania 1/2 klatki/s. Zbierz 17-30 sekcji optycznych serii Z o rozmiarze kroku 1,0 μm. Nazwij obrazy przy użyciu kodu w kroku 1.6, na przykład "b6_upper_left-day0", i zapisz.
    1. Wybierz kanał DAPI w Acquisition (Akwizycja) i zaznacz pole Z (Z) w obszarze ND Acquisition (Akwizycja ND). Aby ustawić dolny i górny limit stosu Z, kliknij przyciski Góra i Dół.
  2. Aby zrekonstruować obrazy 3D, otwórz plik .nd2 (Rysunek 3A; patrz Spis materiałów) i kliknij Wolumin (Rysunek 3B).

3. Obrazowanie tych samych roślin w różnych punktach czasowych

  1. Po każdym obrazowaniu włóż szklaną podstawę z powrotem do komory wzrostowej.
  2. Powtórz czynności od kroku 2.1 dla obrazowania i rekonstrukcji 3D.
    UWAGA: Aby znaleźć te same rośliny, użyj kodu wymienionego w kroku 1.6 i nadaj nazwę "b6_upper_left-day1" lub "b6_upper_left-day2", w zależności od wieku roślin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda pozwala na obserwację dynamiki ściany komórkowej podczas rozwoju u mutantów typu dzikiego i ggb (Rysunek 1). Wyniki pokazały, że regiony o mniejszym pogrubieniu ściany komórkowej korelują z miejscami ekspansji/rozgałęziania komórek, co pozwala na przewidywanie miejsc ekspansji/rozgałęzień w typie dzikim (Rysunek 1A). Powierzchnia ścian komórkowych u mutantów ggb została rozerwana podczas rozwoju z powodu niekontrolowanej ekspansji komórek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poklatkowa rekonstrukcja 3D, czyli obrazowanie 4D, jest potężnym narzędziem do obserwacji dynamiki morfologii komórkowej podczas procesów rozwojowych. W tym protokole, poprzez zmieszanie bieli kalkofluorowej z pożywką, można zaobserwować dynamikę morfologii komórek 3D w mchu P. patens. Korzystając z tej metody, zaobserwowaliśmy, że powierzchnia ścian komórkowych w mutantach ggb jest rozrywana podczas rozwoju3. Co więcej, zmniejszone pogrubienie ścian komórkowych jest skorelowane ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Soucy Patricii i Betty Nunn z Uniwersytetu w Louisville za pomoc przy mikroskopie konfokalnym. Praca ta została sfinansowana przez National Science Foundation (1456884 do M.P.R.) oraz przez National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 do M.P.R.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr światła z tworzywa sztucznego czerwonego o grubości 3 mm  Mitsubishi  No.102
Miska ze szklaną podstawą o średnicy 27 mm Iwaki3930-035
Agar  SigmaA6924
Calcofluor biały   Sigma18909-100ML-FCalcofluor White M2R, 1 g/L i Evans niebieski, 0,5 g/L
Mikroskop konfokalny Nikon A1

NIS element software; .nd2 w przeglądarce NIS-elements, do pobrania z https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

Mikroskop fluorescencyjny Nikon TE200 Wyposażony w kamerę DS-U3;
Guma gellan Nacali Tesque12389-96
Komory do wzrostu roślinSANYO Sanyo MLR-350H
Strzykawka sterylizowana 0,22 μ m filtrMilliporeSLGV033RS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
  3. Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
  4. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  5. Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
  6. Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
  7. Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
  8. Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
  9. Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
  10. Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
  11. Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Calcofluor StainingFluorescence Microscopy3D ImagingCell ExpansionCell Wall IntegrityPlant Cell WallProtonemata Separation

Powiązane artykuły