Method Article

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

DOI:

10.3791/64656

⸱

October 14th, 2022

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetyczna regulacja ekspresji genów jest często zakłócana przez enzymy modyfikujące histony (HME), które generują heterochromatyczne lub euchromatyczne znaczniki histonowe odpowiednio do represji lub aktywacji transkrypcji. HME są rekrutowane do docelowej chromatyny przez czynniki transkrypcyjne (TF). W związku z tym wykrywanie i charakteryzowanie bezpośrednich interakcji między wymiennikami HME i TF ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia ich funkcji i specyficzności. Badania te byłyby bardziej istotne z biologicznego punktu widzenia, gdyby były przeprowadzane in vivo w żywych tkankach. W tym miejscu opisano protokół wizualizacji interakcji w liściach roślin między roślinną deubikwitynazą histonową a roślinnym czynnikiem transkrypcyjnym za pomocą transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET), który umożliwia wykrywanie kompleksów między cząsteczkami białka, które znajdują się w odległości <10 nm od siebie. Przedstawiono dwie odmiany techniki FRET: SE-FRET (emisja uczulona) i AB-FRET (bielenie akceptorowe), w której energia jest przenoszona nieradiacyjnie od dawcy do akceptora lub emitowana promieniowo przez dawcę podczas fotowybielania akceptora. Zarówno metody SE-FRET, jak i AB-FRET można łatwo dostosować do odkrywania innych interakcji między innymi białkami w roślinie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Roślinne deubikwitynazy histonowe odgrywają ważną rolę w kontrolowaniu ekspresji genów poprzez posttranslacyjną modyfikację histonów, a konkretnie poprzez usuwanie ich śladów monoubikwitylacji1. Jak dotąd, OTLD1 jest jedną z niewielu roślinnych deubikwitynaz histonów scharakteryzowanych na poziomie molekularnym u Arabidopsis2,3. OTLD1 usuwa grupy monoubikwityny z cząsteczek histonu H2B, promując w ten sposób usuwanie lub dodawanie euchromatycznych modyfikacji acetylacji i metylacji histonów H3 w docelowym genie chromatyny4,5. Co więcej, OTLD1 oddziałuje z innym enzymem modyfikującym chromatynę, demetylazą lizyny histonowej KDM1C, wpływając na supresję transkrypcji docelowych genów6,7.

Większość enzymów modyfikujących histony nie ma zdolności wiązania DNA, a tym samym nie może bezpośrednio rozpoznać swoich docelowych genów. Jedną z możliwości jest to, że współpracują one z białkami czynnika transkrypcyjnego wiążącego DNA, które wiążą te enzymy i kierują je do ich docelowych chromatyny. W szczególności w roślinach kilka głównych enzymów modyfikujących histony (tj. metylotransferazy histonów8,9, acetylotransferazy histonów10, demetylazy histonowe11, oraz kompleksy represyjne Polycomb12,13,14) są znane z tego, że są rekrutowane przez czynniki transkrypcyjne. Zgodnie z tą ideą, niedawno zaproponowano jeden z możliwych mechanizmów rekrutacji OTLD1 do docelowych promotorów, który opiera się na specyficznych interakcjach białko-białko OTLD1 z czynnikiem transkrypcyjnym LSH1015.

LSH10 należy do rodziny białek roślinnych ALOG (Arabidopsis LSH1 i Oryza G1), które funkcjonują jako centralne regulatory rozwoju16,17,18,19,20,21,22. Fakt, że członkowie rodziny białek ALOG zawierają motywy wiążące DNA23 i wykazują zdolności do regulacji transkrypcji22, nuclear localization19, and homodimerization24 dodatkowo wspiera pogląd, że te białka, w tym LSH10, mogą działać jako specyficzne czynniki transkrypcyjne podczas epigenetycznej regulacji transkrypcji. Jedną z głównych technik eksperymentalnych stosowanych do scharakteryzowania oddziaływania LSH10-OTLD1 in vivo jest transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)15.

FRET to technika obrazowania do bezpośredniego wykrywania oddziaływań bliskiego zasięgu między białkami w odległości <10 nm od siebie25 wewnątrz żywych komórek. Istnieją dwie główne odmiany podejścia FRET26: emisja uczulona (SE-FRET) (Rysunek 1A) i bielenie akceptorowe (AB-FRET) (Rysunek 1B). W SER-FRET oddziałujące białka - z których jedno jest oznaczone fluorochromem donorowym (np. zielone białko fluorescencyjne, GFP), a drugie fluorochromem akceptorowym (np. monomeryczne białko czerwonej fluorescencji, mRFP27,28) - nieradiacyjnie przenoszą energię stanu wzbudzonego od dawcy do akceptora. Ponieważ podczas tego transferu nie są emitowane żadne fotony, wytwarzany jest sygnał fluorescencyjny, który ma widmo emisji radiacyjnej podobne do widma akceptora. W AB-FRET interakcje białkowe są wykrywane i określane ilościowo na podstawie podwyższonej emisji radiacyjnej dawcy, gdy akceptor jest trwale dezaktywowany przez fotowybielanie, a zatem nie jest w stanie odebrać energii nieradiacyjnej przekazywanej od dawcy (Rysunek 1). Co ważne, subkomórkowe umiejscowienie fluorescencji FRET wskazuje na lokalizację oddziałujących białek w komórce.

Zdolność do zastosowania FRET w żywych tkankach i określenia subkomórkowej lokalizacji oddziałujących białek jednocześnie z wykrywaniem tej interakcji per se, sprawia, że FRET jest techniką wyboru do badań i wstępnej charakterystyki interakcji białko-białko in vivo. Porównywalna metodologia obrazowania fluorescencyjnego in vivo, dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji (BiFC)29,30,31,32, jest dobrym alternatywnym podejściem, chociaż w przeciwieństwie do FRET, BiFC może dawać wyniki fałszywie dodatnie z powodu spontanicznego montażu autofluorescencyjnego BiFC reporters33, a kwantyfikacja jego danych jest mniej precyzyjna.

Ten artykuł dzieli się udanymi doświadczeniami w implementacji technik SE-FRET i AB-FRET oraz przedstawia protokół ich wdrożenia do badania interakcji między OTLD1 i LSH10 w komórkach roślinnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens szczep EHA105 lub GV3101 zostały użyte w niniejszym badaniu.

1. Konstrukcja wektora FRET

  1. Wybierz znaczniki fluorescencyjne dla pary FRET donor/akceptor.
    1. Użyj EGFP z pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (patrz tabela materiałów), aby wygenerować wektor dawcy.
    2. Do wygenerowania wektora akceptora należy użyć mRFP z pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (patrz Tabela materiałów).
  2. Wygeneruj konstrukty FRET donora/akceptora przy użyciu techniki klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca34, takiej jak system klonowania rekombinacji Gateway35.
    1. Wzmocnij sekwencje kodujące interesujących nas białek36 (tj. Arabidopsis OTLD1 i LSH10)15.
      UWAGA: Dobrym pomysłem jest również wykorzystanie kontroli ujemnej, która reprezentuje homolog jednego z oddziałujących białek, ale nie oczekuje się, że będzie wykazywać interakcję; badanie interakcji OTLD1-LSH10 wykorzystuje homolog LSH10, LSH4, który nie rozpoznaje OTLD1. CDNA OTLD1, LSH10 i LSH4 są amplifikowane metodą PCR przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1.
    2. Sklonuj OTLD1, LSH10 i LSH4 do wektora wejściowego pDONR207 za pomocą techniki klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca34.
    3. Użyj bramki LR Clonase II (patrz tabela materiałów), aby przenieść LSH10 i LSH4 z pDONR207 do binarnego wektora docelowego pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 w celu wygenerowania binarnych konstruktów donorowych p35S::LSH10-GFP (testowany konstrukt) i p35S::LSH4-GFP (kontrola ujemna).
    4. Użyj tego samego dostępnego na rynku enzymu (krok 1.2.3), aby przenieść OTLD1 z pDONR207 do binarnego wektora docelowego pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1, aby wygenerować binarną konstrukcję akceptora p35S::OTLD1-mRFP (testowana konstrukcja).
    5. PCR-amplify36 mRFP z pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 za pomocą starterów wymienionych w Tabeli 1, sklonuj go techniką klonowania rekombinacyjnego do pDONR207, a następnie użyj LR Clonase II do przeniesienia mRFP do pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 w celu wygenerowania binarnego konstruktu fuzyjnego p35S::mRFP-GFP (kontrola pozytywna).
  3. Przeprowadzić transformację konstruktów dawcy i akceptora w Agrobacterium.
    1. Dodać 1 μg każdego plazmidu z etapów 1.2.3-1.2.5 do 100 μl kultury właściwych komórek Agrobacterium tumefaciens szczep EHA105 lub GV3101, przygotowanych przy użyciu standardowych protokołów37 lub uzyskanych komercyjnie, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    2. Dodać 1 ml pożywki LB (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego i 1% NaCl; patrz tabela materiałów) do właściwej mieszaniny komórek i mieszać przy 200 obr./min i 28 ° C przez 1,5 godziny. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    3. Zawiesić komórki w 0,1 ml pożywki LB przez pipetowanie i rozprowadzić je na agarze LB uzupełnionym odpowiednimi antybiotykami (np. 0,01% spektynomycyny i 0,005% ryfampicyny; patrz tabela materiałów). Rośnie w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
    4. Wybierz poszczególne kolonie i zaszczep każdą z nich osobno w 1 ml bulionu LB uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami.
    5. Hodować komórki w temperaturze 28 °C przez 24 godziny i przenieść 0,2 ml kultury do nowej probówki. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 10 000 × g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
    6. Ekstrahować plazmidowe DNA za pomocą standardowego protokołu izolowania plazmidów z komórek Agrobacterium38 i ponownie zawiesić wyekstrahowane DNA w 30 μl wody. Aby zidentyfikować kolonie zawierające pożądane plazmidy, należy użyć 2 μl preparatu DNA jako matrycy do PCR ze starterami specyficznymi dla genu wymienionymi w tabeli 1. Zmieszać 0,7 ml zidentyfikowanej kultury z 0,3 ml glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Agroinfiltracja

  1. Uprawa roślin Nicotiana benthamiana.
    UWAGA: Podczas całego eksperymentu wszystkie rośliny muszą być zdrowe.
    1. Siej i hoduj nasiona N. benthamiana w doniczce zawierającej mokrą glebę o dużej gęstości.
    2. Umieść posadzone nasiona w komorze wzrostowej ustawionej na 23 °C z 16 godzinami światła i 8 godzinami ciemnego cyklu o natężeniu światła 150-170 μmol/m2s, aż średnica eufilu osiągnie 0,5 cm.
    3. Przenieś sadzonki do większych doniczek i pozwól im rosnąć w tej samej komorze o tych samych parametrach.
      UWAGA: Rośliny są gotowe do agroinfiltracji, gdy ich największe liście osiągną średnicę 5-7 cm, zwykle w ciągu 4-5 tygodni. W przypadku mniejszych roślin, które są zbyt młode, skutki agroinfiltracji będą zbyt dotkliwe dla analizy FRET.
  2. Przygotuj komórki bakteryjne do agroinfiltracji.
    1. Każdą kolonię Agrobacterium zawierającą konstrukty FRET hodować przez noc w 5 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami (etap 1.3.3) i 150 μM acetosyringonu w temperaturze 28 °C (patrz tabela materiałów).
    2. Odwirować komórki w temperaturze 3 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Zawiesić komórki w buforze agroinfiltracyjnym (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acetosyringonu) do OD600 = 0,5.
    4. Połączyć zawieszone ogniwa w stosunku 1:1 v/v między komórkami, w których znajdują się odpowiednie konstrukty (krok 2.2.5).
    5. W przypadku agroinfiltracji o podwójnym konstrukcie należy zmieszać podwielokrotności dwóch kultur, a w przypadku agroinfiltracji o pojedynczym konstrukcie wymieszać podwielokrotności tej samej kultury:
      1. Badane białka: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bakterie będące nosicielami konstruktów p35S::OTLD1-mRFP i p35S::LSH10-GFP).
      2. Kontrola negatywna: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bakterie będące nosicielami konstruktów p35S::OTLD1-mRFP i p35S::LSH4-GFP).
      3. Kontrola ujemna: LSH10-GFP + wolne mRFP (bakterie zawierające konstrukty p35S::LSH10-GFP i pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Kontrola pozytywna: mRFP-GFP (bakterie przenoszące konstrukt p35S::mRFP-GFP).
    6. Inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 0,5-1 h.
  3. Wykonaj agroinfiltrację.
    1. Załaduj kulturę bakteryjną do strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml.
    2. Delikatnie, ale stanowczo dociśnij dyszę strzykawki do strony abaksjalnej w pełni rozwiniętych liści N. benthamiana, przytrzymując liść palcem w rękawiczce po stronie przyosiowej.
    3. Naciekaj do czterech plamek na liściu, trzech liści na roślinę, dwóch lub trzech roślin na każdą kulturę bakteryjną. Zmieniaj rękawice między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    4. Rośliny z agroinfiltracją należy utrzymywać w tej samej komorze wzrostowej w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 2.1.2, przez 24 do 36 godzin. Nie należy trzymać agroinfiltracji roślin dłużej niż 36 godzin, ponieważ zmniejszy to sygnał fluorescencji.

3. Mikroskopia konfokalna

  1. Przygotuj preparaty mikroskopowe do wizualizacji fluorescencji.
    1. Po 24-36 godzinach od infiltracji za pomocą żyletki pokrój każdy agroinfiltrowany liść na małe kawałki (2 mm x 4 mm) między nerwami.
    2. Umieść kawałki liści na szkiełku podstawowym powierzchnią liścia do góry. Umieść kroplę wody na kawałkach liści i przykryj je szkłem nakrywkowym. Lekko postukaj w szkło nakrywkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
    3. Włącz mikroskop i laser (patrz Tabela materiałów). Umieść szkiełko w uchwycie stolika mikroskopu w celu obrazowania pod określonymi parametrami FRET (kroki 3.2 i 3.3).
    4. Rozpocznij obserwacje za pomocą soczewki obiektywowej 10x, aby zidentyfikować komórki, które wykazują zarówno sygnały GFP, jak i mRFP, a następnie użyj soczewki obiektywowej 40x do kolejnych szczegółowych obserwacji.
      UWAGA: Co ważne, SE-FRET i AB-FRET są zwykle wykonywane na tej samej próbce tkanki, co pozwala na użycie tych samych ustawień kanału (krok 3.2), z wyjątkiem kanału FRET, który jest włączany/wyłączany odpowiednio dla obserwacji SE-FRET i AB-FRET (kroki 3.2.2.3 i 3.3.1).
  2. Ustaw parametry dla SE-FRET (Rysunek 1A).
    1. Otwórz narzędzie Akwizycja wielowymiarowa (MDA).
    2. Ustal zestaw trzech kanałów konfokalnych w tym samym polu view (Rysunek uzupełniający 1).
      1. Ustaw kanał donorowy (kanał GFP) do wzbudzenia i emisji fluorochromu donorowego za pomocą lasera wzbudzającego 405 nm i filtra emisyjnego 400-597 nm.
      2. Ustaw kanał akceptorowy (kanał mRFP) dla wzbudzenia i emisji fluorochromu akceptora za pomocą lasera wzbudzającego 561 nm i filtra emisyjnego 400-597 nm.
        UWAGA: Filtr emisyjny dla mRFP został ustawiony na 400-597 nm, aby oddzielić sygnał mRFP od sygnału FRET przy 597-617 nm (krok 3.2.2.3), a tym samym zmniejszyć emisję mRFP niezależną od FRET.
      3. Ustawić kanał FRET do wzbudzenia donora i emisji fluorochromów akceptorowych za pomocą lasera wzbudzającego 405 nm i filtra emisyjnego 597-617 nm.
    3. Ustaw intensywność wzbudzenia dawcy na minimalnym poziomie, aby obserwować FRET, unikając fotowybielania, zmniejszając wydajność SE-FRET.
      UWAGA: Ta intensywność wzbudzenia jest wybierana eksperymentalnie przed przeprowadzeniem procedury FRET, aby uniknąć fotowybielania. Różni się w zależności od grubości liści, wieku i czasu po nadekspresji.
    4. Pobudź dawcę i zeskanuj w poszukiwaniu komórek zawierających oczekiwany sygnał fluorescencyjny akceptora.
    5. Wybierz obszar, który zawiera interesujący Cię sygnał fluorescencji.
    6. Uzyskaj sekwencję obrazów SE-FRET, naciskając przycisk Snap.
      1. Wyobraź sobie najpierw 10-15 komórek wyrażających konstrukt mRFP-GFP (kontrola pozytywna); dostosuj parametry ostrości, zoomu i inteligentnego wzmocnienia, aby ustawić ostrość na obszarze zainteresowania, który ma zostać uchwycony (rysunek uzupełniający 2).
      2. Korzystając z tych samych ustawień, zobrazuj 10-15 komórek, z których każda wyraża OTLD1-mRFP, wolny mRFP, LSH10-GFP lub LSH4-GFP oddzielnie.
        UWAGA: Obrazy te są pozyskiwane za pomocą wtyczki "PixFRET" programu ImageJ (patrz tabela materiałów), która została użyta do analiz danych FRET (krok 3.4.1) w celu określenia wartości widma przebijania (SBT) dla akceptorów i dawców; obrazy te są wykorzystywane przez oprogramowanie do generowania obrazów SE-FRET dla par białek OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP i LSH10-GFP + wolnych par białek mRFP (krok 3.2.6.3).
      3. Ponadto, korzystając z tych samych ustawień, zobrazuj 10-15 komórek z koekspresją OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP i LSH10-GFP + wolnych par białek mRFP.
  3. Ustaw parametry dla AB-FRET (Rysunek 1B).
    1. Użyj parametrów kanału donora i akceptora ustawionych dla SE-FRET (krok 3.2.2), ale wyłącz kanał FRET.
    2. Ustawić parametry fotowybielania akceptora (mRFP) (rysunek uzupełniający 3).
      1. Upewnij się, że wybielanie rozpoczyna się po pięciu obrazach. Zezwalaj na 200 iteracji dla każdego wybielacza obszarowego. Utrzymuj 100% intensywność lasera przy długości fali 561 nm.
      2. Utrzymuj czas wybielania wynoszący 45 s. Upewnij się, że prędkość skanowania wynosi 512 x 512 pikseli przy 400 Hz.
    3. Narysuj obszar komórki, który ma zostać wybielony; na przykład w przypadku oddziaływań jądrowych obszary zainteresowania są rysowane wokół całego obszaru jądra komórkowego39.
    4. Aktywuj wybielanie, naciskając przycisk Start eksperymentu; aktywacja tej funkcji spowoduje wykonanie fotowybielania i uzyskanie sekwencji obrazów AB-FRET.
  4. Przeanalizuj dane FRET.
    1. Do analizy danych SE-FRET należy użyć wtyczki "PixFRET" do oprogramowania ImageJ, aby wygenerować skorygowane obrazy wydajności SE-FRET po odjęciu SBT40 (krok 3.2.6.2).
    2. Aby przeanalizować dane AB-FRET, oblicz %AB-FRET jako procentowy wzrost emisji GFP po fotowybielaniu mRFP, korzystając z następującego wzoru41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, gdzie GFPpost to emisja GFP po fotowybielaniu mRFP, a GFPpre to emisja GFP przed fotowybielaniem mRFP.
    3. Przeglądając obrazy FRET, zwróć uwagę na subkomórkową lokalizację sygnału FRET.
      UWAGA: W wielu przypadkach te przedziały komórkowe (np. jądro, chloroplasty, ER itp.) można łatwo zidentyfikować i, jako dodatkową korzyść z techniki FRET, dostarczyć ważnych wskazówek na temat biologicznej funkcji oddziałujących białek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 ilustruje typowe wyniki eksperymentu SE-FRET, w którym jądra komórkowe były jednocześnie rejestrowane w trzech kanałach (tj. GFP dawcy, akceptora mRFP i SE-FRET). Dane te wykorzystano do wygenerowania obrazów wydajności SE-FRET zakodowanych w skali pseudokolorów. Na tej skali przejście z niebieskiego na czerwony odpowiada wzrostowi wydajności FRET, miary bliskości białko-białko od 0% do 100%. W tym reprezentatywnym eksperymencie sygnał SE-FRET zarejestrowano w jądrze komórkowym, a ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół FRET jest prosty i łatwy do odtworzenia; Wymaga również minimalnych inwestycji w zaopatrzenie i wykorzystuje standardowe wyposażenie wielu nowoczesnych laboratoriów. W szczególności pięć głównych cech technicznych wyróżnia wszechstronność tej procedury. Po pierwsze, konstrukty FRET są generowane przy użyciu rekombinacji specyficznej dla miejsca, podejścia do klonowania, które jest łatwe w użyciu, daje dokładne wyniki i oszczędza czas w porównaniu z tradycyjnym klonowaniem opartym na enzymach restrykcyjnych. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium V.C. jest wspierana przez granty od NIH (R35GM144059 i R01GM50224), NSF (MCB1913165 i IOS1758046) oraz BARD (IS-5276-20) dla V.C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetosyringon (3&,5′-Dimethoxy-4′-hydroksyacetofenon)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences#214010
Bacto tryptonBD Biosciences#211705
Ekstrakt z drożdży BactoBD Biosciences#212750 
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)ZeissLSM900Odpowiedni jest każdy CLSM o podobnych możliwościach
EHA105VWR104013-310Używamy kolby z kolekcji laboratorium bakteryjnego Citovsky
Gateway BP Clonase II Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296Używamy kolby z kolekcji laboratorium bakteryjnego Citovsky
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana nasionaHerbalistics PtyRA4 lub LABUżywamy zapasów z kolekcji Citovsky seed lab
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 Nie dotyczyRefs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N/AWygenerowane na podstawie konstrukcji pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 (patrz ref. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 Nie dotyczyWygenerowano na podstawie konstruktu pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1
RifampicinSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycinSigma-Aldrich#S4014-5G
Strzykawki bez igiełOprogramowanie BD309659
Zen do obrazowania CLSMWersja ZeissZEN 3.0Oprogramowanie powinno być kompatybilne z używanym CLSM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274(2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56(2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83(2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125(2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39(2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712(2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511(2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237(2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone Modifying EnzymesTranscription FactorsProtein Protein InteractionFluorescence Resonance EnergySE FRETAB FRETPlant LeavesAgroinfiltrationConfocal MicroscopyImageJ Analysis

Related Articles