Oznaczanie rozpuszczania in vitro składników wieloindeksowych w granulkach Rhodiola w medycynie tybetańskiej

Podsumowanie

Tutaj testujemy rozpuszczanie granulek Rhodiola (RG) in vitro, rysujemy krzywe rozpuszczania salidrozydu, kwasu galusowego i galusanu etylu w ultraczystej wodzie i dopasowujemy krzywe do różnych modeli matematycznych. Protokół ten zawiera informacje i wytyczne dotyczące badań biorównoważności in vivo i korelacji in vivo-in vitro RG.

Streszczenie

Skład granulek (RG) medycyny tybetańskiej jest złożony, a ogólna jakość RG jest trudna do określenia. W związku z tym ustalenie metody oznaczania wieloskładnikowego rozpuszczenia RG in vitro ma ogromne znaczenie dla kontroli jakości. W tym badaniu wykorzystano drugą metodę łopatkową czwartej ogólnej reguły 0931 z Farmakopei Chińskiej (wydanie 2020), zgodną z aparaturą 2 Farmakopei Stanów Zjednoczonych (USP). Aparat do rozpuszczania ustawiono na prędkość obrotową 100 obr./min z ultraczystą wodą jako medium do rozpuszczania. W każdym punkcie czasowym pobrano próbkę o objętości 1 ml. Ponadto skumulowane rozpuszczenie kwasu galusowego, salidrozydu i kwasu etylowo-galusowego w RG w różnych punktach czasowych określono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Na koniec narysowano krzywe rozpuszczania, a krzywe dopasowano do równań GompertzMod, Gompertz, Logistic i Weibulla. Wyniki wykazały, że skumulowane rozpuszczenie kwasu galusowego w RG wynosiło ponad 80% po 1 minucie, skumulowane rozpuszczenie salidrozydu i kwasu etylowo-galusowego wynosiło ponad 65% po 5 minutach, a skumulowane rozpuszczenie każdego składnika wskaźnika zmniejszało się po 30 minutach. Dopasowanie krzywej wykazało, że równanie GompertzMod było najlepiej dopasowanym modelem dla każdego składnika indeksu RG. Podsumowując, metoda badania rozpuszczania opisana w tym protokole jest prosta, dokładna i niezawodna. Może scharakteryzować zachowanie rozpuszczania składników wskaźnikowych w RG in vitro, co stanowi metodologiczne odniesienie do kontroli jakości RG i oceny jakości innych związków etnicznych.

Wprowadzenie

W Chinach częstość występowania chorób sercowo-naczyniowych wciąż rośnie, a wskaźniki zachorowalności i śmiertelności z powodu chorób sercowo-naczyniowych zajmują pierwsze miejsce wśród mieszkańców Chin¹. Dławica piersiowa choroby niedokrwiennej serca jest spowodowana zwężeniem światła spowodowanym miażdżycą tętnic wieńcowych, co prowadzi do stosunkowo niewystarczającego dopływu krwi wieńcowej oraz niedokrwienia mięśnia sercowego i niedotlenienia². W ostatnich latach lecznicze działanie tradycyjnej medycyny chińskiej w leczeniu choroby niedokrwiennej serca zostało dostrzeżone przez wielu lekarzy³.

Tradycyjna medycyna chińska odgrywa ważną rolę w łagodzeniu objawów klinicznych i poprawie jakości życia pacjentów⁴. Granulat Rhodiola (RG) jest ekstrahowany i rafinowany z rośliny leczniczej Rhodiola rosea L. z Wyżyny Tybetańskiej. Głównymi składnikami RG są salidrozyd, rodiosyna i flawonoidy^5,6. RG ma działanie uzupełniające Qi⁷ oraz aktywujące i promujące krążenie krwi w celu złagodzenia bólu. Klinicznie stosuje się go w leczeniu niedrożności klatki piersiowej spowodowanej niedoborem Qi i zastojem krwi, chorobą niedokrwienną serca, dusznicą bolesną⁸. Samo określenie zawartości nie odzwierciedla w pełni wewnętrznej jakości leków, ponieważ zarówno rozpad, jak i rozpuszczenie in vitro mogą wpływać na biodostępność i skuteczność leków^9,10. Metody kontroli rozpuszczania medycyny chińskiej obejmują metodę obrotowego kosza, metodę łopatkową i metodę małego kubka. Wadą metody obracającego się kosza jest to, że tylko zewnętrzna część obracającego się kosza styka się z medium rozpuszczającym podczas obracania, co nie odzwierciedla rzeczywistego zachowania rozpuszczania. Metoda wiosłowa może przezwyciężyć powyższe niedociągnięcia, co czyni ją bardziej odpowiednią niż metoda koszykowa dla niektórych stałych preparatów medycyny chińskiej¹¹. Obecnie nie ma sprawozdania z analizy rozpuszczania RG in vitro. W celu bardziej kompleksowej kontroli jakości RG zbadano rozpuszczanie trzech składników indeksowych (kwasu galusowego, salidrozydu i galusanu etylu) w RG. Niniejsze badanie dostarcza danych do kontroli jakości RG oraz metodologicznego odniesienia do oceny jakości innych preparatów związków etnicznych.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować roztwór podstawowy substancji odniesienia: Odważyć oddzielnie 10,6 mg salidrozydu, 5,24 mg kwasu galusowego i 5,21 mg kwasu etylowo-galusowego na elektronicznej wadze analitycznej i dodać je pojedynczo do kolby miarowej o pojemności 5 ml. Następnie dodać metanol klasy HPLC do rozpuszczenia i rozcieńczyć do 5 ml. Na koniec dobrze wstrząsnąć, aby uzyskać roztwór podstawowy substancji odniesienia o stężeniach masowych odpowiednio 2,120 mg/ml, 1,048 mg/ml i 1,042 mg/ml.
   UWAGA: Roztwór podstawowy substancji odniesienia zawiera 2,120 mg/ml salidrozydu, 1,048 mg/ml kwasu galusowego i 1,042 mg/ml galusanu etylu jako roztwór podstawowy każdego roztworu w następnej krzywej wzorcowej.
2. Przygotować roztwór próbki testowej. Ekstrahuj 2,8 g RG (Tabela Materiałów) za pomocą 10 ml metanolu klasy HPLC za pomocą ultradźwiękowej maszyny czyszczącej (moc: 200 W, częstotliwość: 40 kHz) przez 30 minut, a następnie przefiltruj go filtrem 0,22 μm w celu testu adaptacji systemu.
3. Przygotować mieszany roztwór wzorcowy zawierający 0,590 mg/ml salidrozydu, 2,030 mg/ml kwasu galusowego i 1,930 mg/ml galusanu etylu.
   UWAGA: Każdy wzorzec (2,950 mg salidrozydu, 10,150 mg kwasu galusowego i 9,650 mg kwasu etylowo-galusowego) rozpuszcza się w kolbie miarowej o pojemności 5 ml w metanolu klasy HPLC jako pożywce do rozpuszczania.
4. Uzyskać teoretyczną zawartość każdego charakterystycznego składnika RG do ekstrakcji wodą ultraczystą.
   1. Umieścić 2,8 g RG w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 200 ml ultraczystej wody i ekstrahować ultradźwiękowo (moc: 200 W, częstotliwość: 40 kHz) przez 60 minut. Następnie przefiltruj go filtrem 0,22 μm.
   2. Oznaczyć zawartość badanego roztworu zgodnie z równaniem liniowym otrzymanym w poniższym doświadczeniu.

2. Warunek chromatograficzny

1. Ustawić warunki chromatograficzne zgodnie z tabelą 1 dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Szczegółowe informacje na temat używanego instrumentu można znaleźć w Tabeli materiałów.

3. Test zdolności adaptacyjnych systemu

1. Zbadaj zależność liniową.
   1. Rozcieńczyć referencyjne roztwory podstawowe kwasu galusowego i galusanu etylu 5, 10, 25, 50 i 125 razy, a referencyjne roztwory podstawowe salidrozydu 2, 4, 8, 16 i 32 razy, aby otrzymać roztwór o stężeniu gradientowym do narysowania krzywej wzorcowej.
      UWAGA: Dostosuj współczynnik rozcieńczenia krzywej wzorcowej zgodnie ze wstępnym eksperymentem obróbki próbki. We wstępnym eksperymencie roztwory podstawowe trzech wzorców najpierw rozcieńczono 5, 10, 25, 50 i 125 razy, a następnie wykreślono pierwszą krzywą wzorcową. Jednakże, gdy wykryto stężenie badanej próbki, stwierdzono, że stężenia salidrozydu nie mieściły się w zakresie liniowym tej krzywej standardowej i dlatego stężenia zostały dostosowane tak, aby uwzględnić je w krzywej. Podsumowując, powyższe doświadczenia wstępne posłużyły do wyznaczenia końcowych stężeń rozcieńczeń trzech badanych próbek do kolejnych badań eksperymentalnych.
2. Badanie precyzyjne: Wstrzyknąć 10 μl zmieszanego roztworu odniesienia do systemu HPLC sześć razy na dobę i uruchomić próbki w tych samych warunkach HPLC, które opisano w kroku 2.1. Rejestruj obszar szczytowy każdego komponentu elementu.
3. Eksperymenty z badaniem stabilności: Wstrzyknąć 10 μl przygotowanego roztworu próbki i oznaczyć powierzchnie pików HPLC zgodnie z warunkami chromatograficznymi odpowiednio po 0 h, 6 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h i 24 h.
   UWAGA: Obszary pików są rejestrowane automatycznie przez system HPLC.
4. Badanie odtwarzalności: Pobrać sześć próbek z tej samej partii RG w celu przygotowania roztworu próbki badanej zgodnie z metodą opisaną w kroku 1.2. Wstrzyknąć 10 μl każdej próbki do systemu HPLC. Uruchom próbki zgodnie z opisem w kroku 2.1 i określ odtwarzalność.
   UWAGA: Powtarzalność oceniano poprzez porównanie różnic stężeń między sześcioma próbkami.
5. Eksperyment regeneracyjny
   1. Przygotować sześć porcji tej samej partii RG do roztworu do badania. Następnie dodać około 50% substancji odniesienia każdego składnika wskaźnikowego w roztworze badanym, aby obliczyć stopień odzysku. Uruchom te próbki w systemie HPLC w tych samych warunkach, które opisano w kroku 2.1.
   2. Oblicz współczynnik odzysku.
      UWAGA: Stopień odzysku = (C - A) / B x 100, gdzie A to ilość składnika, która ma być mierzona w roztworze badanym, B to ilość dodanej substancji odniesienia, a C to zmierzona wartość roztworu zawierającego substancję odniesienia i próbkę RG. Patrz krok 2.1, aby zapoznać się z warunkami chromatograficznymi do wykonania powyższych kroków (tj. kroki 3.1-3.5).

4. Test rozpuszczania in vitro

1. Przeprowadź test rozpuszczania przy użyciu metody łopatkowej drugiej metody reguły ogólnej 0931 z Farmakopei Chińskiej (wydanie 2020)¹².
   UWAGA: Technika i sprzęt do pobierania próbek: Aparat do rozpuszczania leku (Tabela materiałów) jest wyposażony w kubek do rozpuszczania, łopatkę, system kontroli temperatury i system regulacji prędkości. Przed rozpoczęciem eksperymentu rozpuszczania woda jest wstępnie podgrzewana do zadanej temperatury, a następnie ustawiana jest odpowiednia prędkość. Rozpocznij rejestrowanie czasu natychmiast po dodaniu RG.
2. Dodać 100 ml ultraczystej wody do pojemnika do rozpuszczania aparatu do rozpuszczania leku i utrzymywać temperaturę na poziomie 37 °C ± 0,5 °C. Ustawić prędkość obrotową na 100 obr./min.
   UWAGA: Aparat do rozpuszczania jest wyposażony w urządzenie grzewcze, które umożliwia ustawienie temperatury w systemie. Nie stwierdzono istotnej różnicy w szybkości rozpuszczania salidrozydu w wodzie, sztucznym soku żołądkowym (16,4 ml rozcieńczonego kwasu solnego [234 ml stężonego kwasu solnego rozcieńczonego do 1000 ml wodą] z około 800 ml wody i 10 g pepsyny, dobrze wstrząśniętym i rozcieńczonym wodą do 1000 ml) oraz sztucznym sokiem jelitowym (bufor fosforanowy [pH 6,8] zawierający trypsynę)¹³. Jako podłoże do rozpuszczania wybrano najłatwiej dostępną wodę (ultraczystą).
3. Dodać 2,8 g RG do pojemnika do rozpuszczania i natychmiast rozpocząć rejestrowanie czasu rozpuszczenia. Zebrać łącznie 1 ml próbki za pomocą wstrzykiwacza (patrz tabela materiałów) po 1 minutach, 5 minutach, 10 minutach, 20 minutach, 30 minutach i 60 minutach i natychmiast uzupełnić objętość w pojemniku do rozpuszczania roztworem do rozpuszczania o tej samej temperaturze.
   UWAGA: Probówka do pobierania próbek w kubku do rozpuszczania nie może pobierać małych objętości próbek, dlatego do pobierania próbki służy wtryskiwacz. Próbki muszą być pobierane szybko, aby uniknąć pominięcia określonych punktów czasowych pobierania.
4. Pobrane próbki należy natychmiast przefiltrować przez mikroporowatą membranę o wielkości 0,22 μm i pobrać kolejny filtrat. Oznaczyć zawartość każdego składnika w każdym punkcie czasowym za pomocą HPLC (zgodnie z krokiem 2.1) i obliczyć łączne rozpuszczenie.
   1. Aby obliczyć łączne rozpuszczenie, oblicz rozpuszczenie każdego punktu czasowego (X_n):
      X_n = A / B x 100, gdzie A to ilość składników zmierzonych w każdym punkcie czasowym, a B to teoretyczna zawartość każdego składnika.
   2. Następnie oblicz łączne rozpuszczenie (Y):
      Y = X_n + (X₁ + ... + X_n-1) x V₂ / V₁, gdzie V₁ jest całkowitą objętością pożywki do rozpuszczania, a V₂ jest objętością substancji rozpuszczonej dodanej po każdym pobraniu próbki.
      UWAGA: Ze względu na niskie wartości odpowiedzi salidrozydu i kwasu galusowego na chromatogramie, skumulowane rozpuszczenie salidrozydu i galusanu etylu w punkcie czasowym 1 minuty nie zostało wykreślone na krzywej rozpuszczania.

5. Dopasowanie modelu rozpuszczania

1. Zaimportuj skumulowane dane dotyczące rozpuszczania w każdym punkcie czasowym do oprogramowania do analizy danych.
2. Użyj wtyczki do analizy rozpuszczania leków w oprogramowaniu do analizy danych, aby dopasować równanie GompertzMod, równanie Gompertza, równanie logistyczne i równanie Weibulla¹⁴. Im większa wartość R², tym lepszy jest efekt dopasowania krzywej.
   1. Uruchom oprogramowanie, wybierz okno Book1, aby przejść do okna Origin Data Editing.
   2. W pierwszej kolumnie A(X)-Long Name wprowadź czas, zdefiniuj czas jako czas i wprowadź każdy czas określenia rozpuszczania. Dane wejściowe w drugiej kolumnie B(Y)-Długa nazwa, zdefiniuj Dane jako skumulowane rozpuszczenie, wprowadź skumulowany procent rozpuszczenia w każdym czasie oznaczania rozpuszczania.
   3. Po wprowadzeniu danych należy wybrać kolumny A(X) i B(Y), a następnie wybrać wtyczkę Drug Dissolution Analysis na pasku menu oprogramowania i kliknąć Fit Dissolution Data > Concatenate Fit > OK. Oprogramowanie generuje wyniki dopasowania każdego modelu.

Wyniki

W tym badaniu, precyzja, stabilność, powtarzalność i odzysk próbki RG mieściły się w zakresie metodologicznym określonym w Farmakopei Chińskiej (tom 4, 2020)¹², co wskazuje, że metoda była wykonalna. Po wielokrotnym debugowaniu stwierdzono, że gradient elucji zastosowany w tym badaniu miał dobrą rozdzielczość ( Rysunek 1) dla trzech składowych indeksu w RG. Trzy składowe wskaźnika w RG miały dobrą zależność liniową w określonym zakresie stężeń (tabela 2). Wynik...

Dyskusja

Test rozpuszczania jest idealną metodą in vitro do symulacji rozpadu i rozpuszczania stałych preparatów doustnych w przewodzie pokarmowym¹⁵. Jest to ważny wskaźnik do oceny i kontroli jakości stałych preparatów doustnych. W związku z tym próba rozpuszczania odgrywa zasadniczą rolę w opracowywaniu doustnych preparatów leków stałych¹⁶. W szczególności, wraz z rozwojem technologii kontroli jakości tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), oznaczanie rozpuszczania było sto...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolumna chromatograficzna	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4,6 mm x 250 mm, 5 i mikro; m
Tester rozpuszczania leków	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Elektroniczna waga analityczna	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Galusan etylu (HPLC, ≥ 98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.
Oprogramowanie do rysowania funkcji	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Kwas galusowy (HPLC, ≥ 98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Nieskończoność
Metanol klasy HPLC	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
Wtryskiwacz	Chengdu Xinjin Shifeng Aparatura medyczna i Instrument Co., Sp. z o.o.	0,7 (22 G)
	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ 13 0,22 Granulat Nylon66
Rhodiola	Tybet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.
Salidrozyd (HPLC, ≥ 98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra czysta woda systemowa	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultradźwiękowa maszyna czyszcząca	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS