Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Summary

Kliniczny chip mikroprzepływowy jest ważną techniką analizy biomedycznej, która upraszcza wstępne przetwarzanie próbek krwi pacjenta klinicznego i immunofluorescencyjnie barwi krążące komórki nowotworowe (CTC) in situ na chipie, umożliwiając szybkie wykrycie i identyfikację pojedynczego CTC.

Abstract

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są istotne w prognozowaniu, diagnostyce i terapii przeciwnowotworowej. Liczenie CTC ma zasadnicze znaczenie w określaniu choroby pacjenta, ponieważ CTC są rzadkie i niejednorodne. CTC są odłączane od guza pierwotnego, dostają się do układu krążenia krwi i potencjalnie rosną w odległych miejscach, dając w ten sposób przerzuty do guza. Ponieważ CTC przenoszą podobne informacje do guza pierwotnego, izolacja CTC i późniejsza charakterystyka mogą mieć kluczowe znaczenie w monitorowaniu i diagnozowaniu raka. Enumeracja, modyfikacja powinowactwa i kliniczne barwienie immunofluorescencyjne rzadkich CTC są skutecznymi metodami izolacji CTC, ponieważ dostarczają niezbędnych elementów o wysokiej czułości. Chipy mikroprzepływowe oferują metodę płynnej biopsji, która jest wolna od bólu u pacjentów. W niniejszej pracy przedstawiamy listę protokołów klinicznych chipów mikroprzepływowych, wszechstronnej platformy izolującej CTC, która obejmuje zestaw funkcji i usług wymaganych do separacji, analizy i wczesnej diagnozy CTC, ułatwiając w ten sposób analizę biomolekularną i leczenie raka. Program obejmuje zliczanie rzadkich komórek nowotworowych, kliniczne wstępne przetwarzanie krwi pacjenta, które obejmuje lizę czerwonych krwinek, oraz izolację i rozpoznawanie CTC in situ na chipach mikroprzepływowych. Program umożliwia precyzyjne zliczanie komórek nowotworowych lub CTC. Dodatkowo program zawiera narzędzie, które obejmuje izolację CTC za pomocą wszechstronnych chipów mikroprzepływowych i identyfikację immunofluorescencyjną in situ na chipach, a następnie analizę biomolekularną.

Introduction

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są istotne w prognozowaniu, diagnostyce i terapii przeciwnowotworowej. Liczenie CTC jest niezbędne, ponieważ CTC są rzadkie i niejednorodne. Enumeracja, modyfikacja powinowactwa i kliniczne barwienie immunofluorescencyjne rzadkich CTC są potężnymi technikami izolacji CTC, ponieważ oferują niezbędne elementy o wysokiej czułości¹. Rzadka liczba komórek nowotworowych zmieszanych z normalną krwią ściśle naśladuje prawdziwą krew pacjenta, ponieważ 2-3 ml prawdziwej krwi pacjenta zawiera tylko 1-10 CTC. Aby rozwiązać krytyczny problem eksperymentalny, zamiast używać dużej liczby komórek nowotworowych wprowadzonych do PBS lub zmieszanych z normalną krwią, użycie rzadkiej liczby komórek nowotworowych zapewnia nam niską liczbę komórek krwi, co jest bliższe rzeczywistości podczas wykonywania eksperymentu.

Rak jest główną przyczyną zgonów na świecie². CTC to komórki nowotworowe wydalane z pierwotnego guza, które krążą w układzie krążenia krwi i limfatycznego³. Kiedy CTC przenoszą się do nowego, możliwego do przeżycia środowiska, rosną jako drugi nowotwór. Nazywa się to przerzutami i jest odpowiedzialne za 90% zgonów u pacjentów z rakiem⁴. CTC są niezbędne do rokowania, wczesnej diagnozy i zrozumienia mechanizmów raka. Jednak CTC są niezwykle rzadkie i niejednorodne u pacjentów we krwi ^5,6.

Mikroprzepływowe chipy oferują płynną biopsję, która nie atakuje guza. Ich zaletą jest to, że są przenośne, tanie i mają wagę dopasowaną do komórek. Izolacja CTC za pomocą chipów mikroprzepływowych dzieli się głównie na dwa typy: oparta na powinowactwie, która opiera się na wiązaniu antygenu z przeciwciałem^7,8,9 i jest oryginalną i najczęściej stosowaną metodą izolacji CTC; oraz chipy oparte na fizyce, które wykorzystują różnice w wielkości i odkształcalności między komórkami nowotworowymi a komórkami krwi^{10,11,12,13,14,15}, nie zawierają etykiet i są łatwe w obsłudze. Przewaga chipów mikroprzepływowych nad alternatywnymi technikami polega na tym, że oparte na fizyce podejście mikrofiltrów o dużej elipcie mocno wychwytuje CTC z wysoką wydajnością wychwytywania. Powodem tego jest to, że mikrosłupy elipsy są zorganizowane w cienkie tunele odstępów między linią. Odstępy między liniami różnią się od tradycyjnych odstępów punkt-punkt utworzonych przez mikrosłupki, takie jak mikrosłupki rombowe. Przechwytywanie CTC za pomocą chipów falowych łączy w sobie zarówno izolację opartą na właściwościach fizycznych, jak i na powinowactwie. Wychwytywanie fal w oparciu o chipy obejmuje 30 matryc w kształcie fali z przeciwciałem anty-EpCAM pokrytym na okrągłych mikrosłupkach. CTC są wychwytywane przez małe szczeliny, a duże luki są wykorzystywane do przyspieszenia natężenia przepływu. Pominięte CTC muszą przejść przez małe luki w następnej tablicy i są przechwytywane przez izolację opartą na powinowactwie zintegrowaną wewnątrz chip¹⁶.

Celem protokołu jest pokazanie liczenia rzadkich ilości komórek nowotworowych oraz klinicznej analizy CTC za pomocą mikroprzepływowych chipów. Protokół opisuje etapy izolacji CTC, sposób uzyskania małej liczby komórek nowotworowych, kliniczną fizyczną separację filtrów o małej elipsie, filtrów o dużej elipsie i filtrów trapezowych, modyfikację powinowactwa i wzbogacanie¹⁷.

Protocol

Próbki krwi pacjenta zostały dostarczone przez Longhua Hospital Affiliated to Shanghai Medical University.Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach Trzeciego Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów na wykorzystanie próbek do celów badawczych.

1. Eksperyment wstępny w celu sprawdzenia skuteczności wychwytywania z hodowanych komórek nowotworowych

1. Hoduj komórki nowotworowe MCF-7, MDA-MB-231 i HeLa w celu określenia skuteczności wychwytywania. Rozcieńczyć zawiesinę komórek nowotworowych, policzyć liczbę komórek nowotworowych i powtarzać, aż do uzyskania pożądanej liczby komórek w 1 ml PBS.
   1. Hodować komórki w kolbie do hodowli komórkowej o początkowej liczbie komórek ~ 1 x 10⁵ komórek w 1 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. Inkubować w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 °C z 5% stężeniem_CO2 w atmosferze.
   2. Kiedy linie komórkowe rosną jako przylegające monowarstwy do 95% zbieżności, odłącz je od szalek hodowlanych 0,25% roztworem trypsyny na 2 minuty, jak opisano w Chen et al.¹⁶.
   3. Wybarwić komórki nowotworowe kalceiną AM. Umieść 3 μl kalceiny AM w naczyniu hodowlanym i trzymaj naczynie w inkubatorze przez 30 minut. Następnie,trawić wszystkie komórki za pomocą trypsyny.
   4. Policz hodowane komórki nowotworowe w PBS za pomocą komory do liczenia komórek i rozcieńcz do uzyskania 100 komórek nowotworowych na 1 ml PBS.
      UWAGA: Aby dokładnie określić liczbę komórek, należy pobrać 50 μl otrzymanej zawiesiny komórek, aby pod mikroskopem sprawdzić, czy liczba komórek nowotworowych w niej wynosi pięć, czy nie. Zdecyduj o objętości zawiesiny komórek, którą należy pobrać, aby uzyskać 100 komórek nowotworowych zgodnie z rzeczywistą liczbą komórek nowotworowych w 50 μl zawiesiny komórek.
2. Wprowadzić zawiesinę komórkową zawierającą 100 komórek nowotworowych na 1 ml PBS do chipa mikroprzepływowego za pomocą strzykawki z pompą strzykawkową przy różnych natężeniach przepływu 0,5 ml/h, 1 ml/h, 2 mL/h, 3 mL/h, 4 mL/h i 5 mL/h. Uzyskaj skuteczność wychwytywania dla różnych natężeń przepływu, i określ optymalne natężenie przepływu.
   1. Policz liczbę komórek nowotworowych przechwyconych na chipie i wypływających z ujścia. Oblicz skuteczność wychwytywania, jak poniżej:
      Wydajność przechwytywania = Liczba przechwyconych komórek/(Liczba przechwyconych komórek + liczba komórek wypływających) × 100%
   2. Powtórz czynność, aby uzyskać skuteczność wychwytywania dla różnej liczby komórek nowotworowych od 10 do 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
3. Przetestuj i zweryfikuj chip mikroprzepływowy pod kątem rzadkiej liczby komórek nowotworowych. Wstrzyknąć te 10 zawiesin próbek do chipów mikroprzepływowych za pomocą wydrążonej igły wykonanej za pomocą ściągacza do mikropipet, aby zassać 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 komórek nowotworowych rozcieńczonych w 1 ml PBS. Wykryj i policz liczbę komórek nowotworowych dla każdej próbki po ich przechwyceniu na chipie.
   UWAGA: Wydrążona igła ma około 3 cm długości i średnicę zewnętrzną 1 mm.
4. Wykonaj kliniczne testy przed eksperymentem dla komórek nowotworowych wzbogaconych o normalne próbki krwi.
   1. Wybarwić komórki nowotworowe kalceiną AM, a następnie policzyć 100 komórek nowotworowych w 5 μl PBS. Umieść te komórki w 1 ml pełnych normalnych próbek krwi. Wprowadź te komórki do chipa i policz liczbę komórek nowotworowych uchwyconych na chipie za pomocą zielonej immunofluorescencji. Wykonaj wyliczenie in vivo na chipie, jak opisano powyżej, i oblicz skuteczność przechwytywania po przechwyceniu.
   2. Powtórzyć krok 1.4.1 dla dziewięciu dodatkowych stężeń liczby komórek nowotworowych od 10 do 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
   3. Wylicz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 komórek nowotworowych zgodnie z opisem w kroku 1.3 bez barwienia, wstrzyknij 1 ml pełnej normalnej krwi, wprowadź te próbki do chipa mikroprzepływowego i przechwyć komórki nowotworowe na chipie.
   4. Plama na chipie za pomocą Hoechst, CK-FITC i CD45-PE. Umieść 3-5 μl barwnika fluorescencyjnego w 20-30 μl PBS, a następnie wprowadź ten roztwór do chipa mikroprzepływowego za pomocą strzykawki. Wylicz liczbę komórek nowotworowych wychwyconych na chipie za pomocą immunofluorescencji niebieskiej i zielonej, aby określić skuteczność wychwytywania.
5. Wykonaj modyfikację chipa mikroprzepływowego w celu wychwytywania anty-EpCAM.
   na podstawie powinowactwa UWAGA: Ponieważ układ falowy łączy w sobie zarówno izolację opartą na powinowactwie, jak i izolację opartą na właściwościach fizycznych, zmodyfikuj układ za pomocą agentów.
   1. Zmodyfikuj powierzchnię chipa za pomocą 100 μl 4% (v/v) 3-merkaptopropylotrimetoksysilanu w etanolu w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Wprowadź ten roztwór do chipa ostrożnie i powoli, na wypadek, gdyby zniszczył wewnętrzną strukturę chipa, zwłaszcza klejenie górnej powierzchni i podłoża szkło.
      UWAGA: Powierzchnia wióra jest modyfikowana za pomocą merkaptosilanu. Oddziaływania zachodzące na chipie są determinowane przez wiązania chemiczne. Wiązania chemiczne są tworzone w celu realizacji wiązania przeciwciała zmodyfikowanego antygenem. Różne odczynniki są modyfikowane wewnątrz chipa w celu utworzenia wiązań chemicznych, które łączą się ze sobą. Ostatnim odczynnikiem, który ma być modyfikowany, jest cząsteczka anty-nabłonkowa adhezyjna (anty-EpCAM). Antygen powierzchniowy komórek nowotworowych EpCAM łączy się z anty-EpCAM wewnątrz chipa, aby zrealizować wychwytywanie CTC.
   2. Przemyć alkoholem etylowym 3x. Dodać 100 μl estru sprzęgającego N-y-maleimidobutyryloksysukcynimidu (GMBS, 1 μM) na chip i pozostawić na 30 minut.
   3. Umyć PBS 3x. Za pomocą strzykawki wprowadzić 1 ml PBS na chip w celu umycia.
   4. Potraktuj chip 30-40 μl 10 μg/ml neutrawidyny w temperaturze pokojowej przez 30 minut, prowadząc do unieruchomienia komórek na GMBS, a następnie przepłucz PBS w celu usunięcia nadmiaru awidyny.
   5. Zmodyfikuj chip za pomocą 3 μl antybiotynylowanego przeciwciała EpCAM o stężeniu 10 μg/ml w 100 μl PBS z 1% (w/v) BSA. Zachowaj to na noc.

2. Eksperyment kliniczny na chipie do liczenia krążących komórek nowotworowych (CTC)

1. Wstępnie przetworzyć kliniczne próbki krwi pacjentów z rakiem za pomocą roztworu do lizy czerwonych krwinek (RBCL) lub wprowadzić 2-3 ml próbki krwi bezpośrednio do chipa mikroprzepływowego za pomocą strzykawki.
   1. Wykonaj obróbkę wstępną, która trwa około 30 minut. Próbki krwi pełnej należy pobrać do probówek przeciwzakrzepowych. Dodaj 6-9 ml roztworu do lizy RBS do 2-3 ml krwi. Wirować przy 111 x g przez 5-8 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić górną warstwę czerwonego, klarownego płynu.
2. Przechwyć, zabarwić, rozpoznać i wyliczyć komórki na chipie zgodnie z poniższym opisem.
   1. Przechwyć komórki na chipie zgodnie z opisem w kroku 1.Wybarwić chip dla CTC przechwyconych za pomocą Hoechst, CK-FITC i CD45-PE. CK-FITC jest specyficznym barwnikiem dla komórek nowotworowych, a CD45-PE jest dla białych krwinek.
   2. Dodać 3 μl CK-FITC do 20 μl PBS. Wprowadzić go do strzykawki i przepompować rozcieńczony CK-FITC na chip. Pozostawić do zabrudzenia na 30 min. Wprowadź 300 μl PBS na chip, aby umyć chip.
   3. Dodać 3 μl CD45-PE do 20 μl PBS. Wprowadzić go do strzykawki i wpompować rozcieńczony CD45-PE na chip. Odstawić na 30 minut. Wprowadź 300 μl PBS na chip, aby umyć chip.
   4. Zidentyfikuj CTC za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 20x lub 40x. CTC emitują zarówno niebieską, jak i zieloną fluorescencję, a białe krwinki (WBC) emitują zarówno niebieską, jak i czerwoną fluorescencję. Zidentyfikuj CTC zarówno z niebieską, jak i zieloną fluorescencją, a WBC z niebieską i czerwoną fluorescencją.
   5. Na podstawie obrazów immunofluorescencyjnych wylicz liczbę CTC uchwyconych na chipie. Wylicz CTC jako Hoechst+/CK-FITC+/CD45−, a WBC jako Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
3. Wzbogać wychwycone CTC, przepłukując PBS przez strzykawkę w odwrotnym kierunku na chip mikroprzepływowy, aby zebrać CTC wychwycone na chipie z wlotu. Użyj strzykawki z 1 ml PBS, wprowadź ją z wylotu, aby wzbogacić CTC wychwycone na chipie w ciągu 2-3 minut i zbierz je z wlotu. Użyj 1 ml PBS na każdy etap prania i powtórz 3 razy.
4. Wybarwić komórki nowotworowe lub CTC uchwycone na chipie mikroprzepływowym, jak opisano poniżej.
   1. Plamić za pomocą kalceiny AM. Dodać 5 μl kalceiny AM do 20 μl PBS, barwić komórki przez 30 min, następnie odwirować przy 111 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej w celu uzyskania komórek nowotworowych i zawiesić w 1 ml PBS.
   2. Aby zidentyfikować jądra komórkowe, dodaj 20 μl roztworu DAPI (10 μl odczynnika DAPI w 20 μl PBS) do chipa przy optymalnym natężeniu przepływu 1 ml/h dla mikrofiltrów o dużej elipcie i 1,5 ml/h dla trapezowych. Przepuścić przez 20 μl roztworu podstawowego antycytokeratyny (3 μl przeciwciała antycytokeratynowego w 20 μl PBS), aby reagować z chipem przez 30 minut.
   3. Plamić WBC uchwycone na chipie. Po wychwyceniu CTC na chipie dodać 25 μl roztworu przeciwciała anty-CD45 (5 μl roztworu anty-CD45 w 20 μl PBS) do chipa i pozostawić do barwienia przez 30 minut. Przemyj PBS i zidentyfikuj komórki nabłonka za pomocą niebieskiej i zielonej fluorescencji.
5. Wykonaj identyfikację immunofluorescencyjną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak opisano poniżej.
   1. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego i wzbudz próbkę niebieskim laserem. Znajdź komórki emitujące niebieską fluorescencję, które są komórkami jądrzastymi. Użyj jednego z następujących powiększeń: 10x, 20x lub 40x. Znajdź czyste pole dla komórki nowotworowej. W przypadku źródła niebieskiego lasera należy użyć płytki wzbudzenia o długości fali 420-485 nm i długości fali płyty emisyjnej o długości 515 nm.
   2. Nie przesuwając próbek, użyj innego źródła lasera. Obróć mikroskop fluorescencyjny i wzbudz próbkę zielonym laserem. Znajdź komórki emitujące zieloną fluorescencję, która wskazuje na komórki nowotworowe. Rób zdjęcia tego samego pola z tym samym powiększeniem za pomocą tego zielonego źródła laserowego. Komórki, które emitują zarówno niebieską, jak i zieloną fluorescencję, są rozpoznawane jako komórki nowotworowe. W przypadku źródła zielonego lasera należy użyć fali płyty wzbudzenia o długości 460-550 nm i długości fali płyty emisyjnej o długości 590 nm
   3. Nie przesuwając próbek, użyj innego źródła lasera. Obróć mikroskop fluorescencyjny i wzbudz próbkę czerwonym laserem. Znajdź komórki emitujące czerwoną fluorescencję. Rób zdjęcia tego samego pola z tym samym powiększeniem za pomocą tego czerwonego źródła lasera. Komórki, które emitują zarówno niebieską, jak i czerwoną fluorescencję, są rozpoznawane jako białe krwinki.
   4. Zapisz obraz do uzyskania przy użyciu każdego z powyższych źródeł lasera. Zrób kilka zdjęć tego samego pola z różnymi kolorowymi światłami.
   5. Użyj światła ultrafioletowego o długości fali płytki wzbudzenia 330-400 nm i długości fali płyty emisyjnej 425 nm. Użyj światła fioletowego o długości fali płytki wzbudzenia 395-415 nm i długości fali płyty emisyjnej 455 nm.
6. Obliczyć skuteczność wychwytywania jak w kroku 1.2.1.

Results

Cała konfiguracja obejmuje pompę strzykawkową, strzykawkę i chip mikroprzepływowy. Zawiesina komórek w strzykawce jest podłączona do pompy strzykawkowej, a zawiesina komórek jest wprowadzana do chipa mikroprzepływowego w celu wychwycenia komórek. Skuteczność wychwytywania dla wszystkich zastosowanych chipów mikroprzepływowych wynosiła około 90% lub więcej. Dla chipa falowego zaprojektowaliśmy mikrostruktury o zróżnicowanych szczelinach. Małe szczeliny są wykorzystywane do wychwytywania CTC, a duże luki służą do przyspies...

Discussion

Rokowanie i wczesna diagnoza raka mają znaczący wpływ na leczenie nowotworów¹. Izolacja CTC za pomocą chipów mikroprzepływowych zapewnia płynną biopsję bez inwazji. Jednak CTC są niezwykle rzadkie i niejednorodne we krwi¹, co sprawia, że wyizolowanie CTC jest trudne. CTC mają podobne właściwości do pierwotnych źródeł nowotworów, z których pochodzą. W związku z tym CTC odgrywają istotną rolę w przerzutach raka¹.

Proponowan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kalibrowane pipety mikrokapilarne
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratyna przeciwciało monoklonalne
DMEM	HyClone	SH30081.05
	GIBCO, USA	26140
Hoechst 33342	Sondy molekularne, Solarbio Corp., Chiny	C0031
penicylina-streptomycyna	Ying Niezawodna biotechnologia, Chiny
Liza czerwonych krwinek (RBCL)	Solarbio, Pekin	R1010