Artykuł metodologiczny

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

DOI:

10.3791/64679

⸱

30 listopada 2022

 ,  , 
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alkoholowe zaburzenia płodowe (FASD) charakteryzują się bardzo zmiennym zestawem wad strukturalnych i zaburzeń poznawczych, które powstają w wyniku prenatalnej ekspozycji na etanol. Ze względu na złożoną patologię FASD, modele zwierzęce okazały się kluczowe dla naszego obecnego zrozumienia wad rozwojowych wywołanych etanolem. Danio pręgowany okazał się potężnym modelem do badania wad rozwojowych wywołanych etanolem ze względu na wysoki stopień zachowania zarówno genetyki, jak i rozwoju między danio pręgowanym a ludźmi. Jako system modelowy, danio pręgowany posiada wiele cech, które czynią je idealnymi do badań rozwojowych, w tym dużą liczbę zewnętrznie zapłodnionych zarodków, które są genetycznie podatne i półprzezroczyste. Dzięki temu naukowcy mogą precyzyjnie kontrolować czas i dawkę ekspozycji na etanol w wielu kontekstach genetycznych. Jednym z ważnych narzędzi genetycznych dostępnych u danio pręgowanego jest transgeneza. Jednak generowanie konstruktów transgenicznych i ustanawianie linii transgenicznych może być złożone i trudne. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy zajmujący się danio pręgowanymi stworzyli system transgenezy Tol2 oparty na transpozonach. Ten modułowy system wykorzystuje wielostanowiskowe podejście do klonowania Gateway w celu szybkiego montażu kompletnych transgenicznych konstruktów opartych na transpozonach Tol2. W tym miejscu opisujemy elastyczny zestaw narzędzi systemu Tol2 oraz protokół generowania konstruktów transgenicznych gotowych do transgenezy danio pręgowanego i ich wykorzystania w badaniach etanolu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenatalne narażenie na etanol powoduje kontinuum strukturalnych deficytów i zaburzeń poznawczych określanych jako spektrum płodowych zaburzeń alkoholowych (FASD)1,2,3,4. Złożone relacje między wieloma czynnikami sprawiają, że badanie i zrozumienie etiologii FASD u ludzi jest trudne. Aby sprostać temu wyzwaniu, wykorzystano szeroką gamę modeli zwierzęcych. Biologiczne i eksperymentalne narzędzia dostępne w tych modelach okazały się kluczowe w rozwijaniu naszego zrozumienia mechanistycznych podstaw teratogenności etanolu, a wyniki z tych systemów modelowych były niezwykle spójne z tym, co stwierdzono w badaniach nad etanolem u ludzi5,6. Wśród nich danio pręgowany okazał się potężnym modelem do badania teratogenezy etanolu7,8, częściowo ze względu na ich zewnętrzne zapłodnienie, wysoką płodność, podatność genetyczną i półprzezroczyste zarodki. Połączenie tych zalet sprawia, że danio pręgowany idealnie nadaje się do badań obrazowania FASD na żywo w czasie rzeczywistym przy użyciu transgenicznych linii danio pręgowanego.

Transgeniczne rybo pręgowane były szeroko wykorzystywane do badania wielu aspektów rozwoju embrionalnego9. Jednak tworzenie konstruktów transgenicznych i kolejnych linii transgenicznych może być niezwykle trudne. Standardowy transgen wymaga aktywnego elementu promotora do napędzania transgenu i sygnału poli A lub "ogona", a wszystko to w stabilnym wektorze bakteryjnym do ogólnego utrzymania wektora. Tradycyjne generowanie wieloskładnikowego konstruktu transgenicznego wymaga wielu czasochłonnych etapów klonowania podrzędnego10. Podejścia oparte na PCR, takie jak montaż Gibsona, mogą obejść niektóre problemy związane z podklonowaniem. Jednak unikalne startery muszą być zaprojektowane i przetestowane pod kątem generowania każdego unikalnego konstruktu transgenicznego10. Poza budową transgenu, integracja genomowa, transmisja w linii zarodkowej i badania przesiewowe w celu prawidłowej integracji transgenu również były trudne. W tym miejscu opisujemy protokół korzystania z systemu transgenezy Tol2 opartego na transpozonach (Tol2Kit)10,11. Ten modułowy system wykorzystuje wielomiejscowe klonowanie bram do szybkiego generowania wielu konstruktów transgenicznych ze stale powiększającej się biblioteki wektorów "wejściowych" i "docelowych". Zintegrowane elementy transpozycyjne Tol2 znacznie zwiększają szybkość transgenezy, umożliwiając szybką budowę i integrację genomową wielu transgenów. Korzystając z tego systemu, pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać wytwarzanie transgenicznej linii endodermalnej danio pręgowanego do badania specyficznych dla tkanek defektów strukturalnych leżących u podstaw FASD. Ostatecznie, w tym protokole, pokazujemy, że modułowa konfiguracja i budowa transgenicznych konstruktów znacznie pomogą w badaniach FASD na bazie danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zarodki danio pręgowanego użyte w tej procedurze zostały wyhodowane i wyhodowane zgodnie z ustalonymi protokołami IACUC12. Protokoły te zostały zatwierdzone przez Uniwersytet w Louisville.

UWAGA: Odmiana danio pręgowanego typu dzikiego, AB i bmp4st72; W pracy wykorzystano podwójnie zmutowaną linię SMAD5B1100. Cała woda używana w tej procedurze była sterylną wodą z odwróconej osmozy. Obrazy konfokalne wykonano pod laserowo-skaningowym mikroskopem konfokalnym. Pomiary endodermy zostały wykonane za pomocą narzędzia pomiarowego w ImageJ. Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane przy użyciu programów statystycznych.

1. Tworzenie rozwiązań i mediów

  1. Pożywka bakteryjna: Rozpuść bulion lub agar LB zgodnie z instrukcjami producenta i autoklaw. Przed przelaniem pożywki na 100-milimetrowe szalki Petriego należy dodać ampicylinę (50 μg/ml), kanamycynę (50 μg/ml) lub kombinację ampicyliny/chloramfenikolu (odpowiednio 50 μg/ml i 30 μg/ml).
  2. Aby przygotować 20x pożywki dla zarodków, rozpuść w 1 l wody: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO4, 0,142 g Na2HPO4 i 4,9 g MgSO4·7H2O. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór podstawowy za pomocą systemu filtracji próżniowej 0,22 μm, i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zignoruj tworzący się biały osad; Nie będzie to miało wpływu na media.
  3. W 19 l wody rozpuścić 1,2 gNaHCO3 i dodać 1 l 20x pożywki dla zarodków w celu wytworzenia roztworu roboczej pożywki dla zarodków i utrzymywać ten roztwór w temperaturze 28 °C.
  4. W przypadku 2% roztworu czerwieni fenolowej rozpuść 20 mg soli sodowej czerwieni fenolowej w 1 ml wody wolnej od RNaz i przechowuj w temperaturze pokojowej.

2. Formy do iniekcji zarodków

  1. Aby przygotować płytkę do wstrzykiwań agarozy, należy rozpuścić agarozę w pożywce zarodkowej do końcowego stężenia 3%, podgrzewając do wrzenia.
  2. Wlej 50 ml agarozy do 100 mm szalek Petriego i gdy agaroza jest jeszcze płynna, delikatnie umieść formę wtryskową w agarozie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków pod formą.
  3. Niech talerze agarozy ostygną. Gdy agaroza stwardnieje, wyjmij formę wtryskową i przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do użycia.

3. Pipety iniekcyjne

  1. Wyciągnąć kapilary o średnicy zewnętrznej 1.0 mm (OD) zawierające filament do igieł za pomocą pionowego ściągacza do pipet z elektrozaworem ustawionym na 2.5 i elementem grzejnym ustawionym na 14.6.
    UWAGA: Każdy podgrzewany ściągacz będzie działał, jeśli wciągnie naczynia włosowate do dwóch igieł czysto i równomiernie, ale igły do wstrzykiwań należy wyciągnąć w ciągu 1 tygodnia od wstrzyknięcia zarodków danio pręgowanego, aby uzyskać spójne wyniki wstrzyknięcia.
    1. Umieść kapilar w ściągaczu, dokręć zacisk na każdym końcu, a następnie aktywuj element grzejny.
    2. Pociągnij naczynia włosowate, aby utworzyć dwie igły do wstrzykiwań.
    3. Wyjmij naczynia włosowate ze ściągacza i przechowuj je na pustej szalce Petriego z paskiem gliny modelarskiej, która działa jako uchwyt na igłę.

4. Przygotowanie mRNA transpozazy

  1. Linearyzować plazmid zawierający transpozazę Tol2Kit z endonukleazą restrykcyjną NotI, łącząc w probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml następujące elementy: 10 μl plazmidu transpozazy (150 ng/μl), 1,5 μl buforu reakcyjnego endonukleazy restrykcyjnej, 0,3 μl endonukleazy NotI.
  2. Napełnij reakcję do 20 μl wodą wolną od RNaz, a następnie wymieszaj i strawij w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Zatrzymać trawienie transpozazy poprzez dodanie 1 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μl 5 M NH4OAc i 80 μl 100% EtOH do reakcji trawienia, a następnie wymieszać i schłodzić w temperaturze -20 °C przez noc.
  4. Odwirować roztwór o stężeniu 14 000x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad DNA w wodzie wolnej od RNaz.
  5. Określić liniowe stężenie plazmidu w nanogramach na mikrolitr (ng / μL) za pomocą fluorometru, najpierw uruchamiając 2 μl ślepej próby wodnej wolnej od RNaz, a następnie uruchamiając 2 μl zlinearyzowanego plazmidu.
    UWAGA: Stężenia plazmidu zwykle wahają się między 100-200 ng/μL
  6. Skonfiguruj produkcję mRNA SP6, łącząc następujące składniki w kolejności w probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml: 10 μl 2x NTP/CAP, 2 μL 10x buforu reakcyjnego, 0,1-1 μg liniowej matrycy DNA i 2 μl mieszanki enzymów SP6.
  7. Napełnić reakcję do 20 μl wodą wolną od RNaz, a następnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  8. Po inkubacji przez 2 godziny dodać 1 μl DNazy, dobrze wymieszać i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Aby zatrzymać reakcję SP6, dodać 30 μl roztworu wytrącającego LiCl do probówki reakcyjnej, a następnie wymieszać i schłodzić w temperaturze -20 °C przez noc.
  10. Odwirować roztwór o stężeniu 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia mRNA, a następnie odessać supernatant i przepłukać osad mRNA 1 ml 80% EtOH (rozcieńczonego wodą wolną od RNaz).
  11. Odwirować roztwór o stężeniu 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia mRNA, a następnie odessać supernatant. Pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu.
  12. Zawiesić osad mRNA w 20 μl wody wolnej od RNaz, oznaczyć stężenie mRNA w nanogramach na mikrolitr (ng/μL) za pomocą fluorometru, jak opisano w kroku 4.5 (powinno wynosić co najmniej 100 ng/μL), podamy 100 ng mRNA na probówkę do jednorazowego użytku i przechowuj w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Aby upewnić się, że mRNA nie zostanie zdegradowane, 2 μl mRNA można szybko uruchomić na żelu do elektroforezy DNA, aby potwierdzić pojedyncze pasmo przy 1,950 bps.

5. Klonowanie Multisite Gateway w celu stworzenia wektorów wejściowych dla transgenezy

UWAGA: Ten protokół jest zmodyfikowany z Kwan et al.10, z reakcją LR zapisaną jako reakcję pół-LR i o całkowitej objętości 5 μL. Aby wygenerować nowe elementy wejściowe, należy użyć reakcji BP przy użyciu wektorów donorowych 5', środkowych i 3'10,13.

  1. Aby przeprowadzić reakcję, zbierz po 10 fmol z p5E, pME i p3E oraz 20 fmol wektora docelowego (pDest).
    UWAGA: Wielomiejscowa rekombinacja LR wykorzystuje cztery różne wektory plazmidowe: wektor wejściowy 5' (p5E), środkowy wektor wejściowy (pME), wektor wejściowy 3' (p3E) i wektor docelowy (pDest), do wygenerowania unikalnego konstruktu transgenicznego otoczonego powtórzeniami Tol2 gotowymi do wstrzyknięcia do zarodków danio pręgowanego.
    1. Zidentyfikuj rozmiar wszystkich czterech wektorów w parach zasad ze źródła plazmidu (Tabela 1, strona Wiki Tol2Kit14 lub Addgene11; patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: W przypadku nowych wektorów, pełne sekwencjonowanie plazmidu za pośrednictwem komercyjnych firm sekwencjonujących może zapewnić dokładny rozmiar plazmidu w bps.
    2. Oznaczyć stężenie wszystkich czterech wektorów w nanogramach na mikrolitr (ng/μl) za pomocą fluorometru, jak opisano w kroku 4.5.
    3. Przyjmując masę DNA jako 660 g/mol i wielkość plazmidu (w bps), oblicz całkowitą liczbę nanogramów (ng) plazmidu potrzebną do osiągnięcia 10 fmol (wektory wejściowe) lub 20 fmol (wektor docelowy).
      figure-protocol-1
      UWAGA: Laboratorium Mosimann na Uniwersytecie Kolorado, Anschutz Medical Campus, wygenerowało ogólnodostępny arkusz kalkulacyjny do obliczenia ilości potrzebnego plazmidu (w ng) i objętości (w μL) wektorów potrzebnych w reakcji LR15.
  2. Aby wygenerować konstrukcję opisaną poniżej, sox17:EGFPCAAX, użyj następujących wektorów: wektor p5E zawierający promotor sox17 danio pręgowanego, który ma rozmiar 6,918 pz16; wektor pME zawierający prenylowany EGFP, który ma rozmiar 3,345 bp10; wektor p3E zawierający sekwencję sygnałową SV40 late poly A, która ma rozmiar 2,838 bp10; oraz pDest, który ma rozmiar 5,883 bp10.
  3. Korzystając ze stężenia plazmidu określonego w kroku 5.1.2 i ilości w nanogramach (ng) dla każdego wektora (krok 5.1.3), obliczyć całkowitą liczbę mikrolitrów (μl) każdego plazmidu potrzebną do osiągnięcia 10 fmol (wektory wejściowe) lub 20 fmol (wektor docelowy), a następnie podzielić to przez dwa w celu wykorzystania w reakcjach 5 μl half-LR (wszystkie wartości wymienione poniżej są wymienione w tabeli 2).
    figure-protocol-2
    1. Aby wytworzyć 10 fmol p5E-sox17, użyj 45,66 ng (przy stężeniu 140,3 ng/μL) i rozcieńcz sterylną wodą przez współczynnik 4, aby uzyskać 0,65 μl.
    2. Aby wytworzyć 10 fmol pME-EGFPCAAX, użyj 22,08 ng (przy stężeniu 213,5 ng/μL) i rozcieńcz sterylną wodą przez współczynnik 10, aby uzyskać 0,52 μL.
    3. Aby wytworzyć 10 fmol p3E-poly A, użyj 15,73 ng (przy stężeniu 276,1 ng/μL) i rozcieńcz sterylną wodą przez współczynnik 20, aby uzyskać 0,57 μl.
    4. Dla 20 fmol wektora docelowego użyj 77,66 ng pDest (w stężeniu 307,3 ng/μL) i rozcieńcz sterylną wodą 5-krotnie, aby uzyskać 1,63 μl.
  4. Aby rozpocząć reakcję pół-LR o pojemności 5 μl, połącz objętości p5E, pME, p3E i pDest oznaczone w kroku 5.3 w probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml, a następnie dodaj sterylną wodę, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 4 μl.
  5. Energicznie wirować mieszankę enzymów LR 2x przez 1 minutę każdy, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie, a następnie dodać 1 μL do reakcji i dokładnie wymieszać.
  6. Inkubować w temperaturze 25 °C przez noc (16+ h).
  7. Zatrzymać reakcję LR dodając 0,5 μl proteinazy K (2 μg/μL), inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.
  8. Przekształć 3-4 μl plazmidu w rozmrożone, chemicznie kompetentne komórki, dodając plazmid i pozostawiając komórki na lodzie przez 25-30 minut.
  9. Podczas gdy komórki siedzą na lodzie, podgrzej dwie płytki agarowe LB-ampicyliny do temperatury pokojowej.
  10. Szok termiczny komórek w łaźni wodnej o temperaturze 42°C dokładnie przez 30 sekund.
  11. Po szoku cieplnym dodać do komórek 250 μl bezantybiotykowej, bogatej w płyn pożywki i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny.
  12. Rozprowadź 300 μl bakterii na jednej płytce ampicyliny i inkubuj w temperaturze 37°C przez noc.
  13. Następnego ranka przebadaj kolonie pod kątem obecności dwóch fenotypów, klarownego i nieprzezroczystego, wybierz przezroczyste kolonie (jak opisano w Kwan et al.10) pojedynczo, zaszczepij płynną kulturę, a następnie wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Czyste kolonie prawie zawsze zawierają właściwą kolonię LR (w >85% przypadków).
  14. Korzystając z zestawu komercyjnego zgodnie z instrukcjami producenta, wykonaj przygotowanie plazmidu na każdej płynnej kulturze i diagnostycznie trawij każdy plazmid, aby potwierdzić odpowiedni rozmiar konstruktu transgenicznego, co wskazuje, że reakcja bramki LR zadziałała prawidłowo.
  15. Ponownie przekształcić właściwe konstrukty transgeniczne przy użyciu standardowego protokołu transformacji bakteryjnej, jak opisano w krokach 5.4-5.12, używając 0,5-1 μl plazmidu i inkubować tylko w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  16. Ponownie rozprowadź smugi kolonii i potwierdź, że każda z nich ma konstrukt transgeniczny LR, jak w kroku 5.14.
  17. Oznaczyć stężenie plazmidu zgodnie z opisem w kroku 4.5 (do wstrzyknięcia zarodka potrzebne jest co najmniej 150 ng/μl).

6. Wstrzyknięcie transgenu do zarodków

  1. Rozmrozić jednorazową próbkę mRNA transpozazy i transgeniczny konstrukt Tol2 na lodzie i wstępnie przygotować płytkę do wstrzykiwań agarozy do temperatury pokojowej.
  2. Połącz na lodzie: 150 ng plazmidu, 100 ng mRNA transpozazy i 2% czerwieni fenolowej (0,3 μl). Następnie dodaj wodę wolną od RNA, aby uzupełnić objętość do 3 μl.
  3. Przenieść jeden zarodek w stadium komórkowym za pomocą pipet transferowych na płytkę iniekcyjną (opisaną w kroku 2) wypełnioną elektromagnetycznym całkowicie pokrywającym agar, a następnie delikatnie wycisnąć około 50-75 zarodków na szczelinę płytki iniekcyjnej.
  4. Dodaj mieszaninę mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej do otwartego końca igły do iniekcji kapilarnej, umieść igłę kapilarną w tworniku zestawu iniekcyjnego i włącz zestaw do iniekcji.
    UWAGA: Urządzenie do wstrzykiwań wykorzystuje sprężony gaz, taki jak powietrze, do impulsowego wprowadzania pożądanej objętości (opisanej w kroku 6.5) mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej do zarodka po aktywacji.
  5. Opuścić igłę kapilarną do EM płytki iniekcyjnej i złamać końcówkę za pomocą kleszczy, aby umożliwić wypompowanie przez urządzenie iniekcyjne tylko niewielkiej ilości mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej.
  6. Wstrzyknąć do zarodków mały bolus o pojemności 3 nl mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej do ciała komórkowego zarodka.
    UWAGA: Bobus o pojemności 3 nL to objętość mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej, przy której siedem bolusów może teoretycznie zmieścić się równomiernie w linii środkowej zarodka.
  7. Po zakończeniu wstrzykiwania zarodków należy wyjąć je z płytki iniekcyjnej, delikatnie wyjmując je ze szczeliny i pipetując na 100-milimetrową szalkę Petriego ze świeżym EM (około 40 ml), a następnie inkubować w temperaturze 28,5 °C, aby umożliwić rozwój zarodków.

7. Badania przesiewowe zarodków pod kątem insercji transgenicznej

  1. Do ekspresji białek fluorescencyjnych należy wybrać odpowiedni etap rozwoju, w którym transgen fluorescencyjny powinien ulec ekspresji, i przeprowadzić badanie przesiewowe na obecność fluorescencji pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym.
    UWAGA: Te zarodki będą miały mozaikową ekspresję i będą wykazywać genomiczną insercję konstruktu transgenicznego.
  2. Badanie przesiewowe w kierunku transgenów niefluorescencyjnych poprzez badanie przesiewowe w kierunku fluorescencyjnego markera transgenicznego (jak opisano w kroku 7.1), takiego jak GFP sterowany przez specyficzny dla serca promotor genu cmlc2 lub mCherry napędzany przez specyficzny dla soczewki promotor αcyrstalliny, które są zawarte w odrębnych wektorach docelowych.
  3. Pozwól zarodkom dodatnim do insercji transgenicznej w pełni rozwinąć się do stadium dorosłego grybowanego.
  4. Gdy potencjalne ryby transgeniczne osiągną wiek rozrodczy, należy je przebadać indywidualnie zarówno pod kątem transmisji w linii zarodkowej, jak i ekspresji transgenu, krzyżując je z danio pręgowanym typu dzikiego.
  5. Te dorosłe osobniki, których zarodki rozwijają się normalnie i dają najsilniejszą i najbardziej odpowiednią ekspresję transgenu, są utrzymywane jako unikalne transgeniczne linie danio pręgowanego do przyszłych prac i analiz.
    UWAGA: Jako alternatywne podejście do badań przesiewowych pod kątem insercji genomowej konstruktów transgenicznych, należy zaprojektować startery PCR, które tylko amplifikują konstrukt transgeniczny, a nie DNA typu dzikiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wygenerować transgeniczne konstrukty, użyliśmy systemu transgenezy Tol2. Trzy wektory wejściowe, w tym p5E, który zawiera elementy promotora/wzmacniacza genu, pME, który zawiera gen do ekspresji przez elementy promotora/wzmacniacza, oraz p3E, który co najmniej zawiera ogon poliA, zostały wykorzystane do wygenerowania konstruktu transgenicznego poprzez klonowanie LR przez wielomiejscową bramę. Wektor docelowy, pDest, dostarcza powtórzeń Tol2 do genomowej insercji konstruktu transgenicznego w zarodkach danio p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany idealnie nadaje się do badania wpływu ekspozycji na etanol na rozwój i stany chorobowe 7,8. Danio pręgowany wytwarza dużą liczbę półprzezroczystych, zewnętrznie zapłodnionych, genetycznie podatnych na rozciąganie zarodków, co pozwala na obrazowanie na żywo kilku tkanek i typów komórek znakowanych transgenami jednocześnie w wielu kontekstach środowiskowych19,20. Te mocne strony, w połączeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania przedstawione w tym artykule były wspierane przez grant z National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 dla C.B.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Skrzynka narzędziowa Addgene Tol2https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
PowietrzeDostarczane bezpośrednio przez uniwersytet Waga analityczna
AmpicillinFisher ScientificBP1760
VWR10204-962
Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID KapilaraFHC30-30-0
Chlorek wapniaVWR97062-590
ChloramfenikolBioVision2486
EDTAFisher ScientificBP118-500
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjnyOlympusSZX16
KanamycynaFisher ScientificBP906
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyOlympusFluoview FV1000
Lawson Lab Przygotowanie plazmiduhttps://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB AgarFisher ScientificBP9724
LB BulionFisher ScientificBP1426
Nisko-EEO / wielofunkcyjny / biologia molekularna Klasa AgarozaFisher ScientificBP160-500
LR Clonase II Plus EnzymeFisher Scientific12538200
Siarczan magnezu (heptahydrat)Fisher ScientificM63-500
Uchwyt na mikropipetyZastosowane oprzyrządowanie naukoweMIMPH-M-
0,5 ml VWR10025-724
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml VWR10025-716
MikromanipulatorStosowane oprzyrządowanie naukoweMM33
Końcówki do mikropipet 10 μ L Fisher Scientific13611106
Końcówki do mikropipet 1000 μ L Fisher Scientific13611127
Końcówki do mikropipet 200 μ L Fisher Scientific13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiFisher ScientificAM1340
Mosimann Lab Tol2 Arkusz obliczeniowyhttps://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
SpektrofotometrNanoDropND-1000
NcoINEBR0189S
NotINEBR0189S
szalki Petriego 100 mm Fisher ScientificFB012924
Fenol Czerwona sól sodowaSigma AldrichP4758-5G
Pipetman L p1000L MikropipetaGilsonFA10006M
Pipetman L p200L MikropipetaGilsonFA10005M
Pipetman L p2L MikropipetaGilsonFA10001M
Chlorek potasuFisher ScientificP217-500
Fosforan potasu (dwuzasadowy)VWRBDH9266-500G
Wtryskiwacz ciśnieniowyZastosowane oprzyrządowanie naukoweMPPI-3
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Wodorowęglan soduVWRBDH9280-500G
Chlorek soduFisher ScientificS271-500
Fosforan sodu (dwuzasadowy)Fisher ScientificS374-500
Stericup .22 µ M System filtracji próżniowej Strona Wiki MilliporeSCGPU11RE
Tol2http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemicznie kompetentni E. coliFisher ScientificC404010
Pionowy ściągacz do pipetDavid Kopf Instruments720
Forma do mikroiniekcji danio pręgowanegoAdaptacyjne narzędzia naukowei34
dawcy Probówka do mikrowirówek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460(2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
  14. The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
  15. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  16. Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  17. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  18. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  19. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).
  20. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  22. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  23. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  24. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  25. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transgeneza Tol2model rybki zebrafishklonowanie Gatewaytransgeniczne rybki zebrafishwstrzykiwanie do embrion wp odowe spektrum alkoholowemRNA transpozazytransmisja w linii zarodkowejmarker fluorescencyjnyekspozycja na etanol

Powiązane artykuły