Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64679

⸱

30 listopada 2022

 ,  , 
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

Streszczenie

Alkoholowe zaburzenia płodowe (FASD) charakteryzują się bardzo zmiennym zestawem wad strukturalnych i zaburzeń poznawczych, które powstają w wyniku prenatalnej ekspozycji na etanol. Ze względu na złożoną patologię FASD, modele zwierzęce okazały się kluczowe dla naszego obecnego zrozumienia wad rozwojowych wywołanych etanolem. Danio pręgowany okazał się potężnym modelem do badania wad rozwojowych wywołanych etanolem ze względu na wysoki stopień zachowania zarówno genetyki, jak i rozwoju między danio pręgowanym a ludźmi. Jako system modelowy, danio pręgowany posiada wiele cech, które czynią je idealnymi do badań rozwojowych, w tym dużą liczbę zewnętrznie zapłodnionych zarodków, które są genetycznie podatne i półprzezroczyste. Dzięki temu naukowcy mogą precyzyjnie kontrolować czas i dawkę ekspozycji na etanol w wielu kontekstach genetycznych. Jednym z ważnych narzędzi genetycznych dostępnych u danio pręgowanego jest transgeneza. Jednak generowanie konstruktów transgenicznych i ustanawianie linii transgenicznych może być złożone i trudne. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy zajmujący się danio pręgowanymi stworzyli system transgenezy Tol2 oparty na transpozonach. Ten modułowy system wykorzystuje wielostanowiskowe podejście do klonowania Gateway w celu szybkiego montażu kompletnych transgenicznych konstruktów opartych na transpozonach Tol2. W tym miejscu opisujemy elastyczny zestaw narzędzi systemu Tol2 oraz protokół generowania konstruktów transgenicznych gotowych do transgenezy danio pręgowanego i ich wykorzystania w badaniach etanolu.

Wprowadzenie

Prenatalne narażenie na etanol powoduje kontinuum strukturalnych deficytów i zaburzeń poznawczych określanych jako spektrum płodowych zaburzeń alkoholowych (FASD)1,2,3,4. Złożone relacje między wieloma czynnikami sprawiają, że badanie i zrozumienie etiologii FASD u ludzi jest trudne. Aby sprostać temu wyzwaniu, wykorzystano szeroką gamę modeli zwierzęcych. Biologiczne i eksperymentalne narzędzia dostępne w tych modelach okazały się kluczowe w rozwijaniu naszego zrozumienia mechanistycznych podstaw teratogenności etanolu, a wyniki z tych systemów modelowych były niezwykle spójne z tym, co stwierdzono w badaniach nad etanolem u ludzi5,6. Wśród nich danio pręgowany okazał się potężnym modelem do badania teratogenezy etanolu7,8, częściowo ze względu na ich zewnętrzne zapłodnienie, wysoką płodność, podatność genetyczną i półprzezroczyste zarodki. Połączenie tych zalet sprawia, że danio pręgowany idealnie nadaje się do badań obrazowania FASD na żywo w czasie rzeczywistym przy użyciu transgenicznych linii danio pręgowanego.

Transgeniczne rybo pręgowane były szeroko wykorzystywane do badania wielu aspektów rozwoju embrionalnego9. Jednak tworzenie konstruktów transgenicznych i kolejnych linii transgenicznych może być niezwykle trudne. Standardowy transgen wymaga aktywnego elementu promotora do napędzania transgenu i sygnału poli A lub "ogona", a wszystko to w stabilnym wektorze bakteryjnym do ogólnego utrzymania wektora. Tradycyjne generowanie wieloskładnikowego konstruktu transgenicznego wymaga wielu czasochłonnych etapów klonowania podrzędnego10. Podejścia oparte na PCR, takie jak montaż Gibsona, mogą obejść niektóre problemy związane z podklonowaniem. Jednak unikalne startery muszą być zaprojektowane i przetestowane pod kątem generowania każdego unikalnego konstruktu transgenicznego10. Poza budową transgenu, integracja genomowa, transmisja w linii zarodkowej i badania przesiewowe w celu prawidłowej integracji transgenu również były trudne. W tym miejscu opisujemy protokół korzystania z systemu transgenezy Tol2 opartego na transpozonach (Tol2Kit)10,11. Ten modułowy system wykorzystuje wielomiejscowe klonowanie bram do szybkiego generowania wielu konstruktów transgenicznych ze stale powiększającej się biblioteki wektorów "wejściowych" i "docelowych". Zintegrowane elementy transpozycyjne Tol2 znacznie zwiększają szybkość transgenezy, umożliwiając szybką budowę i integrację genomową wielu transgenów. Korzystając z tego systemu, pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać wytwarzanie transgenicznej linii endodermalnej danio pręgowanego do badania specyficznych dla tkanek defektów strukturalnych leżących u podstaw FASD. Ostatecznie, w tym protokole, pokazujemy, że modułowa konfiguracja i budowa transgenicznych konstruktów znacznie pomogą w badaniach FASD na bazie danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie embriony danio pręgowanego użyte w tej procedurze były hodowane i rozmnażane zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IACUC12. Protokoły te zostały zatwierdzone przez University of Louisville.

UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano szczep danio pręgowanego typu dzikiego, AB, oraz linię podwójnego mutanta bmp4st72;smad5b1100. Cała woda użyta w tej procedurze była sterylną wodą z odwróconej osmozy. Obrazy konfokalne wykonano przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego. Pomiary endodermy przeprowadzono za pomocą narzędzia pomiarowego w programie ImageJ. Wszystkie analizy statystyczne wykonano przy użyciu oprogramowania statystycznego.

1. Przygotowanie roztworów i pożywek

  1. Pożywki bakteryjne: Rozpuścić bulion LB lub agar zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie poddać autoklawowaniu. Przed wylaniem pożywki do szalek Petri o średnicy 100 mm dodać ampicylinę (50 µg/mL), kanamycynę (50 µg/mL) lub kombinację ampicyliny i chloramfenikolu (odpowiednio 50 µg/mL i 30 µg/mL).
  2. Aby przygotować 20-krotny roztwór stokowy pożywki dla embrionów, rozpuścić w 1 L wody następujące składniki: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO4, 0,142 g Na2HPO4 oraz 4,9 g MgSO4·7H2O. Roztwór stokowy wysterylizować poprzez filtrację przy użyciu systemu filtracji próżniowej 0,22 µm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Należy zignorować powstający biały osad; nie będzie on miał wpływu na właściwości pożywki.
  3. W 19 L wody rozpuścić 1,2 g NaHCO3 i dodać 1 L 20-krotnego roztworu stokowego pożywki dla embrionów w celu przygotowania roboczego roztworu pożywki dla embrionów; roztwór ten należy utrzymywać w temperaturze 28 °C.
  4. Aby przygotować 2% roztwór czerwieni fenolowej, rozpuścić 20 mg soli sodowej czerwieni fenolowej w 1 mL wody wolnej od RNaz i przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Formy do iniekcji embrionów

  1. Aby przygotować agarozową płytkę do iniekcji, rozpuścić agarozę w pożywce dla zarodków do stężenia końcowego 3%, podgrzewając do wrzenia.
  2. Wlać 50 mL agarozy do szalek Petriego o średnicy 100 mm, a gdy agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym, ostrożnie umieścić w niej formę do iniekcji, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza pod formą.
  3. Pozostawić płytki agarozowe do ostygnięcia. Po zastygnięciu agarozy wyjąć formę do iniekcji i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

3. Pipety dozujące

  1. Wytnij igły z kapilar o średnicy zewnętrznej (OD) 1,0 mm zawierających filament, korzystając z pionowej wyciągarki do pipet z solenoidem ustawionym na 2,5 i elementem grzejnym ustawionym na 14,6.
    UWAGA: Można użyć dowolnej wyciągarki grzewczej, o ile pozwala ona na czyste i równomierne wyciągnięcie kapilar w dwie igły, jednak w celu uzyskania spójnych wyników iniekcji, igły do iniekcji należy przygotować w ciągu 1 tygodnia przed iniekcją embrionów zebrafish.
    1. Umieść kapilarę w wyciągarce, zaciśnij zaciski na obu końcach, a następnie aktywuj element grzejny.
    2. Wyciągnij kapilary, aby utworzyć dwie igły do iniekcji.
    3. Wyjmij kapilary z wyciągarki i przechowuj je w pustej szalce Petri z paskiem plasteliny, która pełni rolę uchwytu na igły.

4. Przygotowanie mRNA transpozazy

  1. Zlinearyzuj plazmid Tol2Kit zawierający transpozazę za pomocą endonukleazy restrykcyjnej NotI, łącząc w probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 mL następujące składniki: 10 µL plazmidu transpozazy (150 ng/µL), 1,5 µL buforu do reakcji endonukleazy restrykcyjnej oraz 0,3 µL endonukleazy NotI.
  2. Uzupełnij objętość reakcji do 20 µL wodą wolną od RNaz, a następnie wymieszaj i inkubuj w celu trawienia w 37 °C przez noc.
  3. Zatrzymaj trawienie transpozazy, dodając do reakcji trawiennej 1 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 µL 5 M NH4OAc oraz 80 µL 100% EtOH, a następnie wymieszaj i schłodź w −20 °C przez noc.
  4. Wiruj roztwór z prędkością 14 000x g przez 20 min w 4 °C, a następnie odessij nadsącz i resuspenduj osad DNA w wodzie wolnej od RNaz.
  5. Wyznacz stężenie liniowego plazmidu w nanogramach na mikrolitr (ng/µL) za pomocą fluorometru, mierząc najpierw 2 µL próbki kontrolnej z wody wolnej od RNaz, a następnie 2 µL zlinearyzowanego plazmidu.
    UWAGA: Stężenia plazmidu zazwyczaj mieszczą się w przedziale 100-200 ng/µL
  6. Przygotuj produkcję mRNA SP6, łącząc w odpowiedniej kolejności następujące składniki w probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 mL: 10 µL 2x NTP/CAP, 2 µL 10x buforu do reakcji, 0,1-1 µg liniowej matrycy DNA oraz 2 µL mieszaniny enzymów SP6.
  7. Uzupełnij objętość reakcji do 20 µL wodą wolną od RNaz, a następnie wymieszaj i inkubuj w 37 °C przez 2 h.
  8. Po 2 h inkubacji dodaj 1 µL DNazy, dokładnie wymieszaj i inkubuj przez kolejne 15 min w 37 °C.
  9. Aby zatrzymać reakcję SP6, dodaj do probówki z reakcją 30 µL roztworu do precypitacji LiCl, a następnie wymieszaj i schłodź w −20 °C przez noc.
  10. Wiruj roztwór z prędkością 14 000 x g przez 20 min w 4 °C, aby uzyskać osad mRNA, a następnie odessij nadsącz i przemyj osad mRNA 1 mL 80% EtOH (rozcieńczonego wodą wolną od RNaz).
  11. Wiruj roztwór z prędkością 14 000 x g przez 20 min w 4 °C, aby uzyskać osad mRNA, a następnie odessij nadsącz. Pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu.
  12. Resuspenduj osad mRNA w 20 µL wody wolnej od RNaz, wyznacz stężenie mRNA w nanogramach na mikrolitr (ng/µL) za pomocą fluorometru zgodnie z opisem w kroku 4.5 (powinno wynosić co najmniej 100 ng/µL), rozdziel mRNA w ilości 100 ng na probówkę do jednorazowego użycia i przechowuj w −80 °C.
    ​UWAGA: Aby upewnić się, że mRNA nie uległo degradacji, można szybko przeprowadzić elektroforezę 2 µL mRNA na żelu do DNA, aby potwierdzić obecność pojedynczego prążka przy 1 950 bps.

5. Klonowanie Multisite Gateway w celu stworzenia wektorów wejściowych do transgenezy

UWAGA: Protokół ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Kwan i wsp.10, przy czym reakcja LR została zapisana jako reakcja pół-LR z całkowitą objętością 5 µL. W celu wygenerowania nowych elementów wpisu należy zastosować reakcje BP z wykorzystaniem wektorów donorowych 5', środkowego oraz 3'10,13.

  1. Aby przeprowadzić reakcję, należy odmierzyć po 10 fmol p5E, pME i p3E oraz 20 fmol wektora docelowego (pDest).
    UWAGA: Wielomiejscowa rekombinacja LR wykorzystuje cztery różne wektory plazmidowe: wektor wejściowy 5' (p5E), wektor wejściowy środkowy (pME), wektor wejściowy 3' (p3E) oraz wektor docelowy (pDest), w celu wygenerowania unikalnego konstruktu transgenicznego flankowanego powtórzeniami Tol2, gotowego do wstrzyknięcia do embrionów danio pręgowanego.
    1. Określ wielkość wszystkich czterech wektorów w parach zasad na podstawie plazmidu źródłowego (Tabela 1strona wiki Tol2Kit14 lub Addgene11; zobacz Tabela materiałów).
      UWAGA: W przypadku nowych wektorów należy przeprowadzić pełne sekwencjonowanie plazmidu poprzez komercyjne firmy sekwencjonujące mogą podać dokładną wielkość plazmidu w parach zasad (bp).
    2. Wyznacz stężenie wszystkich czterech wektorów w nanogramach na mikrolitr (ng/µl)µL) przy użyciu fluorometru, zgodnie z opisem w kroku 4.5.
    3. Przyjmując masę DNA wynoszącą 660 g/mol oraz rozmiar plazmidu (w pz), należy obliczyć całkowitą liczbę nanogramów (ng) plazmidu potrzebnych do uzyskania 10 fmol (wektory wejściowe) lub 20 fmol (wektor docelowy).
      Wzór obliczeniowy dla wektora, \(Rozmiar wektora [bps] \times 10\: fmol\), do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych.
      UWAGA: Laboratorium Mosimanna na University of Colorado, Anschutz Medical Campus, udostępniło bezpłatną arkusz kalkulacyjny do obliczania potrzebnej ilości plazmidu (w ng) oraz objętości (w µL) wektorów niezbędnych w reakcji LR15.
  2. Aby wytworzyć opisowany poniżej konstrukt, sox17:EGFPCAAX, należy użyć następujących wektorów: wektora p5E zawierającego zebrafish sox17 promotor o wielkości 6 918 bp16; wektor pME zawierający prenylowane EGFP o rozmiarze 3345 bp10; wektor p3E zawierający sekwencję sygnału późnego poliadenylacji SV40 o wielkości 2838 bp10oraz pDest o rozmiarze 5 883 bp10.
  3. Wykorzystując stężenie plazmidu określone w kroku 5.1.2 oraz ilość w nanogramach (ng) dla każdego wektora (krok 5.1.3), oblicz całkowitą liczbę mikrolitrów (µL) każdego plazmidu niezbędnego do uzyskania 10 fmol (wektory wejściowe) lub 20 fmol (wektor docelowy), a następnie podzielić tę wartość przez dwa w celu zastosowania w 5 µL reakcje half-LR (wszystkie wartości wymienione poniżej są podane w Tabela 2).
    Wzór na obliczenie ilości wektora do reakcji ligacji (LR); równanie na stężenie objętościowe wektora w μL.
    1. Aby otrzymać 10 fmol p5E-sox17, należy użyć 45,66 ng (przy stężeniu 140,3 ng/µL) i rozcieńczyć w wodzie sterylnej czterokrotnie, aby uzyskać 0.65 µL.
    2. Aby uzyskać 10 fmol pME-EGFPCAAX, należy użyć 22,08 ng (przy stężeniu 213,5 ng/µL) i rozcieńczyć w wodzie sterylnej 10-krotnie, aby otrzymać 0.52 µL.
    3. Aby otrzymać 10 fmol p3E-poly A, należy użyć 15,73 ng (przy stężeniu 276,1 ng/µL) i rozcieńczyć w sterylnej wodzie 20-krotnie, aby otrzymać 0.57 µL.
    4. Dla 20 fmol wektora docelowego należy użyć 77,66 ng pDest (przy stężeniu 307,3 ng/µL) i rozcieńczyć w wodzie sterylnej 5-krotnie, aby otrzymać 1.63 µL.
  4. Aby przygotować 5 µL reakcja half-LR, połączyć objętości p5E, pME, p3E i pDest określone w kroku 5.3 w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml, a następnie dodać sterylną wodę do uzyskania całkowitej objętości reakcji wynoszącej 4 µL.
  5. Mieszaninę enzymów LR należy energicznie wymieszać w wirówce typu vortex dwa razy przez 1 minutę każdorazowo, aby zapewnić właściwe wymieszanie, a następnie dodać 1 µL do reakcji i wymieszać dokładnie.
  6. Inkubować w temperaturze 25 °C na noc (16+ h).
  7. Zatrzymać reakcję LR poprzez dodanie 0.5 µL proteinazy K (2 µg/µL), inkubować w 37 °C przez 10 min, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.
  8. Przekształć 3-4 µL plazmidu do rozmrożonych, chemicznie kompetentnych komórek poprzez dodanie plazmidu i inkubację komórek w lodzie przez 25–30 min.
  9. Podczas gdy komórki znajdują się w lodzie, ogrzej dwie płytki z agarem LB z ampicyliną do temperatury pokojowej.
  10. Poddaj komórki szokowi termicznemu w 42°C w kąpieli wodnej przez dokładnie 30 s.
  11. Po szoku termicznym należy dodać 250 µL pożywek płynnych, bogatych i wolnych od antybiotyków do komórek, a następnie inkubować z wytrząsaniem w 37 °C przez 1,5 h.
  12. Rozprzestrzenianie 300 µL bakterii na jednej płytce z ampicyliną, a następnie inkubować w 37°C przez noc.
  13. Następnego dnia rano należy przesiewać kolonie pod kątem obecności dwóch fenotypów: przeźroczystego i nieprzezroczystego, a następnie wyselekcjonować kolonie przeźroczyste (zgodnie z opisem w Kwan et al.10) po kolei zaszczepić hodowlę płynną, a następnie inkubować z wytrząsaniem przy 37 °C przez noc.
    UWAGA: Przezroczyste kolonie niemal zawsze zawierają prawidłową kolonię LR (>w 85% przypadków).
  14. Korzystając z komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta, należy przeprowadzić izolację plazmidów z każdej z kultur w cieczy, a następnie wykonać trawienie diagnostyczne każdego plazmidu w celu potwierdzenia odpowiedniej wielkości konstruktu transgenicznego, co świadczy o prawidłowym przebiegu reakcji LR gateway.
  15. Ponownie transformuj prawidłowe konstrukty transgeniczne, stosując standardowy protokół transformacji bakteryjnej opisany w krokach 5.4-5.12, wykorzystując 0,5-1 µL plazmidu i inkubować wyłącznie w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  16. Ponownie wysej kolonie i potwierdź, że każda z nich zawiera transgeniczny konstrukt LR, zgodnie z etapem 5.14.
  17. Wyznaczyć stężenie plazmidu zgodnie z opisem w kroku 4.5 (co najmniej 150 ng/µL jest wymagane do iniekcji zarodków).

6. Iniekcja transgenu do embrionów

  1. Odmrozić na lodzie jednorazową próbkę mRNA transpozazy oraz transgeniczny konstrukt Tol2 i ogrzać płytkę do iniekcji z agarozy do temperatury pokojowej.
  2. Połączyć na lodzie następujące składniki: 150 ng plazmidu, 100 ng mRNA transpozazy oraz 2% czerwieni fenolowej (0,3 µL). Następnie dodać wodę wolną od RNA, aby uzupełnić objętość do 3 µL.
  3. Przenieść embriony w stadium jednej komórki za pomocą pipet transferowych na płytkę do iniekcji (opisaną w kroku 2) wypełnioną EM całkowicie pokrywającym agar, a następnie delikatnie ułożyć około 50–75 embrionów w każdym gnieździe płytki do iniekcji.
  4. Nanieść mieszaninę mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej na otwarty koniec kapilarnej igły do iniekcji, umieścić igłę kapilarną w uchwycie urządzenia do iniekcji i włączyć urządzenie.
    UWAGA: Urządzenie do iniekcji wykorzystuje sprężony gaz, np. powietrze, aby po aktywacji wprowadzić pulsacyjnie żądaną objętość (opisaną w kroku 6.5) mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej do embrionu.
  5. Opuścić igłę kapilarną do EM na płytce do iniekcji i odłamać końcówkę za pomocą pęsety, aby urządzenie do iniekcji wypompowało jedynie niewielką ilość mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej.
  6. Wstrzyknąć do ciała komórkowego embrionu mały bolus 3 nL mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej.
    UWAGA: Bolus 3 nL to objętość mieszaniny mRNA/plazmidu/czerwieni fenolowej, przy której siedem bolusów mogłoby teoretycznie zmieścić się równomiernie wzdłuż linii środkowej embrionu.
  7. Po zakończeniu iniekcji embrionów usunąć je z płytki do iniekcji, delikatnie wypychając je z gniazd, i przenieść za pomocą pipet transferowych do 100 mm szalki Petriego ze świeżym EM (około 40 mL), a następnie inkubować w temperaturze 28,5 °C, aby umożliwić rozwój embrionów.

7. Przesiewowe badanie zarodków w celu wykrycia insercji transgenicznej

  1. W przypadku ekspresji białek fluorescencyjnych należy wybrać odpowiedni stopień rozwoju, w którym transgen fluorescencyjny powinien ulec ekspresji, a następnie sprawdzić obecność fluorescencji pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.
    UWAGA: Zarodki te będą wykazywać mozaikową ekspresję oraz genomiczną insercję konstruktu transgenicznego.
  2. W celu identyfikacji transgenów niefluorescencyjnych należy przeprowadzić przesiew w kierunku fluorescencyjnego markera transgenicznego (zgodnie z opisem w kroku 7.1), takiego jak GFP sterowany promotorem specyficznym dla serca genu cmlc2 lub mCherry sterowany promotorem specyficznym dla soczewki αcyrstallin, które znajdują się w osobnych wektorach docelowych.
  3. Należy pozwolić zarodkom wykazującym pozytywną insercję transgeniczną na pełny rozwój do stadium dorosłych ryb danio pręgowanych.
  4. Po osiągnięciu przez potencjalne ryby transgeniczne wieku rozrodczego należy poddać je indywidualnej weryfikacji pod kątem transmisji w linii zarodkowej oraz ekspresywności transgenu poprzez krzyżowanie ich z rybami danio pręgowanymi typu dzikiego.
  5. Osobniki dorosłe, których zarodki rozwijają się prawidłowo i wykazują najsilniejszą oraz najbardziej odpowiednią ekspresję transgenu, są zachowywane jako unikalne linie transgeniczne danio pręgowanych do dalszych prac i analiz.
    UWAGA: Jako alternatywną metodę weryfikacji genomicznej insercji konstruktów transgenicznych można zaprojektować primery do PCR, które amplifikują wyłącznie konstrukt transgeniczny, a nie DNA typu dzikiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do generowania konstruktów transgenicznych wykorzystano system transgenezy Tol2. W celu stworzenia konstruktu transgenicznego użyto trzech wektorów wejściowych: p5E, zawierającego elementy promotora/enhancera genu, pME, zawierającego gen podlegający ekspresji pod wpływem elementów promotora/enhancera oraz p3E, który w minimalnej konfiguracji zawiera ogon polyA. poprzez wielomiejscowa klonowanie Gateway LR. Wektor docelowy, pDest, dostarcza powtórzeń Tol2 niezbędnych do insercji genomowej konstruktu transgeniczne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Danio pręgowany idealnie nadaje się do badania wpływu ekspozycji na etanol na rozwój i stany chorobowe 7,8. Danio pręgowany wytwarza dużą liczbę półprzezroczystych, zewnętrznie zapłodnionych, genetycznie podatnych na rozciąganie zarodków, co pozwala na obrazowanie na żywo kilku tkanek i typów komórek znakowanych transgenami jednocześnie w wielu kontekstach środowiskowych19,20. Te mocne strony, w połączeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania przedstawione w tym artykule były wspierane przez grant z National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 dla C.B.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Skrzynka narzędziowa Addgene Tol2https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
PowietrzeDostarczane bezpośrednio przez uniwersytet Waga analityczna
AmpicillinFisher ScientificBP1760
VWR10204-962
Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID KapilaraFHC30-30-0
Chlorek wapniaVWR97062-590
ChloramfenikolBioVision2486
EDTAFisher ScientificBP118-500
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjnyOlympusSZX16
KanamycynaFisher ScientificBP906
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyOlympusFluoview FV1000
Lawson Lab Przygotowanie plazmiduhttps://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB AgarFisher ScientificBP9724
LB BulionFisher ScientificBP1426
Nisko-EEO / wielofunkcyjny / biologia molekularna Klasa AgarozaFisher ScientificBP160-500
LR Clonase II Plus EnzymeFisher Scientific12538200
Siarczan magnezu (heptahydrat)Fisher ScientificM63-500
Uchwyt na mikropipetyZastosowane oprzyrządowanie naukoweMIMPH-M-
0,5 ml VWR10025-724
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml VWR10025-716
MikromanipulatorStosowane oprzyrządowanie naukoweMM33
Końcówki do mikropipet 10 μ L Fisher Scientific13611106
Końcówki do mikropipet 1000 μ L Fisher Scientific13611127
Końcówki do mikropipet 200 μ L Fisher Scientific13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiFisher ScientificAM1340
Mosimann Lab Tol2 Arkusz obliczeniowyhttps://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
SpektrofotometrNanoDropND-1000
NcoINEBR0189S
NotINEBR0189S
szalki Petriego 100 mm Fisher ScientificFB012924
Fenol Czerwona sól sodowaSigma AldrichP4758-5G
Pipetman L p1000L MikropipetaGilsonFA10006M
Pipetman L p200L MikropipetaGilsonFA10005M
Pipetman L p2L MikropipetaGilsonFA10001M
Chlorek potasuFisher ScientificP217-500
Fosforan potasu (dwuzasadowy)VWRBDH9266-500G
Wtryskiwacz ciśnieniowyZastosowane oprzyrządowanie naukoweMPPI-3
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Wodorowęglan soduVWRBDH9280-500G
Chlorek soduFisher ScientificS271-500
Fosforan sodu (dwuzasadowy)Fisher ScientificS374-500
Stericup .22 µ M System filtracji próżniowej Strona Wiki MilliporeSCGPU11RE
Tol2http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemicznie kompetentni E. coliFisher ScientificC404010
Pionowy ściągacz do pipetDavid Kopf Instruments720
Forma do mikroiniekcji danio pręgowanegoAdaptacyjne narzędzia naukowei34
dawcy Probówka do mikrowirówek

Bibliografia

  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460(2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
  14. The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
  15. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  16. Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  17. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  18. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  19. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).
  20. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  22. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  23. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  24. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  25. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transgeneza Tol2model rybki zebrafishklonowanie Gatewaytransgeniczne rybki zebrafishwstrzykiwanie do embrionówpłodowe spektrum alkoholowemRNA transpozazytransmisja w linii zarodkowejmarker fluorescencyjnyekspozycja na etanol
System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.