Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64686

⸱

10 lutego 2023

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2Department of Nutritional Sciences, The University of Texas at Austin

W tym artykule

Podsumowanie

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Streszczenie

Pojawienie się technologii ukierunkowanych nukleaz CRISPR-Cas zrewolucjonizowało możliwość precyzyjnej edycji genomu zarówno w istniejących, jak i powstających systemach modelowych. Systemy edycji genomu CRISPR-Cas wykorzystują syntetyczny przewodnik RNA (sgRNA) do kierowania endonukleazy związanej z CRISPR (Cas) do określonych loci genomowego DNA, gdzie endonukleaza Cas generuje pęknięcie podwójnej nici. Naprawa pęknięć dwuniciowych przez wewnętrzne mechanizmy podatne na błędy prowadzi do insercji i/lub delecji, zakłócając locus. Alternatywnie, włączenie do tego procesu dwuniciowych donorów DNA lub jednoniciowych oligonukleotydów DNA może wywołać włączenie precyzyjnych edycji genomu, od polimorfizmów pojedynczego nukleotydu po małe znaczniki immunologiczne, a nawet duże fluorescencyjne konstrukty białkowe. Jednak głównym wąskim gardłem w tej procedurze może być znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji w linii zarodkowej. Protokół ten przedstawia solidną metodę badań przesiewowych i izolacji mutacji germinalnych w określonych loci u Danio rerio (danio pręgowanego); Zasady te można jednak zastosować w każdym modelu, w którym możliwe jest pobieranie plemników in vivo.

Wprowadzenie

System CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas to potężne narzędzie do przeprowadzania mutagenezy specyficznej dla loci i precyzyjnej edycji genomu w systemie modelu danio rerio (danio pręgowanego)1,2,3,4. Cas-rybonukleoproteina (RNP) składa się z dwóch głównych składników: endonukleazy Cas (zwykle Cas9 lub Cas12a) i specyficznego dla locus syntetycznego przewodnika RNA (sgRNA)5. Razem Cas-RNP generuje dwuniciową przerwę (DSB) w pożądanym locus, która może zostać naprawiona przez jeden z dwóch wewnętrznych mechanizmów naprawy. Mechanizm naprawy niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) jest podatny na błędy i często powoduje różne insercje lub delecje (indele) wokół DSB. Te indele mogą być szkodliwe, jeśli wprowadzą mutację przesunięcia ramki odczytu lub przedwczesne zatrzymanie w wynikowej sekwencji białka. Alternatywnie, mechanizm naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR) wykorzystuje szablon dawcy z regionami homologii otaczającymi miejsce DSB do naprawy uszkodzenia. Naukowcy mogą wykorzystać system HDR do generowania precyzyjnych zmian genomowych. W szczególności mogą wspólnie wstrzykiwać dwuniciowy konstrukt dawcy DNA, który zawiera pożądane edycje, a także regiony homologii otaczające miejsce DSB w genomie. Zwiększona ekonomia skali dla tych komercyjnie produkowanych komponentów CRISPR znacznie zmniejszyła bariery w badaniach przesiewowych wielu loci i w podejmowaniu działań na większą skalę w celu precyzyjnej edycji genomu. Jednak w modelach zwierzęcych rozmnażających się płciowo głównym wąskim gardłem jest identyfikacja i izolacja zmutowanych zwierząt stabilnych w linii zarodkowej.

System modeli grybowanego wykazuje kilka kluczowych cech, które zwiększają jego zastosowanie w odwrotnych badaniach genetycznych. Są łatwe do wyhodowania w dużych ilościach dzięki podstawowemu wyposażeniu do trzymania w pomieszczeniach wodnych, a samice wykazują wysoką płodność przez cały rok6. Co więcej, ich zewnętrzne składanie jaj i zapłodnienie sprawia, że są podatne na mikroiniekcję składników CRISPR/Cas. Cas-RNP jest powszechnie wstrzykiwany do jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego w celu wytworzenia DSB / naprawy, która teoretycznie jest dziedziczona przez wszystkie komórki potomne. Jednak genomy diploidalne wymagają dwóch zdarzeń DSB/naprawy, aby zmutować oba chromosomy homologiczne. Ponadto, chociaż Cas-RNP jest wstrzykiwany w fazie jednokomórkowej, DSB/naprawa może nastąpić dopiero na późniejszych etapach rozwoju. Razem czynniki te przyczyniają się do mozaikowego charakteru ryb wstrzykiwanych F0. Powszechną praktyką jest krzyżowanie ryb, którym wstrzyknięto F0 i badanie przesiewowe potomstwa F1 pod kątem indeli/specyficznych edycji. Ponieważ jednak nie wszystkie ryby, którym wstrzyknięto F0, mają mutacje linii zarodkowej, praktyka ta powoduje wiele bezproduktywnych krzyżówek, które nie generują pożądanej edycji. Badania przesiewowe linii zarodkowej F0, a nie tkanki somatycznej F1, zwiększają prawdopodobieństwo wyizolowania pożądanej edycji linii zarodkowej i zmniejszają liczbę zwierząt potrzebnych w tym procesie.

Plemniki można łatwo pobrać od zebrywanego, któremu wstrzyknięto F0, bez potrzeby eutanazji. Ta funkcja pozwala na kriokonserwację i rederywację zamrożonych zapasów nasienia7, ale może być również wykorzystana do szybkiego badania, identyfikacji i izolacji nosicieli linii zarodkowej pożądanych mutacji genomowych8,9. Brocal i in. (2016) wcześniej opisali opartą na sekwencjonowaniu metodę przesiewową edycji linii zarodkowej u samców danio pręgowanego, którym wstrzyknięto F010. Chociaż jest to przydatne do identyfikacji zmutowanych alleli obecnych w linii zarodkowej, podejście to może stać się kosztowne przy dużej przepustowości i może nie być dostępne dla wszystkich laboratoriów. W przeciwieństwie do tego, obecny protokół oferuje przystępną i opłacalną strategię opartą na elektroforezie do identyfikacji zmian w linii zarodkowej. W szczególności protokół ten przedstawia solidną metodę badań przesiewowych i izolacji mutacji germinalnych w określonych loci przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym o wysokiej rozdzielczości. Ponadto protokół ten opisuje podobną strategię identyfikacji udanej integracji konstruktu dawcy zawierającego określone zmiany. Jak zawsze, jeśli pożądane są określone edycje, strategie oparte na sekwencjonowaniu mogą być wykonywane w połączeniu z protokołem opisanym poniżej. Chociaż protokół ten jest specyficzny dla systemu modelowego danio pręgowanego, zasady te powinny być możliwe do zaadaptowania do każdego modelu, w którym pobieranie nasienia jest rutynową procedurą. Łącznie strategie te pozwolą na identyfikację samców, którym wstrzyknięto F0, z indelami/edycjami linii zarodkowej, które można rozwiązać na żelu po standardowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i/lub trawieniu restrykcyjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego w Austin (AUP-2021-00254).

1. Projektowanie sgRNA dla mutagenezy CRISPR

  1. Uzyskaj sekwencję eksonów zawierającą docelowe loci.
  2. Zaprojektuj syntetyczny przewodnik RNA (sgRNA) z miejscem sąsiadującego z motywem protospacerowym (PAM), które jest specyficzne dla endonukleazy Cas.
    1. W przypadku jednoczesnego wstrzykiwania konstruktu dawcy należy zaprojektować sgRNA tak, aby przewidywane miejsce cięcia było jak najbardziej zbliżone do pożądanych zmian.
      UWAGA: APE jest darmowym oprogramowaniem z narzędziem do wyszukiwania stron sgRNA Cas911. Alternatywnie można użyć narzędzi takich jak CHOPCHOP, który oferuje interfejs online do projektowania sgRNA, który uwzględnia różne miejsca PAM Cas9 i innych endonukleaz Cas12.
  3. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu, aby wzmocnić obszar otaczający zaprojektowane miejsce cięcia CRISPR/Cas. Produkt PCR powinien mieć około 200-400 par zasad (bp) długości, aby móc rozpuścić małe indele na żelu w dalszej części protokołu.
    UWAGA: CHOPCHOP11 automatycznie projektuje startery dla każdego sgRNA, które wyprowadza.
  4. Opcjonalnie: Zaprojektuj konstrukt dawcy DNA z żądanymi zmianami.
    1. Uzyskaj sekwencję genomową eksonu zawierającego loci pożądanej mutacji.
      UWAGA: Sekwencje intronowe mogą się różnić u poszczególnych osób, dlatego najlepiej jest unikać włączania sekwencji intronowych do konstruktu dawcy, ponieważ może to zakłócać zależny od homologii szlak naprawy.
    2. Jeśli pożądana jest określona zmiana aminokwasu, należy odpowiednio zmienić określony kodon.
      UWAGA: Dokonując tych zmian, należy pamiętać o częstotliwości kodonu. Jeśli to możliwe, wybierz kodon o dużym użyciu.
    3. Aby zapobiec trawieniu CRISPR/Cas konstruktu dawcy, należy dokonać dodatkowych mutacji synonimicznych, które (i) zakłócają PAM i/lub (ii) zakłócają sekwencję sgRNA, przy czym preferowane jest dokonywanie zmian niesynonimicznych bliżej miejsca PAM.
    4. Użyj wyszukiwarki miejsc ograniczeń (APE11 również ma tę funkcję), aby znaleźć unikalne miejsca ograniczeń (te, które występują tylko raz) w przewidywanym produkcie PCR sekwencji typu dzikiego.
      1. Powtórz ten proces dla przewidywanego produktu PCR, który odzwierciedla pomyślną integrację konstruktu dawcy.
      2. Porównaj listę miejsc restrykcji między sekwencjami typu dzikiego i zintegrowanymi z dawcą, aby znaleźć miejsce ograniczenia, które jest obecne tylko w edytowanej sekwencji.
      3. Jeśli nie zostanie znalezione żadne unikalne miejsce ograniczenia, kontynuuj wprowadzanie synonimicznych zmian w konstrukcji dawcy, aż zostanie to osiągnięte.
        UWAGA: Jeśli to możliwe, kontynuuj tworzenie synonimicznych mutacji, które zakłóciłyby wiązanie sgRNA z konstruktem dawcy.
    5. Przytnij sekwencję dawcy do możliwego do opanowania rozmiaru (50-100 pz) z co najmniej 20 pz homologii otaczającej przewidywane miejsce cięcia CRISPR/Cas i edytuj, jeśli to możliwe.
  5. Uzyskać zaprojektowane oligonukleotydy donorowe sgRNA i/lub DNA, a także wszelkie startery wymagane do genotypowania.
    UWAGA: Aby zapobiec trawieniu oligonukleotydów donorowych DNA przez nukleazy, zaleca się modyfikację pierwszych trzech wiązań fosforanowych na końcach 5' i 3' oligonukleotydów DNA za pomocą fosforotionianu.
  6. Wstrzyknąć 1 nl mieszanki iniekcyjnej do zarodków w stadium jednokomórkowym. Zazwyczaj standardowa mieszanka iniekcyjna zawiera następujące składniki:
    1 μl sgRNA
    sgRNAbr swoistego dla locus 25 μM 1 μl 25 μM endonukleazy Cas9
    Opcjonalnie: 1 μL konstruktu dawcy DNA 3 μM
    1. Zwiększ całkowitą objętość do 5 μl za pomocą 0,1 M KCl wolnego od RNaz.
  7. Pozwól osobom, którym wstrzyknięto F0, rozwinąć się w dojrzałych płciowo dorosłych. Pozostały protokół koncentruje się na badaniach przesiewowych samców, którym wstrzyknięto F0, pod kątem edycji linii zarodkowej.

2. Ustawianie zbiorników hodowlanych

  1. Przygotuj samce F0 do krycia, zakładając zbiorniki hodowlane z przegrodami między samcami i samicami F0.
    1. Aby zminimalizować liczbę wymaganych zbiorników hodowlanych, ustaw trzy samce naprzeciwko dwóch samic w każdym zbiorniku.
      1. Ustaw tylu samców F0, ilu można skutecznie przebadać i umieścić jako osobniki po pobraniu nasienia. Genotyp samic nie jest ważny, ponieważ ich gamety nie zostaną zebrane podczas tej procedury.
    2. Ustaw jeden zbiornik hodowlany samców typu dzikiego naprzeciwko samic. Nasienie typu dzikiego posłuży jako kontrola do interpretacji wyników w dalszej części procedury.
  2. Przygotowane zbiorniki hodowlane inkubować przez noc.

3. Przygotowanie materiałów do procedury pobrania nasienia

  1. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu znieczulającego (0,016% tricaine-HCl w wodzie dla ryb), aby napełnić małą szklaną miskę.
  2. Dozować 40 μl 50 mM NaOH do probówek PCR o pojemności 0,2 ml. Przygotuj jedną probówkę dla każdej próbki nasienia, która zostanie pobrana. Przechowywać na lodzie.
  3. Przygotuj indywidualne zbiorniki o pojemności 0,8 l dla każdej ryby, od której będą pobierane próbki podczas zabiegu. Zbiorniki te będą przechowywać ryby, od których pobrano próbki, do czasu zakończenia genotypowania.
    UWAGA: Jest to główny czynnik, który ogranicza liczbę ryb, które mogą być skutecznie przebadane w tym protokole. Należy zapewnić odpowiednią przestrzeń do pomieszczenia osób, od których pobrano próbki, do czasu zakończenia genotypowania.
  4. Zwilż gąbkę o wymiarach 1 cal x 1 cal (przeciętą płytkim, owalnym wgłębieniem, aby przytrzymać samca danio pręgowanego brzuszną stroną do góry podczas zabiegu) w wodzie dla ryb i wyciśnij nadmiar płynu.
    1. Umieść gąbkę w polu widzenia mikroskopu stereoskopowego przy małym powiększeniu (Rysunek 1A).
    2. Ustaw ukośne oświetlenie górne, aby uzyskać optymalną widoczność.

4. Znieczulenie samców ryb i pobranie nasienia

  1. Przygotuj czystą rurkę kapilarną.
    1. Delikatnie potrząśnij pojemnikiem na probówkę, aby uwolnić pojedynczą rurkę kapilarną.
    2. Umieść rurkę kapilarną w dostarczonej bańce i odłóż ją na bok.
  2. Przenieść samca ryby do przygotowanego roztworu znieczulającego (0,016% tricaine-HCl w wodzie dla ryb).
    1. Delikatnie wymieszaj roztwór łyżką cedzakową, aby przyspieszyć proces znieczulenia.
    2. Gdy ruch wieczka (skrzela) zwolni (około 1-2 minut), przystąp do pobierania nasienia.
  3. Za pomocą łyżki cedzakowej przenieś rybę na czysty stos ręczników papierowych.
    1. Łyżką cedzakową delikatnie zwiń rybę, aby usunąć nadmiar wody.
    2. Delikatnie osusz rybę czystą, złożoną bibułą, aby usunąć pozostałą wodę.
  4. Za pomocą łyżki cedzakowej przenieś rybę do przygotowanego gąbki (Rysunek 1B).
    1. Ustaw rybę brzuszną stroną do góry, tak aby jej głowa znajdowała się najbliżej dominującej ręki osoby wykonującej zabieg.
    2. Delikatnie osusz obszar wokół płetw odbytowych czystą, złożoną bibułą.
  5. Zbierz plemniki.
    1. Używając końca rurki kapilarnej, delikatnie odsuń płetwy brzuszne na boki od linii środkowej, aby odsłonić kloakę (Rysunek 1C).
    2. Umieść koniec rurki kapilarnej w pobliżu kloaki.
    3. Za pomocą kleszczy delikatnie ściśnij boki ryby, zaczynając tuż pod skrzelami i kończąc na kloace (Rysunek 1C').
    4. Zbierz plemniki do rurki kapilarnej za pomocą działania kapilarycznego. Do tej procedury wystarczy około 1 μL (Rysunek 1D).
      UWAGA: Niektóre laboratoria donoszą o używaniu końcówek do pipet p10 zamiast kapilar do pobierania nasienia.
    5. Jeśli plemniki nie zostaną uwolnione pod delikatnym naciskiem, zwróć rybę do wody systemowej.
      1. Monitoruj powrót do zdrowia po znieczuleniu.
      2. Nie ściskaj mocno ryby, aby usunąć plemniki, ponieważ może to zranić rybę.
      3. Odpocznij rybę przez 2 tygodnie przed ponowną próbą pobrania nasienia.
    6. Po zebraniu ryb należy umieścić w czystym zbiorniku izolacyjnym z wodą systemową do indywidualnego trzymania.
      1. Monitoruj ryby pod kątem powrotu do zdrowia po znieczuleniu.
      2. Odpocznij rybę przez 2 tygodnie przed ponowną próbą pobrania nasienia.
    7. Umieścić rurkę kapilarną z pobranymi plemnikami w przygotowanej probówce do PCR (z 40 μL 50 mM NaOH).
    8. Ściśnij gumową bańkę, aby usunąć pobraną próbkę.
    9. Zużytą rurkę kapilarną należy wyrzucić do zatwierdzonego szklanego pojemnika na odpady.
    10. Inkubować próbki na lodzie, aż wszystkie samce zostaną ściśnięte.
  6. Powtórz kroki 4.1-4.5 dla każdego samca.
  7. Oznacz zbiorniki izolacyjne i próbki nasienia w taki sposób, aby końcowe wyniki genotypowania plemników można było prześledzić wstecz do odpowiedniej osoby z domniemanymi mutacjami.
  8. Monitoruj wszystkie osoby i upewnij się, że są w pozycji pionowej i badają swoje zbiorniki przed ponownym umieszczeniem zbiorników w systemie.
  9. Umieść samice używane do zalewania z powrotem w odpowiednich zbiornikach w systemie.
  10. Jeśli którakolwiek ryba nie wyzdrowieje ze znieczulenia po 10 minutach, należy postępować zgodnie z procedurą eutanazji zatwierdzoną przez instytucję związaną z laboratorium.
    1. Przykład: Szybko schłodzić osobę w łaźni lodowej z wodą rybną o temperaturze 2-4 °C.
    2. Uśpione ryby należy umieścić w odpowiednim pojemniku na odpady z tusz zwierzęcych zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez instytucję stowarzyszoną z laboratorium.

5. Ekstrakcja DNA z próbek nasienia

  1. Krótko odkręć wszystkie próbki nasienia w miniwirówce i umieść probówki PCR w termocyklerze.
  2. Zamknij pokrywę termocyklera.
  3. Uruchom następujące ustawienia w termocyklerze:
    1. Podgrzewać próbki przez 40 minut w temperaturze 95 °C.
    2. Schłodzić próbki do temperatury 25 °C.
  4. Usunąć próbki z termocyklera.
  5. Za pomocą czystej końcówki pipety do każdej próbki zneutralizuj pH, dodając 10 μl 1 M Tris-HCl (buforowanego do pH 8).
  6. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
  7. Krótko odwirować próbki w miniwirówce.
  8. Próbki genomowego DNA można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C lub umieszczać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.

6. Amplifikacja PCR (i/lub trawienie restrykcyjne) pożądanego locus

  1. Amplifikuj żądane locus za pomocą standardowego protokołu PCR.
    1. Podgrzej termocykler do początkowej temperatury denaturacji w poniższej reakcji PCR.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 25 μl dla każdej próbki nasienia w probówkach PCR:
      12,5 μL 2x Taq Polymerase Master Mix
      1,5 μl 10 μM startera do przodu
      1,5 μl 10 μM startera odwrotnego
      4,5 μl wody wolnej od nukleaz
      5 μl zneutralizowanej próbki DNA plemnika
    3. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
    4. Krótko odwirować próbki w miniwirówce.
    5. Umieścić próbki we wstępnie podgrzanym termocyklerze z następującymi ustawieniami:
      Początkowa denaturacja: 95 °C przez 3 min
      35 cykli denaturacji (95 °C przez 30 s), wyżarzania (55 °C przez 30 s) i przedłużania (72 °C przez 30 s)
      Końcowe przedłużenie: 72 °C przez 5 min
      UWAGA: Może być konieczne dostosowanie temperatury i/lub czasu przedłużania w zależności od konkretnej polimerazy Taq i oczekiwanej długości produktu amplifikacji PCR.
    6. Usuń próbki PCR z termocyklera.
  2. Opcjonalnie: Przeprowadzić trawienie restrykcyjne specyficzne dla dawcy na małej objętości produktu PCR, pozostawiając co najmniej 5-10 μl niestrawionego produktu PCR do elektroforezy żelowej.
    1. Przygotować 30 μl reakcji w 0,2 ml probówkach PCR:
      10 μl nieoczyszczonego produktu PCR
      15 μL wody wolnej od nukleaz
      3 μl 10-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego
      2 μl enzymu restrykcyjnego (BstNI jest używany w reprezentatywnych wynikach do analizy allelu knock-in dnah10)
      UWAGA: Wiele enzymów restrykcyjnych jest nadal aktywnych w typowym buforze reakcyjnym PCR; Jednak dodanie buforu Restriction Digest może pomóc w poprawie wyników. Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać informacje na temat rozwiązywania problemów, jeśli wystąpią jakiekolwiek problemy.
    2. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
    3. Krótko odwirować próbki w miniwirówce.
    4. Umieść próbki w termocyklerze z następującymi ustawieniami:
      1. Pokrój amplikon PCR w temperaturze 60 °C na 1 h.
        UWAGA: Może być konieczne dostosowanie temperatury cięcia i czasu inkubacji do konkretnego stosowanego enzymu restrykcyjnego.
      2. Dezaktywować enzym restrykcyjny w wymaganej temperaturze i czasie inkubacji, jeśli jest to wskazane przez producenta.
        UWAGA: Enzym BstNI nie wymaga inaktywacji termicznej.

7. Wykonywanie elektroforezy żelowej w celu oddzielenia amplikonów PCR o różnych rozmiarach

  1. Przygotuj 500 ml 0,5 x buforu do biegania TBE: dodaj 50 ml 10 x koncentratu buforowego TBE do 450 ml wody dejonizowanej.
  2. Przygotuj 100 ml 4% żelu agarozowego w 0,5x buforze do biegania TBE: dodaj 4 g agarozy z 10 μl 10 000x barwnika żelowego do 100 ml 0,5x buforu TBE. Kuchenka mikrofalowa, aż proszek agarozy całkowicie się rozpuści.
    1. Wlej roztwór żelu do odpowiedniej wielkości ramy do odlewania żelu i włóż grzebień po jednej stronie żelu.
      UWAGA: Większy rozmiar żelu (zalecany: 15 cm x 15 cm) jest korzystny dla tej procedury, ponieważ zapewnia amplikonom więcej miejsca do rozpuszczenia się na żelu.
      1. Jeśli ma być analizowany produkt trawienia restrykcyjnego, najlepiej jest uruchomić go na tym samym żelu, co produkt PCR, aby można było porównać wyniki. W razie potrzeby dostosuj rozmiar dołka grzebieniowego, aby zmieścić wszystkie próbki na żelu.
    2. Pozostaw żel w temperaturze pokojowej do zestalenia. Ostrożnie wyjmij grzebień. Ostrożnie usuń żel z ramy odlewniczej.
  3. Ustaw stanowisko do elektroforezy żelowej.
    1. Umieść żel w urządzeniu do elektroforezy tak, aby studzienki znajdowały się najbliżej elektrody ujemnej. Wlej 0,5x bufor do pracy TBE do urządzenia do elektroforezy, aż studzienki zostaną całkowicie zanurzone.
  4. Załaduj żel.
    1. Załaduj 5 μl drabinki DNA do pierwszej studzienki (wybierz drabinkę DNA, która zawiera fragmenty DNA o wielkości podobnej do amplikonu PCR).
    2. Używając nowej końcówki pipety do każdej próbki (w tym próbki kontrolnej typu dzikiego), załaduj 5-10 μl produktu PCR do pozostałych studzienek.
    3. Opcjonalnie: Jeśli ma być analizowany produkt trawienia restrykcyjnego, próbki te również należy załadować do żelu.
      UWAGA: Najlepiej jest załadować równe ilości DNA między PCR a produkt trawienia restrykcyjnego. Na przykład w 30 μl mieszaniny reakcyjnej z reakcją trawienia restrykcyjnego dodano 10 μl produktu PCR. W związku z tym stężenie DNA w 15 μl produktu trawienia było porównywalne z 5 μl nieoczyszczonego produktu PCR.
  5. Uruchom żel.
    1. Podłącz elektrody do urządzenia do elektroforezy żelowej i przyłóż 150 V przez co najmniej 1 godzinę, aby zapewnić odpowiednią separację amplikonów.
    2. Zobrazuj żel, aby wyświetlić prążki DNA.
      UWAGA: Silnie zmutagizowane loci ukierunkowane na CRISPR będą działać jako wiele rozmiarów prążków reprezentujących kombinację alleli insercji/delecji z amplikonami typu dzikiego.
      1. Jeśli opaski żelowe nie ustąpią po 1 godzinie, należy przyłożyć 150 V do żelu w odstępach 15 minut, aż pasma zostaną wystarczająco oddzielone od siebie na żelu.
      2. Opcjonalnie: W przypadku badań przesiewowych pod kątem wprowadzenia precyzyjnej edycji, takiej jak SNP, znacznik epitopowy lub znacznik fluorescencyjny, należy przebadać DNA plemników metodami PCR, które są specyficzne dla pożądanej edycji. Na przykład, podczas identyfikacji miejsca restrykcji specyficznego dla dawcy, w produkcie trawienia restrykcyjnego będzie obecny dodatkowy prążek w porównaniu z produktem PCR próbki nasienia.

8. Izolowanie stabilnych alleli linii zarodkowej

  1. Po 2 tygodniach odpoczynku od procedury wyciskania nasienia należy skrzyżować osoby F0, których genomowe DNA plemników zawierało pożądane zmiany.
    UWAGA: Wytwarzanie plemników z poszczególnych klonów spermatogonii może być cykliczne u danio pręgowanego; W związku z tym pożądany allel może nie wytwarzać plemników w momencie krzyżowania. Z tego powodu może być konieczne wykonanie dodatkowego krzyżowania więcej niż jeden raz w celu wyizolowania allelu związanego z początkowym badaniem przesiewowym.
  2. Gdy ryby skrzyżowane z F1 osiągną dojrzałość płciową, należy postępować zgodnie ze standardowymi metodami genotypowania (na przykład DNA z klipsem płetwy) przy użyciu tego samego protokołu PCR i elektroforezy żelowej, który jest wykonywany podczas badania przesiewowego genomowego DNA plemników.
    1. Sanger sekwencjonuje produkty PCR, aby zidentyfikować osoby z F1 z tą samą pożądaną edycją.
    2. Opcjonalnie: Jeśli żądana zmiana wprowadza lub zakłóca działanie witryny z ograniczeniami, użyj odpowiedniego protokołu podsumowania ograniczeń.
  3. Heterozygoty F1 w krzyżówce z tą samą pożądaną edycją.
  4. Przebadaj potomstwo F2 pod kątem oczekiwanego fenotypu i/lub zmian genomowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podejścia eksperymentalne opisane w niniejszym protokole umożliwiają szybszą identyfikację edycji genomu lub domniemanych alleli szkodliwych poprzez skupienie się na analizie tysięcy genomów pochodzących z kolekcji plemników samców w pokoleniu F0 po iniekcji. Rysunek 2 przedstawia sposób interpretacji wyników uzyskanych przy zastosowaniu tego protokołu.

W celu wygenerowania mutacji w locus p2ry12 , zarodki ryb zebrafish w stadium jednej komórki wstrzyknię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę szybkiego charakteryzowania przypuszczalnych zmian genomu lub docelowych mutacji przy użyciu technologii CRISPR-Cas poprzez ukierunkowaną analizę genomów męskich plemników F0. Protokół ten powinien być stosowany w innych modelach zwierzęcych, w których plemniki są łatwo dostępne do pobrania bez eutanazji. Ta metoda zwiększy przepustowość przesiewania pod kątem pożądanych zmian i jest szczególnie przydatna do identyfikowania rzadkich zdarzeń knock-in, w których pośredniczy HDR. Podejście to słu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Annie Hindes z Washington University School of Medicine za jej początkowe wysiłki w uzyskaniu dobrej jakości genomowego DNA plemników za pomocą metody hot shot. Praca ta została sfinansowana przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów i Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody (R01AR072009 dla RSG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza w proszku Fisher BioReagentsBP1356-100
Zbiorniki hodowlaneCarolina Biological 
Enzym restrykcyjny BstNINEBR0168S
Endonukleaza Cas9IDT1081060
drabinka DNA, 100 bp Thermo Scientific 
Konstrukcja dawcy DNAH10   Oligo DNA Sigma-Aldrichaw probówce; 0,025 nM, standardowe oczyszczanie odsalane, suche.
Wiązanie fosforopianowe na donorze w pierwszych trzech wiązaniach fosforanowych na obu końcach 5' i 3' (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC
TGCTCATCCGCTGCTGCTGC
GGACCGAGTGTGTGTGTGTC
AGTGATTACGTCACGCC-3')dnah10
Forward Primer Oligo DNA Sigma-Aldrichw probówce; 0,025 nM, standardowe oczyszczanie odsalające, suche (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT
TTGGC-3')
dnah10 starter odwrotny Oligo DNA Sigma-Aldrichw probówce; 0,025 nM, standardowe oczyszczanie odsalające, suche ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA
ATACAGC-3') 
dnah10 syntetyczny sgRNA Synthego Syntetyczne sgRNA, sekwencja docelowa: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Zasilacz
do elektroforezyThermo Scientific 105ECA-115
Kleszcze filtracyjneMilliporeXX6200006P
Ryba (systemowa) wodaOgólnydotyczy
System elektroforezy żelowej (w tym rama odlewnicza, grzebień i komora do elektroforezy) Thermo Scientific Kaseton
 Azure BiosystemsAZI200-01
Bejca żelowa, 10000X InvitrogenS33102
Miska szklana, 250 mL Ogólnezbiorniki izolacyjne nie dotyczy
, 0,8 l AquaneeringZT080
Rurka kapilarna Microcap z bańką, 20 i mikro; L Drummond1-000-0020/CA
MiniwirówkaBio-Rad12011919EDU
Mikropipety, różne z odpowiednimi końcówkamiOgólne nie dotyczy
Kuchenka mikrofalowa Ogólne nie dotyczy
Woda wolna od nukleazPromegaP119-C
Ręczniki papieroweOgólnedo PCR bez dotyczy
, 0,2 mlBioexpressT-3196-1
Łyżka plastikowa, z wywierconymi otworami/szczelinami Ogólnybez n/a
, 0,2 M wolny od RNAzySigma-AldrichP9333
p2ry12 do przodu starter Sigma-Aldrichw probówce; 0,025 nM, standardowe oczyszczanie odsalające, suche (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT
-3')
p2ry12 starter odwrotnySigma-AldrichDNA Oligo w probówce; 0,025 nM, standardowe oczyszczanie odsalające, suche (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT
-3') 
p2ry12 syntetyczny sgRNA Synthego Syntetyczne sgRNA, sekwencja docelowa: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'
Enzym restrykcyjny 10X BuforNEBB6003SVIAL
roztwór NaOH, 50 mM Thermo Scientific S318; 424330010
Gąbka, szlif 1 cal x 1 cal z małym owalnym wgłębieniemOgólny n/a
Mikroskop stereoskopowyZeissStemi 508
Taq główna mieszanka polimerazy, 2XPromegaM7122
TBE Koncentrat buforowy, 10XVWRE442
Thermal CyclerBio-Rad1861096
BibułkaFisher Scientific06-666
Roztwór trikainy i metanosulfonianu (Syncaina, MS-222), 0,016% w wodzie rybnej (pH 7,0± 0,2) Syndel200-266
Tris Base, 1M (buforowany HCl do ph 8,0) PromegaH5131
161937FERSM0241 nie oświetleniowy do obrazowania żelowego B2 probówki roztwór KCl Oligo DNA

Bibliografia

  1. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  2. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  3. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  4. Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
  5. Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
  6. Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
  7. Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
  8. Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
  9. Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
  10. Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259(2016).
  11. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619(2022).
  12. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  13. Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  14. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  15. Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
  16. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).
  17. Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).
  18. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edycja genomu CRISPREdycje linii zarodkowej ryb danio-ostrzeżnikówPrzesiew plemnikówPCR z enzymami restrykcyjnymiElektroforeza w żeluZapłodnienie in vitroSamce nosiciele F0Detekcja indeliTermocyklerSekwencjonowanie DNA
Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.