Method Article

Analiza surowych i przetworzonych próbek kłącza Cyperi przy użyciu chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem

DOI:

10.3791/64691

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono analizę porównawczą surowych i przetworzonych próbek kłącza Cyperi (CR) za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-MS/MS) u szczurów z pierwotnym bolesnym miesiączkowaniem. Zmiany w stężeniach metabolitów i składników próbki we krwi badano między szczurami leczonymi CR i CR przetwarzanymi octem (CRV).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyperi rhizoma (CR) jest szeroko stosowana w ginekologii i jest ogólnym lekiem do leczenia chorób kobiecych w Chinach. Ponieważ działanie przeciwbólowe CR jest wzmocnione po przetworzeniu octem, CR przetworzony z octem (CRV) jest powszechnie stosowany klinicznie. Jednak mechanizm, za pomocą którego działanie przeciwbólowe jest wzmacniane przez przetwarzanie octu, jest niejasny. W tym badaniu zastosowano technikę ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (UPLC-MS/MS) w celu zbadania zmian we krwi poziomów egzogennych składników i metabolitów między szczurami leczonymi CR i CRV z bolesnym miesiączkowaniem. Wyniki ujawniły różne poziomy 15 składników i dwóch metabolitów we krwi tych szczurów. Wśród nich poziomy kwasu (-)-myrtenolu i kwasu [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroksy-1,4,7,7-tetrametylobikucyklo[2.2.1]hept-2-ylo]octowego w grupie CRV były znacznie wyższe niż w grupie CR. CRV obniżał poziom prostanoidów serii 2 i leukotrienów serii 4 o działaniu prozapalnym, agregacji płytek krwi i zwężeniu naczyń krwionośnych oraz zapewniał działanie przeciwbólowe poprzez modulację metabolizmu kwasu arachidonowego i kwasu linolowego oraz biosyntezę nienasyconych kwasów tłuszczowych. Badanie to wykazało, że przetwarzanie octu wzmacnia przeciwbólowe działanie CR i przyczynia się do zrozumienia mechanizmu działania CRV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne bolesne miesiączkowanie (PD) jest najbardziej rozpowszechnionym schorzeniem w ginekologii klinicznej. Charakteryzuje się bólem pleców, obrzękiem, bólem brzucha lub dyskomfortem przed lub w trakcie menstruacji bez patologii miednicy w układzie rozrodczym1. Raport na temat jego rozpowszechnienia wykazał, że 85,7% uczniów cierpi na PD2. Doustne środki antykoncepcyjne w małych dawkach są standardową terapią, ale ich niepożądane skutki uboczne, takie jak zakrzepica żył głębokich, przyciągają coraz większą uwagę3. Częstość występowania zakrzepicy żył głębokich wśród osób stosujących doustne środki antykoncepcyjne wynosi >1 na 1000 kobiet, a ryzyko jest najwyższe w ciągu pierwszych 6-12 miesięcy oraz u użytkowników w wieku powyżej 40 lat4.

Długo używany w tradycyjnej medycynie chińskiej (TCM), Cyperi rhizoma (CR) pochodzi z suszonego kłącza Cyperus rotundus L. z rodziny Cyperaceae. CR reguluje zaburzenia miesiączkowania oraz łagodzi depresję i ból5. CR jest szeroko stosowany w ginekologii i jest uważany za lek ogólny w leczeniu chorób kobiecych6. CR przetwarzany octem (CRV) jest zwykle stosowany klinicznie. W porównaniu z CR, CRV wykazuje zwiększoną regulację miesiączki i łagodzenie bólu. Współczesne badania wykazały, że CR hamuje cyklooksygenazę-2 (COX-2) i późniejszą syntezę prostaglandyn (PGs), osiągając w ten sposób działanie przeciwzapalne. Tymczasem CR wykazuje działanie przeciwbólowe bez skutków ubocznych7, co czyni CR dobrym wyborem dla pacjentek z bolesnym miesiączkowaniem. Jednak mechanizm leżący u podstaw regulacji miesiączki i łagodzenia bólu przez CRV jest niejasny. Badania CR koncentrowały się głównie na zmianach w jego aktywnych składnikach chemicznych i działaniach farmakologicznych, takich jak działanie przeciwzapalne, przeciwdepresyjne i przeciwbólowe8,9,10,11,12.

Chociaż składniki TCM są złożone, są wchłaniane do krwi i muszą osiągnąć określone stężenie we krwi, aby były skuteczne13. Zakres badań przesiewowych składników czynnych TCM można zawęzić, wykorzystując strategię oznaczania składników we krwi. Ślepoty można uniknąć badając składniki chemiczne in vitro, a jednostronności można uniknąć badając poszczególne składniki14. Porównując skład CR i CRV we krwi, można skutecznie i szybko wykryć zmiany w składnikach aktywnych przetwarzanego CR. Skuteczność leku to proces, w którym lek wpływa na organizm. Zmiany w składnikach leku spowodowane odpowiedzią metaboliczną organizmu, które mogą być związane z mechanizmem działania leku, można określić za pomocą metabonomiki. Metabonomika ma na celu zmierzenie ogólnych i dynamicznych odpowiedzi metabolicznych, co jest zgodne z określeniem ogólnej skuteczności tradycyjnej medycyny chińskiej15. Co więcej, metabolity są końcowym produktem ekspresji genów, która jest najściślej związana z fenotypami16. W związku z tym metabonomika może być odpowiednia do badania różnic w szlakach metabolicznych między CR i CRV w leczeniu PD. Nieukierunkowana metabolomika oparta na chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (LC-MS/MS) charakteryzuje się wysoką przepustowością, wysoką czułością i wysoką rozdzielczością i może być stosowana do pomiaru wielu różnych składników małocząsteczkowych17,18. Metoda ta pozwala jednocześnie określić endogenne metabolity i składniki egzogenne wchłaniane do krwi. Metabonomika jest szeroko stosowana w badaniach nad TCM19, toksykologią leków20, zarządzaniem zdrowiem21, sports22, food23 i innymi dziedzinami.

W tym badaniu, różnice w egzogennych składnikach wchłanianych do krwi i endogennych metabolitach zostały zmierzone między szczurami z bolesnym miesiączkowaniem leczonym CR i CRV przy użyciu nieukierunkowanej metabolomiki opartej na LC-MS/MS, aby ujawnić mechanizmy przeciwbólowego działania CRV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Etyki Eksperymentów Instytutu Chongqing TCM. W tym eksperymencie wykorzystano 24 samice szczurów Sprague Dawley (SD), które miały 8-10 tygodni i ważyły 200 g ± 20 g.

1. Przygotowanie ekstrakcji

  1. kalkulacja
    1. Należy zaplanować podawanie ekstraktu CR lub CRV grupie sześciu szczurów Sprague-Dawley (10 g/[kg∙dzień]) przez 3 dni. Użyj ekstraktu CR lub CRV o stężeniu 1 g/ml (1 ml ekstraktu uzyskuje się z 1 g ziół).
      UWAGA: Dawka CR wynosi 6-10 g. W tym badaniu jako dawkę zastosowano maksymalną dawkę 10 g. Ponieważ średnia waga osoby dorosłej wynosi 60 kg, dawka dla osoby dorosłej wynosi 0,1667 g/kg. Zgodnie z algorytmem konwersji wagi24, ponieważ współczynnik konwersji dawki między ludźmi a szczurami wynosi 6,3, dawka dla szczurów wynosi 1,05 g/kg. Dawkę leku zwiększono 10-krotnie do 10,5 g/kg u szczurów. Dawka została ustalona na 10 g/kg dla wygody obliczeń i właściwego eksperymentu. Na przykład, zgodnie z obliczeniami, jeśli potrzebne jest łącznie 36 g CR lub CRV, chiński lek ziołowy powinien być przygotowany co najmniej dwa razy. W związku z tym wymagane było 200 g CR - 100 g CR zostało użyte jako CR, a 100 g CR zostało przetworzone na CRV.
    2. Obliczyć objętość CR lub CRV, którą należy zastosować na szczura, stosując równanie (1):
      V = 10 g/(kg∙dzień) × 200 g/(1 g/ml) = 2 ml (1)
  2. Przetwarzanie CRV
    1. Dokładnie wymieszaj 100 g CR i 20 g octu (>5,5 g kwasu octowego/100 ml) i inkubuj przez 12 godzin
      UWAGA: Aby upewnić się, że wnętrze CR zostało zwilżone octem po 12 godzinach, CR i ocet wymieszano, dobrze wymieszano, a następnie ponownie wymieszano, aż wewnętrzna część będzie wilgotna.
    2. Mieszaj mieszaninę na żelaznej patelni przez 10 minut w temperaturze 110-120 °C. Następnie wyjmij mieszaninę i pozwól jej ostygnąć w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Aby zapobiec przypaleniu się CR, konieczne jest ciągłe mieszanie podczas podgrzewania. Jeśli przetworzony CRV jest zbyt mokry, można go wysuszyć w temperaturze 60 °C. Gdy powierzchnia CR jest w sepii, smażenie można przerwać.
  3. wydobywanie
    1. Ekstrakt z CR
      1. Dodaj 10 razy (ilość CR) czystej wody do CR i moczyć przez 2 godziny. Upewnij się, że materiały lecznicze znajdują się poniżej poziomu płynu podczas moczenia.
        UWAGA: CR należy przeciąć tylko na pół przed ekstrakcją. Celem namaczania jest skuteczniejsza ekstrakcja składników aktywnych. Proces namaczania jest niezbędny.
      2. Doprowadź mieszaninę wody i leku do wrzenia na dużym ogniu i gotuj na małym ogniu przez 20 minut. Przefiltruj za pomocą tkaniny filtracyjnej (100 oczek) i zbierz filtrat.
        UWAGA: Podczas dekoktowania przed gotowaniem używano wysokiej temperatury, a do utrzymania wrzenia, używano niskiego ciepła.
      3. Powtórzyć krok 1.3.1.2 jeden raz i połączyć filtraty.
      4. Zagęścić ekstrakt za pomocą wyparki obrotowej do 1 g/ml (w oparciu o oryginalny lek, temperatura stężenia musi być niższa niż 60 °C).
        UWAGA: Składniki aktywne w CR są lotne, dlatego temperatura stężenia nie powinna być wyższa niż 60 °C.
    2. Ekstrakt z CRV
      1. Wykonać te same czynności (1.3.1.1-1.3.1.3), jak w przypadku metody ekstrakcji CR.
    3. Ekstrakt CR do badań
      1. Odpipetować 500 μl ekstraktu CR i 500 μl metanolu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 30 sekund, aby wymieszać.
        UWAGA: Mieszanina metanolu i wody lepiej ekstrahuje składniki aktywne. Ekstrakt nie powinien być bezpośrednio filtrowany do testów.
      2. Odwirować każdą próbkę przez 15 minut w temperaturze 1,6502 × g w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant, a następnie przenieść go do fiolki z próbką w celu przeprowadzenia testu.
        UWAGA: Po szybkim odwirowaniu mieszaniny metanolu i ekstraktu, supernatant można bezpośrednio przenieść do butelki na próbkę w celu oznaczenia bez filtracji. Ze względu na ciepło wytwarzane w procesie wirowania zaleca się stosowanie wirówki kriogenicznej.
    4. Wyciąg CRV do badań
      1. Wykonaj kroki 1.3.3.1-1.3.3.2, aby przygotować ekstrakt CRV do badania.

2. Zwierzęta

  1. kalkulacja
    1. Weź 50 mg benzoesanu estradiolu i dodaj go do 50 ml oliwy z oliwek, aby przygotować roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Weź 50 mg oksytocyny i dodaj ją do 50 ml soli fizjologicznej, aby przygotować roztwór o stężeniu 1 mg/ml.
      UWAGA: Dawka dootrzewnowego wtrysku benzoesanu estradiolu i oksytocyny wynosi 10 mg/(kg∙dobę). Benzoesan estradiolu rozpuszcza się w oliwie z oliwek, a oksytocyna rozpuszcza się w zwykłej soli fizjologicznej. Benzoesan estradiolu nie jest łatwy do rozpuszczenia w oliwie z oliwek i może być leczony ultradźwiękami w celu przyspieszenia rozpuszczania. Zarówno roztwory benzoesanu estradiolu, jak i oksytocyny muszą być przygotowywane codziennie.
    2. Obliczyć objętość roztworu benzoesanu estradiolu, który należy zastosować na szczura (tj. V = 10 mg/[kg∙dzień] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Obliczyć objętość roztworu oksytocyny, którą należy zastosować na szczura (tj. V = 10 mg/[kg∙dzień] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Grupowanie i podawanie zwierząt
    UWAGA: Na administrację przeznaczono dziesięć dni25,26. Podczas leczenia szczury miały nieograniczony dostęp do standardowej karmy i wody. W ciągu 30 minut od podania oksytocyny śledzono aktywność wicia się każdego szczura. Model szczura PD został opracowany pomyślnie, o czym świadczą modelowe reakcje skrętne szczurów, które obejmowały skurcz macicy, obrót jednej kończyny, wyprost kończyny tylnej, pusty tułów i skurcz brzucha26.
    1. Przypisz 24 samice szczurów Sprague-Dawley (szczury SD, w wieku 8-10 tygodni, o wadze 200 g ± 20 g) do czterech grup w losowej kontroli - kontrolnej, modelowej, CR i CRV - i karm je przez 7 dni.
    2. Administracja zwierząt
      1. Szczurom w grupach modelowych, CR i CRV wstrzykuje się dootrzewnowo 2 ml roztworu benzoesanu estradiolu każdego dnia. Dootrzewnowo wstrzyknąć szczurom w grupie kontrolnej 2 ml soli fizjologicznej.
      2. Od 8 dnia wykonaj krok 2.2.2.1. Następnie podaj dożołądkowo 2 ml ekstraktu CRV szczurom w grupie CRV, 2 ml ekstraktu CR szczurom w grupie CR i 2 ml soli fizjologicznej szczurom w grupie kontrolnej i modelowej.
      3. W dniu 10 wykonaj krok 2.2.2.2. Następnie wstrzyknąć dootrzewnowo szczurom w grupach modelowych, CR i CRV 2 ml roztworu oksytocyny, a szczurom w grupie kontrolnej 2 ml soli fizjologicznej.
    3. Zapisz czas wicia się szczurów w ciągu 30 minut od wstrzyknięcia oksytocyny.
  3. Pobieranie próbek
    1. Pobrać próbki krwi z aorty brzusznej, szybko i całkowicie wyciąć macicę i ostrożnie oddzielić tkankę łączną i tłuszcz przylegający do ściany macicy.
      UWAGA: Krew pobrano w ciągu 1 godziny po podaniu ostatniej dawki.
    2. Użyj probówek do mikrowirówek, aby zachować i przenieść tkankę macicy do ciekłego azotu. Próbki tkanek przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Odwirować próbki krwi przez 10 minut przy 4,125 × g. Usunąć supernatant zawierający surowicę i odwirować w temperaturze 16 502 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować surowicę, a następnie przechowywać ją w probówce w temperaturze -80 °C do przechowywania.
      UWAGA: Próbki krwi należy pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 godzinę w celu ponownego przetworzenia.
  4. Przetwarzanie próbek
    1. Próbki surowicy
      1. Umieść 400 μl metanolu i 200 μl surowicy w probówce do mikrowirówki i mieszaj przez 30 sekund. Odwirować każdą próbkę przez 15 minut w temperaturze 16 502 × g w temperaturze 4 °C. Po pobraniu i przefiltrowaniu napełnić butelki z próbkami supernatantem. Wymieszać wszystkie supernatanty z każdej próbki o tej samej objętości, aby przygotować próbki kontroli jakości do badań.
    2. Próbki tkanki macicy
      1. Weź 100 mg tkanki macicy z segmentu ipsilateralnego i zmiel ją dziewięciokrotną objętością normalnej soli fizjologicznej. Odwirować homogenat przez 10 minut w temperaturze 4,125 × g i zebrać supernatant. Umieścić supernatant w lodówce w temperaturze 4 °C do celów badania lub w temperaturze −80 °C, jeżeli nie ma być badany tego samego dnia.
      2. Umieść zwykłą sól fizjologiczną, tkankę i kulki stalowe w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml, włóż probówkę do mikrowirówki do ciekłego azotu na 3-5 sekund, a następnie włóż tkankę do młynka do tkanek w celu zmielenia.
  5. Przykładowe testy
    1. Użyj testu immunoenzymatycznego (ELISA), aby zmierzyć zawartość PGF2α i PGE2 w tkankach macicy w próbkach szczurów.
      UWAGA: Do pomiaru zawartości PGE2 użyto zestawu PGE2 ELISA dla szczurów, a do pomiaru poziomu PGF2α użyto zestawu PGF2α dla szczurów. Szczegółowe kroki można znaleźć w instrukcji producenta. Szczegóły zestawu podane są w Tabeli Materiałów.
    2. Ocenić próbkę surowicy, ekstrakt CR i ekstrakt CRV za pomocą UPLC-MS/MS.
      1. W przypadku UPLC należy użyć kolumny C18 (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) i metody gradientu binarnego z fazą ruchomą A zawierającą 0,1% kwasu mrówkowego i fazą ruchomą B zawierającą acetonitryl. Ustaw gradient elucji w następujący sposób: od 0 min do 1 min, 15% B; od 1 min do 8,5 min, od 15% do 85% B; od 8,5 min do 11,5 min, 85% B; od 11,5 min do 11,6 min, 99% do 1% B; i od 11,6 min do 15 min, 15% B. Ustawić natężenie przepływu na 0,35 mL/min, a objętość wtrysku na 2 μL.
      2. W przypadku MS należy ustawić temperaturę na 600 °C, natężenie przepływu gazu kurtynowego (CUR) na 0,17 MPa, a zarówno osłonę, jak i natężenie przepływu gazu pomocniczego na 0,38 MPa. Ustawić napięcie rozpylania jonów w trybie jonów dodatnich i ujemnych odpowiednio na 5,5 kV i −4,5 kV, napięcie potencjału deklastrującego (DP) na 80 V lub −80 V, energię zderzenia (CE) na 40 eV lub −25 eV, a superpozycję energii zderzenia (CES) na 35 eV ± 15 eV.
      3. Wykonaj test zgodnie z protokołem producenta za pomocą UPLC-MS/MS. Wykonaj MS dla zakresu mas 50-1,000 m/z.
      4. Uzyskaj wyniki UPLC-MS/MS za pomocą pasującego programu stacji roboczej w połączeniu z akwizycją zależną od informacji w trybie wykrywania, filtrem wielu wad masy i dynamiczną dedukcją tła. Wykorzystać próbki kontroli jakości połączonej surowicy do zbadania powtarzalności i stabilności sprzętu UPLC-MS/MS w celu zweryfikowania konwencjonalnego podejścia. Przed próbkami badawczymi należy wstrzykiwać próbki kontroli jakości przez cztery kolejne serie, a następnie wstrzykiwać je po każdych pięciu próbkach surowicy.

3. Przetwarzanie danych

  1. Przygotowanie danych
    1. Użyj oprogramowania do konwersji, aby przekonwertować surowe dane do formatu mzXML. Znormalizuj dane całkowitego prądu jonów (TIC) każdej próbki.
      UWAGA: Wewnętrzna aplikacja (www.lims2.com) oparta na języku R zbudowana na XCMS została użyta do analizy informacji na potrzeby integracji, wyrównania, ekstrakcji i wykrywania szczytów27.
    2. Wykonaj adnotację metabolitów przy użyciu zastrzeżonej bazy danych MS2 (www.lims2.com). Ustaw próg adnotacji na 0.328.
      UWAGA: Endogenne metabolity zidentyfikowano w każdej grupie.
  2. Analiza składowych głównych i ortogonalna cząstkowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów
    1. Użyj oprogramowania analitycznego, aby przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA) i modelowanie. Zaimportuj znormalizowane dane metabolitów do oprogramowania analitycznego. Następnie użyj funkcji autodopasowania, aby zbudować model analizy. Na koniec użyj wyniku, aby uzyskać wykres punktowy wyniku PCA.
      UWAGA: Grupowanie każdej grupy uzyskano za pomocą wykresu punktowego punktacji PCA. PCA to tryb analizy bez nadzoru, który głównie grupuje próbki poprzez redukcję wymiarów bez interwencji.
    2. Użyj oprogramowania analitycznego, aby przeprowadzić ortogonalną częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA).
      1. Zaimportuj znormalizowane dane dotyczące metabolitów w grupach CR i CRV do oprogramowania analitycznego.
      2. Zaimportuj dane z grupy CR do utworzonej grupy CRV i zaimportuj dane z grupy CRV do utworzonej grupy CRV.
        UWAGA: OPLS-DA jest trybem analizy nadzorowanej i konieczne jest grupowanie próbek.
      3. Następnie użyj autodopasowania, aby zbudować model analizy i użyj wyniku, aby uzyskać wykres punktowy wyniku OPLS-DA. Na koniec należy użyć adresu VIP, aby uzyskać wartość zmiennej istotności projekcji (VIP) w OPLS-DA.
        UWAGA: Zmienną istotność w wartościach projekcji (VIP) metabolitów w grupach CR i CRV uzyskano za pomocą OPLS-DA.
  3. Identyfikacja potencjalnych metabolitów różnicowych
    1. Należy odsiać metabolity o wartościach VIP większych niż 1 w kroku 3.2.2.3.
    2. Użyj oprogramowania statystycznego, aby obliczyć wartość P metabolitów, które zostały odsiane w kroku 3.3.1 za pomocą testu t-Studenta.
      UWAGA: Istotne różnice w potencjalnych metabolitach różnicowych w grupach CR i CRV określono za pomocą testu t-Studenta. Potencjalnymi metabolitami różnicowymi były metabolity o wartości p w teście t-Studenta wynoszącej < 0,05 i zmiennej istotności w projekcji (VIP) większej niż 1. Przedstawienie zostało zrealizowane przy użyciu poletka wulkanicznego.
  4. Identyfikacja metabolitów różnicowych
    1. Odsiać potencjalne metabolity różnicowe w kroku 3.3. Wykorzystać wyniki kroku 3.1.2 w celu zidentyfikowania tych różnicowych metabolitów.
      UWAGA: Zidentyfikowano niewielką liczbę potencjalnych metabolitów różnicowych, które stały się potencjalnymi metabolitami różnicowymi.
    2. Odsiać metabolity różnicowe, które mają zostać dopasowane w bazie danych KEGG. Pokaż zmiany w metabolitach różnicowych w grupach CR i CRV, rysując mapę cieplną.
      UWAGA: Niewielka liczba kandydujących metabolitów różnicowych została dopasowana i stały się one metabolitami różnicowymi.
  5. Badanie potencjalnych szlaków metabolicznych
    1. Prześlij różne metabolity do bazy danych Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Użyj analizy ścieżek, aby uzyskać potencjalne szlaki metaboliczne.
      UWAGA: Potencjalne szlaki metaboliczne uzyskano w grupach CR i CRV. Wartość P i wartość wpływu były dwoma bardzo ważnymi wskaźnikami przy wyborze ścieżek krytycznych. Wartość P była ważniejsza niż wartość wpływu. Istotność określono za pomocą wartości P < 0,05; Większe wartości wpływu wiązały się z lepszymi korelacjami.
    3. Analizuj potencjalne szlaki metaboliczne, przesyłając różne metabolity do bazy danych KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      UWAGA: Należy również wziąć pod uwagę związek między funkcją szlaku metabolicznego a chorobą Parkinsona. Uzyskano kluczowe szlaki metaboliczne.
  6. Identyfikacja składników wchłanianych do krwi
    1. Zidentyfikuj składniki chemiczne w ekstraktach CR i CRV, korzystając z wewnętrznej bazy danych MS2 (www.lims2.com), bazy danych ludzkiego metabolomu (HMDB) oraz baz danych Massbank i Chemspider.
    2. Określ składniki wchłaniane do krwi w grupach CR i CRV i porównaj składniki między grupami CR i CRV.
      UWAGA: Składniki wchłonięte do krwi muszą być wykryte w grupie CR lub CRV, ale nie mogą być wykryte w grupie kontrolnej.
  7. analiza statystyczna
    1. Analizuj dane za pomocą analizy jednowymiarowej (UVA) i wielowymiarowych metod statystycznych, w tym analizy wariancji (ANOVA) i testu t-Studenta.
      UWAGA: Informacje eksperymentalne przedstawiono za pomocą oprogramowania statystycznego jako średnią ± odchylenie standardowe (±SD). P < 0,01 było uważane za bardzo istotną różnicę, a P < 0,05 reprezentowało istotną różnicę28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza eksperymentu z modelem bolesnego miesiączkowania
W grupie kontrolnej nie stwierdzono wijącej się odpowiedzi w ciągu 30 minut, ponieważ szczurom tym nie wstrzyknięto dootrzewnowo oksytocyny i benzoesanu estradiolu w celu wywołania bólu. Szczury w grupach modelowych, CR i CRV wykazywały znaczne reakcje wijące się po wstrzyknięciu oksytocyny. Wyniki te pokazują skuteczność kombinacji benzoesanu estradiolu i oksytocyny w wywoływaniu bolesnego miesiączkowania. Różnice w poziomach PGF2α,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na szeroką gamę i różny charakter TCM, zioła te czasami nie sprawdzają się w praktyce klinicznej, a może to być spowodowane niewłaściwym przetwarzaniem i dekoktacją TCM. Mechanizmy TCM stają się coraz bardziej widoczne dzięki wykorzystaniu współczesnej nauki i technologii29,30. Badanie to pokazuje, że zarówno CR, jak i CRV mają działanie terapeutyczne u szczurów z modelem PD i że efekt terapeutyczny CRV jest bardziej znaczący. Mechanizm działania CRV m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Projekt Nauki i Technologii Medycyny Chińskiej Miejskiej Miejskiej i Zdrowia w Chongqing (numer projektu: ZY201802297), Ogólny projekt Fundacji Nauk Przyrodniczych Chongqing (Numer projektu: cstc2019jcyj-msxmX065), Charakterystyczny Nowoczesny Obszar Górski Chongqing Charakterystyka Wysokowydajnego Systemu Innowacji Technologii Rolniczej Plan Budowy 2022 [10] oraz Projekt Budowy Kluczowej Dyscypliny Komisji Zdrowia Miasta Chongqing Chińskiego Przetwarzania Materia Medica.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitryl Fisher Scientific, Pittsburg, PA, Stany Zjednoczone197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20Beckman  Coulter, Inc.
Benzoesan estradioluShanghai Macklin Biochemical Co., LtdC10042616
kwas mrówkowyFisher Scientific, Pittsburg, PA, StanyZjednoczone 177799
System LC 30AShimadzu, Kioto, Japonia228-45162-46
Oliwa z oliwekShanghai Yuanye Biotechnology Co., LtdH25A11P111909
Oksytocyna syntetycznaBiologia peptydów Zhejiang Co., Ltd 
Szczur PGF2α Zestaw ELISAShanghai lmai Bioengineering Co., Ltd202101
Szczur Zestaw ELISA PGFE2Shanghai lmai Bioengineering Co., LtdEDL202006217
SPF Szczury Sprague-DawleyHunan SJA Laboratory Animal Co., LtdNumer certyfikatu: SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
Potrójny system TOF 4600SCIEX, Framingham, MA, Stany ZjednoczoneBK20641402
wodyFisher Scientific, Pittsburg, PA, USA152720
MRZ15K0472019092001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009(2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558(2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962(2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832(2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867(2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709(2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238(2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773(2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763(2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642(2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233(2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801(2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768(2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181(2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119(2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448(2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966(2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191(2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683(2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628(2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555(2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cyperi RhizomaVinegar ProcessingPrimary DysmenorrheaLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryMetabonomics AnalysisDifferential MetabolitesKEGG PathwayPrincipal Component AnalysisOrthogonal Partial Least Squares

Related Articles