Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test na zieleń malachitową w celu odkrycia inhibitorów białka szoku cieplnego 90

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64693

⸱

20 stycznia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology (KIST), 2School of Life Sciences, University of Sussex

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół testu zieleni malachitowej jest prostą i opłacalną metodą do odkrycia tłumików białka szoku cieplnego 90 (Hsp90), a także innych związków hamujących enzymy zależne od ATP.

Streszczenie

Białko szoku cieplnego 90 (Hsp90) jest obiecującym celem przeciwnowotworowym ze względu na jego opiekuńczy wpływ na wiele białek onkogennych. Aktywność Hsp90 zależy od jego zdolności do hydrolizy trifosforanu adenozyny (ATP) do difosforanu adenozyny (ADP) i wolnego fosforanu. Aktywność ATPazy Hsp90 jest związana z jej funkcją opiekuńczą; ATP wiąże się z N-końcową domeną Hsp90, a przerwanie jej wiązania okazało się najbardziej skuteczną strategią tłumienia funkcji Hsp90. Aktywność ATPazy można zmierzyć za pomocą kolorymetrycznego testu zieleni malachitowej, który określa ilość wolnego fosforanu powstałego w wyniku hydrolizy ATP. W tym miejscu opisano procedurę oznaczania aktywności ATPazy drożdży Hsp90 przy użyciu zestawu do oznaczania zielonego fosforanu malachitu. Ponadto podano szczegółowe instrukcje dotyczące odkrywania inhibitorów Hsp90 poprzez przyjmowanie geldanamycyny jako autentycznego inhibitora. Na koniec omówiono zastosowanie tego protokołu testowego poprzez wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) cząsteczek inhibitora przeciwko drożdżom Hsp90.

Wprowadzenie

Białko szoku cieplnego 90 (Hsp90) jest molekularnym chaperonem, który utrzymuje stabilność białek odpowiedzialnych za rozwój i progresję raka. Ponadto białka odpowiedzialne za rozwój oporności na leki przeciwnowotworowe są również klientami Hsp901. Hsp90 ulega nadekspresji we wszystkich typach komórek nowotworowych (>90% białek komórkowych), w porównaniu z normalnymi komórkami, w których może stanowić mniej niż 2% wszystkich białek. Co więcej, Hsp90 komórek rakowych znajduje się w kompleksie z ko-chaperonami, podczas gdy w normalnej komórce występuje głównie w stanie wolnym, nieskompleksowanym2,3. W ostatnich latach wykazano, że kilka inhibitorów Hsp90 ma działanie senolityczne w badaniach in vitro i in vivo, gdzie znacznie poprawiły długość życia myszy4,5,6. Wszystkie wyżej wymienione odkrycia potwierdzają fakt, że inhibitory Hsp90 mogą być skuteczne w wielu typach raka, przy mniejszej liczbie działań niepożądanych i zmniejszonych szansach na rozwój oporności. Funkcja opiekuńcza Hsp90 jest realizowana poprzez wiązanie ATP w domenie N-końcowej Hsp90 i hydrolizę go do ADP i wolnego fosforanu7. Stwierdzono, że małe cząsteczki, które konkurencyjnie wiążą się z kieszenią wiążącą ATP Hsp90, skutecznie tłumią efekt opiekuńczy białka. Do tej pory pozostaje to najlepszą strategią hamowania Hsp90, co potwierdza fakt, że takie inhibitory osiągnęły wyniki badań klinicznych8. Jeden z nich, Pimitespib, został zatwierdzony w Japonii do leczenia guza podścieliska przewodu pokarmowego (GIST) w czerwcu 2022 r.9. Jest to pierwszy inhibitor Hsp90 zatwierdzony od czasu ustalenia w 1994 r. zdolności terapeutycznej białka opiekuńczego10.

Test zieleni malachitowej jest prostą, czułą, szybką i niedrogą procedurą wykrywania fosforanów nieorganicznych, odpowiednią do automatyzacji i wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) związków pod kątem pożądanego celu11. Test został z powodzeniem zastosowany do badań przesiewowych inhibitorów Hsp90 w małych konfiguracjach laboratoryjnych, a także w klasie HTS12,13,14,15,16,17. Test wykorzystuje metodę kolorymetryczną, która określa wolny nieorganiczny fosforan powstały w wyniku aktywności ATPazy Hsp90. Podstawą tej kwantyfikacji jest tworzenie kompleksu fosfomolibdenianu między wolnym fosforanem a molibdenem, który następnie reaguje z zielenią malachitową, generując zielony kolor (Rysunek 1). To szybkie tworzenie się kolorów jest mierzone na spektrofotometrze lub czytniku płytkowym w zakresie 600-660 nm18,19.

W obecnym protokole opisana jest procedura przeprowadzania testu na zieleń malachitową z drożdżami Hsp90 i późniejszej identyfikacji inhibitorów przeciwko chaperonowi. Cząsteczka produktu naturalnego, geldanamycyna (GA), za pomocą której po raz pierwszy ustalono zdolność Hsp90 do działania, została uznana za autentyczny inhibitor10. HTS stał się integralną częścią obecnego programu odkrywania leków, ze względu na dostępność dużej liczby cząsteczek do testów. Technika ta zyskała na znaczeniu w ciągu ostatnich 2 lat ze względu na pilną potrzebę zmiany przeznaczenia leków do leczenia infekcji Covid-1920,21. W związku z tym przedstawiono szczegółowy zarys HTS cząsteczek przeciwko białku Hsp90 drożdży przy zastosowaniu metody oznaczania zieleni malachitowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Test na skalę laboratoryjną malachitu

  1. Przygotowanie buforu do badania
    1. Przygotować bufor do oznaczania, zgodnie ze składem i preparatem przedstawionymi w tabeli 1.
  2. Przygotowanie wzorców fosforanowych
    1. Użyć wzorca fosforanowego 1 mM, znajdującego się w zestawie do oznaczania fosforanów z zielenią malachitową (przechowywanym w temperaturze 4 °C).
    2. Odpipetować 40 μl 1 mM wzorca fosforanowego w 960 μl ultraczystej wody, aby otrzymać 40 μM roztworu fosforanu (roztwór premiksu). Dodać roztwór premiksu z ultraczystą wodą, zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać seryjne rozcieńczenie fosforanu od 0 do 40 μM.
  3. Przygotowanie drożdży Hsp90
    1. Użyj drożdży Hsp90 o stężeniu podstawowym glicerolu 0,66 mg/ml. Rozmrozić na lodzie tuż przed użyciem.
    2. Użyj 8 μl (5,98 μg, 0,80 μM) drożdży Hsp90, aby zmierzyć aktywność ATPazy. Sprawdzić, czy różnica gęstości optycznej po dodaniu odczynnika w kolorze zieleni malachitowej między ślepą próbą a kontrolą dodatnią wynosi co najmniej 0,5 i mniej niż 1,0. W tym przypadku stwierdzono, że różnica absorbancji między ślepą próbą (bez Hsp90) a kontrolą pozytywną (z Hsp90) wynosi 0,510.
  4. Przygotowanie ATP
    1. Przenieść 1 mg ATP do fiolki zawierającej 453,39 μl ultraczystej wody, aby uzyskać 4 mM roztworu podstawowego. Wykonaj obliczenia wagowe na podstawie bezwodnego ATP (masa cząsteczkowa [m.w.] = 551,14). Przygotuj ATP na świeżo, ponieważ z czasem może ulec spontanicznej hydrolizie.
    2. Dodać 4 μl roztworu podstawowego ATP do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie studzienki 0,2 mM (końcowa całkowita objętość studzienki testowej 80 μl). Dodaj ATP jako ostatni składnik do reakcji, używając pipety wielokanałowej, tak aby wszystkie reakcje rozpoczęły się jednocześnie.
  5. Preparat geldanamycyny (GA)
    1. Przygotować 10 mM zapasu GA rozpuszczając 1 mg w 178,37 μl DMSO (m.w. = 560.64). Używając roztworu podstawowego, przygotować roztwór 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM i 0,00128 mM w DMSO przez seryjne rozcieńczanie.
    2. Dodaj 2 μl tych roztworów podstawowych do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie studzienki odpowiednio 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM i 0,000032 mM.
    3. Przygotować studzienki zgodnie z opisem w tabeli 2 i tabeli 3, przy czym studzienki zawierają ślepą próbę (bufor + woda + DMSO) i kontrolę ujemną (Hsp90 w buforze + woda + DMSO). Studnie zawierające GA (Hsp90 w buforze + woda + GA) służą jako kontrola pozytywna.
  6. Przygotowanie płytek studzienkowych i kolejność dodawania
    1. Przygotować płytki 96-dołkowe o układzie przedstawionym w tabeli 2. W przypadku związków, które wykazują absorbancję przy 620 nm, należy przygotować oddzielną studzienkę do rejestracji absorbancji przy tej długości fali. Nie należy przygotowywać oddzielnej studzienki dla GA, ponieważ GA nie wykazuje absorbancji przy 620 nm dla stężenia użytego w teście.
    2. Przygotować każdy składnik z całkowitą objętością każdego składnika, jak przedstawiono w tabeli 3.
    3. Skonfiguruj studnie testowe, dodając ultraczystą wodę do każdej studzienki. Następnie dodać wymaganą ilość buforu do oznaczania i roztwór złożony (na przykład roztwór GA).
    4. Następnie dodaj Hsp90 do odpowiednich dołków i potrząsaj płytkami przez 2 minuty na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 4 μl roztworu ATP za pomocą pipety wielokanałowej. Zawiń talerz w folię aluminiową i potrząsaj przez 2 minuty na wytrząsarce talerzowej (200 obr./min) w temperaturze pokojowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  7. Przygotowanie i dodanie odczynnika zieleni malachitowej
    1. Odczynnik zieleni malachitowej składa się z odczynników A (molibdenian amonu w 3M HCl) i B (zieleń malachitowa i alkohol poliwinylowy). Przed użyciem doprowadzić odczynnik do temperatury pokojowej. Wymieszać odczynniki A i B w stosunku 100:1 (1 000 μL: 10 μL). Przygotuj go w ciągu 3 godzin przed użyciem, ponieważ jest niestabilny i zaczyna się rozkładać po 3 godzinach.
    2. Po 3 godzinach kroku 1.6.5 zatrzymać reakcję, dodając 20 μl odczynnika z zieleni malachitowej, dodawanego w tej samej kolejności co ATP, za pomocą pipety wielokanałowej.
    3. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zmierzyć absorbancję płytki przy długości fali 620 nm w czytniku płytek.

2. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe inhibitorów Hsp90 za pomocą testu zieleni malachitowej

UWAGA: Protokół badań przesiewowych o wysokiej przepustowości jest podobny do metodologii stosowanej w skali laboratoryjnej. Ostateczna objętość studzienki w każdym przypadku wynosi 80 μl. Istnieje jednak niewielka różnica w kolejności dodawania odczynników. W metodzie laboratoryjnej wyróżnia się pięć etapów dodawania roztworu (34 μl wody, 32 μl buforu, 2 μl związku w DMSO, 8 μl Hsp90 i wreszcie 4 μl roztworu ATP). Natomiast w przypadku HTS wyróżnia się trzy etapy dodawania (40 μL roztworu buforowego zawierającego drożdże Hsp90, 2 μL DMSO w 18 μL wody zawierającej związki, a na końcu 20 μL ATP rozpuszczonego w wodzie). Minimalna ilość roztworu, którą można dokładnie odpipetować w układzie HTS, wynosi 20 μl. W związku z tym obserwuje się różnicę w pipetowaniu między wagami laboratoryjnymi a wagami HTS.

  1. Przygotowanie buforu do oznaczania (pH 7,4)
    1. W HTS należy użyć tego samego buforu, co w przypadku testu zieleni malachitowej w skali laboratoryjnej (Tabela 1).
  2. Przygotowanie drożdży Hsp90
    1. Używaj białka o podstawowym stężeniu glicerolu 0,66 mg/ml. Rozmrozić na lodzie tuż przed użyciem.
    2. Użyj 8 μl (5,98 μg, 0,80 μM) drożdży Hsp90 w każdym dołku, co zapewnia mierzalną aktywność ATPazy.
    3. Rozcieńczyć białko (8 μl) w buforze (32 μl) dla każdego dołka. Ostateczna całkowita objętość robocza dla każdej studzienki wynosi 40 μl przy całkowitej objętości testu wynoszącej 80 μl.
  3. Przygotowanie 0,8 mM ATP
    1. Rozpuścić 1 mg ATP w 2,267 μl wody destylowanej do otrzymania roztworu o stężeniu 0,8 mM. Całkowita objętość robocza dla każdej studzienki wynosi 20 μl przy całkowitej objętości testu wynoszącej 80 μl.
  4. Przygotowanie geldanamycyny (GA)/badanych związków
    1. Przygotuj zapas 0,8 mM GA w DMSO, jak w kroku 1.5. Rozcieńczyć 10 μl podstawowego GA w 90 μl wody, aby uzyskać końcowe stężenie 80 μM.
    2. Użyć 20 μl roztworu GA o stężeniu 80 μM w odpowiednich dołkach testowych (końcowa całkowita objętość studzienki testowej = 80 μL), uzyskując końcowe stężenie studzienki 20 μM. Służy to jako kontrola pozytywna.
    3. W przypadku badanych związków należy przygotować roztwory w DMSO zgodnie z ich pożądanym stężeniem do oceny.
    4. Przygotować 10 μl DMSO w 90 μl wody do dodania do studzienek ślepej próby (bufor + woda + DMSO) i kontroli ujemnej (Hsp90 w buforze + woda + DMSO). Przygotować badane związki w podobny sposób przy końcowym stężeniu studzienki 100 μM.
  5. Projektowanie płytek do oznaczania i kolejność dodawania
    1. Użyj czterech płytek głównych, jednej płytki złożonej i czterech płytek addycyjnych zawierających zapasy odczynników, aby skonfigurować test (Rysunek 2 i Tabela 4).
    2. Ponadto na płytkę A dodać 90 μl buforu do oznaczania do każdej studzienki; dodatkowo na płytkę B dodać 90 μl buforu z Hsp90 do każdej studzienki; dodatkowo na płytki C i D dodać odpowiednio 90 μl ATP i 90 μl odczynnika zieleni malachitowej do każdej studzienki (tabela 5 i tabela 6).
    3. Z płytki addycyjnej A i płytki B przenieść 40 μl roztworu z każdej studzienki na główną płytkę odpowiednio 1 i 2 oraz 3 i 4, używając zautomatyzowanego wielokanałowego systemu dozowania. W tym przypadku wykorzystano stację roboczą do automatyzacji laboratorium Biomek(R) FXP (Rysunek 2 i Tabela 6).
    4. Z każdej studzienki płytki złożonej przenieś 20 μl roztworu na główne płytki 1, 2, 3 i 4 (Rysunek 2). Potrząsaj talerzami przez 1 minutę w wytrząsarce (200 obr./min).
    5. Z każdej studzienki płytki addycyjnej C (ATP) przenieś 20 μl roztworu na główne płytki 1, 2, 3 i 4 (Rysunek 2). Potrząsaj talerzami przez 1 minutę w wytrząsarce (200 obr./min).
    6. Inkubować płytki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    7. Przygotować odczynnik z zieleni malachitowej zgodnie z krokiem 1.7. Po 3 godzinach przenieś 20 μl odczynnika zieleni malachitowej z płytki addycyjnej D do studzienek głównych płytek 1, 2, 3 i 4 (Rysunek 2).
    8. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zmierzyć absorbancję płytki przy 620 nm w czytniku płytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki testu interpretuje się w oparciu o absorbancję wynikającą z stężenia wolnych jonów fosforanu. Absorbancję wolnego fosforanu powstałego w wyniku hydrolizy ATP przez drożdżowe Hsp90 przy 620 nm uznaje się za 100% aktywności ATPase, co odpowiada zerowemu procentowi inhibicji białka. Inhibicja białka prowadzi do zatrzymania hydrolizy ATP (mniejsza ilość wolnego fosforanu), co przejawia się spadkiem absorbancji przy 620 nm.

Wyniki testu z zielenią malachitową w skali laboratoryjnej

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hsp90 jest ważnym celem dla odkrycia nowych cząsteczek leków przeciwnowotworowych. Od czasu ustalenia jego lekowrażliwości w 1994 r.10, 18 cząsteczek trafiło do badań klinicznych. Obecnie siedem cząsteczek znajduje się w różnych fazach badań klinicznych, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu22. Wszystkie takie małe cząsteczki są N-końcowymi inhibitorami wiązania ATP. Inne sposoby hamowania białka opiekuńczego (inhibitory C-końcowe, inhibitory domeny środkowej) nie postęp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez program Korea Research Fellowship (KRF), doktora habilitowanego Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF), finansowanego przez ministerstwo nauki i ICT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Autorzy są wdzięczni grantowi stacjonarnemu KIST oraz grantowi Ministerstwa Oceanów i Rybołówstwa nr 2MRB130 za udzielenie pomocy finansowej na ten projekt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1M Roztwór chlorku magnezu w wodzieSigma-Aldrich63069-100ml
1M Roztwór chlorku potasu w wodzieSigma-Aldrich60142-100ml
Płytka 96-dołkowaSPL Nauki przyrodniczeNie dotyczy
Hydrat soli disodowej 5′-trifosforanuSigma-AldrichA7699-5G
Biomek FX laboratorium stacja robocza automatykiBeckman CoulterNie dotyczy
Związki 3-96Nie dotyczyNie dotyczyDrożdże znakowane histydyną Hsp90 uzyskano od dr Chrisostomosa Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, Wielka Brytania, a białko wyrażono w KIST Gangneung Institute of Natural Products. Szczegóły nie mogą zostać ujawnione ze względu na kwestie związane z naruszeniem patentu.
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD8418
Geldanamycyna, 99% (HPLC), proszekAK Scientific, Inc.V2064
Invitroge UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNazThermoFisher Scientific10977015
Test zielonego fosforanu malachitu  Zestaw testowySigma-AldrichMAK307-1KT
Czytnik mikropłytek z wieloma detekcjami Synergy HTBiotek Instruments, Inc.Nie dotyczy
Czytnik wielopłytkowy Synergy HTBiotek Instruments, Inc.Nie dotyczy
Roztwór buforowy chlorowodorku Trizma, pH 7,4Sigma-Aldrich93313-1L
Drożdże Hsp90Nie dotyczyNie dotyczySchool of Life Sciences, University of Sussex, Wielka Brytania, a białko wyrażono w KIST Gangneung Institute of Natural Products. Podstawowy numer dostępu: P02829

Bibliografia

  1. Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
  2. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
  3. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  4. Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
  5. Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422(2017).
  6. Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
  7. Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
  8. Park, H. -K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
  9. Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
  10. Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
  11. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  12. Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
  13. Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
  14. Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
  15. Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
  16. Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
  17. Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
  18. Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
  19. Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
  20. Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
  21. Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
  22. Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).
  23. Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
  24. Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074(2021).
  25. Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
  26. Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425(2018).
  27. Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
  28. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
  29. Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).
  30. Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
  31. Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163(2018).
  32. Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
  33. Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inhibitory Hsp90aktywność ATPaseprzesiew wysokoprzepustowydetekcja fosforanutest kolorymetrycznyhamowanie geldanamycynąHsp90 drożdżyhydroliza ATP
Test na zieleń malachitową w celu odkrycia inhibitorów białka szoku cieplnego 90
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.