Budowa, charakterystyka i zastosowanie regeneracyjne samoorganizujących się ludzkich mezenchymalnych agregatów komórek macierzystych

Summary

To badanie opisuje metodę konstruowania agregatów na podstawie samoorganizacji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i identyfikuje cechy morfologiczne i histologiczne dla regeneracyjnego leczenia ubytków kości czaszki.

Abstract

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), charakteryzujące się zdolnością do samoodnawiania się i potencjałem różnicowania wieloliniowego, mogą pochodzić z różnych źródeł i stają się obiecującymi kandydatami do medycyny regeneracyjnej, zwłaszcza do regeneracji zębów, kości, chrząstek i skóry. Samoorganizujące się podejście do agregacji MSC, które w szczególności konstruuje klastry komórek naśladujące rozwijającą się kondensację mezenchymalną, umożliwia dostarczanie komórek macierzystych o dużej gęstości wraz z zachowanymi interakcjami komórka-komórka i macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) jako niszą mikrośrodowiska. Wykazano, że metoda ta umożliwia skuteczne wszczepianie komórek i przeżycie, promując w ten sposób zoptymalizowane zastosowanie egzogennych MSCs w inżynierii tkankowej i zapewniając kliniczną regenerację narządów. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół budowy i charakterystyki samoorganizujących się agregatów opartych na mezenchymalnych komórkach macierzystych z pępowiny (UCMSC), a także przykład zastosowania regeneracyjnego kości czaszki. Wdrożenie tej procedury pomoże w ustaleniu skutecznej strategii przeszczepów MSC dla inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.

Introduction

Kondensacja mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) jest niezbędnym etapem do zapewnienia prawidłowego wzrostu i rozwoju organizmu we wczesnej organogenezie^1,2, szczególnie w tworzeniu kości, chrząstek, zębów i skóry^1,3,4. W ciągu ostatnich kilku dekad terapie inżynierii tkankowej wykorzystujące hodowlane postnatalne MSCs w połączeniu z biodegradowalnymi rusztowaniami poczyniły ważne postępy w osteogennym⁵ i regeneracji chrzęstnej⁶. Jednak stosowanie rusztowań może mieć pewne wady, takie jak odrzucenie immunologiczne, a także niskie powinowactwo komórkowe i plastyczność⁷. W związku z tym zbadaliśmy możliwość zastosowania metody hodowli komórek sferoidalnych w celu uzyskania samoorganizujących się agregatów bez rusztowań, naśladujących zjawisko rozwijającej się kondensacji, które zawierają tylko MSC i zdeponowaną macierz zewnątrzkomórkową (ECM)⁸. Tworzenie agregatów zwiększa plastyczność aplikacyjną w celu dopasowania do kształtu defektu i pozwala uniknąć zagnieżdżania się rusztowania i trawienia przez enzymy proteolityczne w celu pobrania MSCs do przeszczepu⁹.

agregaty MSC były szeroko stosowane do regeneracji kości, miazgi zębowej, przyzębia i skóry¹⁰, wśród innych tkanek i narządów. Jako kandydatów na komórki nasienne można wybrać wiele różnych typów MSC, w tym między innymi MSC szpiku kostnego (BMMSC), MSC rdzenia pępowinowego (UCMSC), komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) i MSC dentystyczne (np. mezenchymalne komórki macierzyste miazgi zębowej [DPSC], mezenchymalne komórki macierzyste z zębów mlecznych [SHED]¹¹ i mezenchymalne komórki macierzyste przyzębia [PDLSC])¹². W ciągu ostatniej dekady opracowano wiele technologii trójwymiarowych klastrów komórek, w tym agregację wspomaganą i samoorganizującą się. Jednak podejścia wspomaganej agregacji są często słabe w wytwarzaniu ECM i tworzeniu jednorodnych i zwartych agregatów, a zatem nie nadają się do naśladowania warunków fizjologicznych^13,14,15. Co więcej, niektóre metody wspomaganej agregacji wymagają interakcji komórka-materiał w celu utworzenia stabilnych struktur^16,17,18,¹⁹, podczas gdy ta metoda agregacji do samodzielnego montażu jest ogólnie dostępna dla szerokiej gamy MSC. Warto zauważyć, że w naszych ostatnich badaniach klinicznych agregaty MSC były z powodzeniem wykorzystywane do regeneracji kompleksu miazga-zębina i przyzębia po implantacji do Uszkodzone ludzkie siekacze, które osiągnęły de novo regenerację tkanek o fizjologicznej strukturze i funkcji^20,21.

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę budowy i charakterystyki agregatów MSC, a także transplantacji in vivo. Takie podejście przyciągnie uwagę badaczy, którzy będą dążyć do naprawy ubytków w tkankach, takich jak zęby, kości, chrząstki i skóra, w oparciu o zastosowania komórek macierzystych. Ta metoda jest prosta, wygodna i całkowicie składa się z komórek i ECM bez dodatkowych rusztowań, które mogą być hodowane przez długi czas w celu uzyskania gęstych i stabilnych agregatów²². Tymczasem wyhodowane w ten sposób agregaty są bogate w ECM, który naśladuje rozwijającą się niszę dla tych komórek o dużej gęstości, a tym samym wspomaga regenerację tkanek²³. Proces budowy można podzielić na dwa etapy: przygotowanie i hodowlę komórek oraz samodzielne tworzenie i zbieranie agregatów komórkowych. Charakterystyka agregatów obejmuje identyfikację morfologiczną za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego i skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) oraz analizę histologiczną za pomocą hematoksyliny i eozyny (HE) oraz barwienia Massona. Powstałe agregaty zademonstrowano do implantacji regeneracyjnej w celu naprawy ubytku kości czaszki. Wdrożenie tej procedury pomoże w ustaleniu skutecznej strategii przeszczepów MSC dla inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.

Protocol

UWAGA: Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Czwartego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. W niniejszym badaniu wykorzystano kriokonserwowane ludzkie UCMSC, które uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Wykorzystanie komórek ludzkich zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną IV Wojskowego Uniwersytetu Medycznego. W celu opisania procedury jako przykład podano UCMSC. Ubytek czaszki został przyjęty jako przykład w celu ukazania potrzeby naprawy w celu opisania procedury implantacji. Wszystkie eksperymenty powtórzono trzykrotnie.

1. Budowa agregatów UCMSC

1. Przygotowanie i kultura UCMSC
   1. Dodaj 10 ml wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do nowej 15 ml probówki odśrodkowej w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   2. Wyjąć rurkę do zamrażania zawierającą zamrożone UCMSC z ciekłego azotu i szybko umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Delikatnie wstrząśnij probówką, aby ułatwić szybkie i dokładne rozmrożenie komórek.
      UWAGA: Cała procedura musi zostać zakończona w ciągu 1 minuty, ponieważ dimetylosulfotlenek (DMSO) w roztworze zamrażającym może powodować cytotoksyczność.
   3. Lekko zawiesić komórki w probówce zamrażającej i przenieść całą zawartość do probówki wirówkowej zawierającej 10 ml PBS (krok 1.1.1). Odwirować próbkę o masie 100 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 10 ml PBS.
   4. Odwirować próbkę o masie 100 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić komórki za pomocą kompletnej pożywki niezbędnej minimum alfa (α-MEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny i 584 mg/l glutaminy.
   5. Zasiej zawieszone komórki w 10-centymetrowych szalkach hodowlanych (często jedna do dwóch szalek na jedną probówkę, w zależności od całkowitej ilości komórek po odwirowaniu, o gęstości 5 × 10⁶ komórek na szalkę). Dodać kompletną pożywkę α-MEM do naczyń do całkowitej objętości 10 ml.
   6. Delikatnie potrząśnij naczyniami, aby rozprowadzić komórki. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w wilgotnej komorze. Po całonocnej inkubacji wyrzuć pożywkę sklarowaną nad osadem i dodaj 5 ml PBS 1-2x, aby usunąć nieprzylegające komórki. Dodać 10 ml świeżej, kompletnej pożywki α-MEM. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni.
   7. W przypadku pasażowania komórek, gdy komórki osiągną zbieżność 80%-90%, wyrzuć supernatant i umyj komórki 5 ml PBS, aby dokładnie usunąć pożywkę. Inkubować komórki w 2 ml 0,25% trypsyny-1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
   8. Kiedy komórki staną się okrągłe z przerwanymi połączeniami międzykomórkowymi pod mikroskopem, oddziel komórki od naczyń bez zbytniego naruszania struktury komórkowej. Zneutralizuj trypsynę, dodając 4 ml kompletnej pożywki α-MEM.
   9. Kilkakrotnie i delikatnie pobierać komórki z szalek, pipetując je w świeżej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować próbkę o masie 100 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki kompletną pożywką α-MEM i umieścić je w świeżych szalkach hodowlanych lub na płytkach studzienkowych. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni.
      UWAGA: W zależności od wielkości powierzchni defektu, defekt o wielkości 25^mm3 wymaga użycia studzienki składającej się z 6-dołkowych komórek płytkowych hodowanych w celu utworzenia agregatów.
2. Formowanie i zbiór kruszyw
   1. Przygotuj pożywkę indukującą agregację komórkową, dodając 50 μg/ml witaminy C do α-MEM z 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny i 584 mg/l glutaminy.
      UWAGA: Podczas stosowania witaminy C należy unikać bezpośredniej ekspozycji na światło, ponieważ witamina C utlenia się pod wpływem światła i staje się nieskuteczna.
   2. Gdy komórki w kroku 1.1.12 osiągną 95% konfluencji (rysunek uzupełniający S1), zmień pożywkę na pożywkę indukującą agregację komórek; zmieniaj świeżą pożywkę indukującą agregację komórek co 2 dni.
   3. Po 7-10 dniach indukcji (długość czasu indukcji zależy od typu komórek macierzystych i często wynosi ~7 dni dla krawędzi UCMSC), poszukaj pod mikroskopem ukształtowanych agregatów, z grubymi krawędziami oddzielonymi od dna naczynia.
   4. Wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie umyj komórki 2x PBS. Delikatnie popchnij agregaty od krawędzi do środka za pomocą małych sterylnych kleszczy, składając agregaty.
   5. W niektórych przypadkach UCMSC mogą spontanicznie zwijać się w kierunku środka, tworząc stałą kondensację. Struktura ta jest równoważna kruszywu otrzymanemu w kroku 1.2.4.

2. Identyfikacja morfologiczna agregatów

1. Obserwacja ogólna i mikroskopowa
   1. Zwróć uwagę, że agregaty są gęste i zintegrowane i nie ulegają łatwo uszkodzeniu przez siły mechaniczne, takie jak ciągnięcie podczas odrywania i przesadzania.
   2. Pod mikroskopem poszukaj struktury przypominającej błonę o określonej grubości z tkanym wzorem.
2. Barwienie żywych/martwych komórek
   1. Zasiać komórki na płytce 6-dołkowej o gęstości 1 × 10⁶ komórek na dołek.
   2. Przygotować 2 μM kalceinę AM i 4 μM roztwór roboczy EthD-1 i użyć PBS.
   3. Dodaj 0,3% trytonu do komórek przez 5 minut, przemyj PBS trzy razy, aby wywołać śmierć komórek, jako kontrolę barwienia.
   4. Dwukrotnie przemyj komórki, agregaty i komórki indukujące śmierć PBS.
   5. Dodać 100 μl PBS i 100 μl przygotowanego roztworu barwiącego w kroku 2.2.2 do każdej studzienki.
   6. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej tonacji. Przemyć próbkę dwukrotnie PBS.
   7. Dodać 200 μl 10 μg/ml Hoechst do każdej studzienki i inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dwukrotnie pobrać próbkę z PBS.
   8. Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.
3. Obserwacja SEM
   1. Wysiać i indukować komórkę agregatów otrzymanych w kroku 1.2.4 lub 1.2.5. Przemyć komórki PBS po uformowaniu agregatów w kroku 1.2.4. lub 1.2.5.
   2. Utrwalić komórki za pomocą aldehydu glutarowego przez co najmniej 4 godziny.
   3. Przemyć próbki PBS, a następnie odwodnić przez gradientowe stężenie etanolu od 30%, 50%, 70%, 80%, 90% do 100% każda przez 5 minut. Potraktuj 2x bezwodnym etanolem.
   4. Zanurzyć agregaty w 3 ml heksametylodilazanu na 30 minut. Odessać cały płyn i naturalnie dokładnie wysuszyć próbki.
      UWAGA: Cały proces musi być przeprowadzony w dygestorium, ponieważ heksametylodilazan jest lotny i wysoce toksyczny.
   5. Wysuszone próbki przyklej do stołu z próbkami za pomocą dwustronnej taśmy węglowej i pokryj powierzchnię metalem. Próbkę należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez kilka dni.
   6. Obserwuj pod SEM.
      1. Wymień próbkę wewnątrz urządzenia. Ustaw napięcie maszyny na 5 k, a ogniskową na ~12 mm. Reguluj pasek ostrości, aż pojawi się wyraźny obraz.
      2. Rób zdjęcia w małym powiększeniu. Dostosuj powiększenie i ponownie ustaw ostrość, aby uzyskać obraz o większym powiększeniu.
         UWAGA: Powierzchni agregatów nie można dotykać przed obserwacją, aby uniknąć zniszczenia morfologii powierzchni.

3. Analiza histologiczna agregatów

1. Utrwalanie i dzielenie próbek na sekcje
   1. Utrwalić kruszywa otrzymane w kroku 1.2.4 lub 1.2.5 za pomocą 4% paraformaldehydu w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny. Po utrwaleniu przemyć PBS i umieścić próbkę na noc w kasetach do zatapiania, aby spłukać bieżącą wodą.
   2. Odwodnić próbki za pomocą automatycznych maszyn do odwadniania za pomocą gradientowego etanolu, ksylenu i parafiny, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Cały proces wygląda następująco: 85% etanol przez 2 h w RT, 95% etanol przez 2 h w RT, 95% etanol przez 2 h w RT, 100% etanol przez 2 h w RT, 100% etanol przez 1,5 h w RT, ksylen przez 45 min w RT, ksylen przez 45 min w RT, parafina przez 30 min w RT, parafina przez 1,5 h w temperaturze pokojowej, a na końcu parafina przez 2 h w temperaturze 60 °C.
   3. Zanurzyć próbki w parafinie. Przygotować skrawki o grubości około 5 μm, przykleić je do szkiełek kationowych i suszyć przez 2 godziny w temperaturze 45 °C.
   4. Odparafinować sekwencyjnie przez ksylen przez 15 minut, dwa razy i 100%, 90%, 80% i 70% etanolu (każdy przez 5 minut).
   5. Szkiełka należy powoli płukać 3x pod bieżącą wodą przez 5 min.
2. Barwienie HE
   1. Plamić hematoksyliną przez 3-5 minut, spłukać wodą i ostrożnie usunąć nadmiar płynu wokół tkanki.
   2. Frakcjonować etanolem zawierającym 1% kwasu solnego przez 3-5 s i spłukiwać bieżącą wodą, podczas czego kolor staje się nieco jaśniejszy i niebieski. Usuń nadmiar wody wokół tkanki.
   3. Plamić eozyną przez 1 minutę, spłukać bieżącą wodą i usunąć nadmiar płynu wokół tkanki.
   4. Odwodnić 70%, 80%, 90% i 100% etanolem przez 10 s każdy, ksylenem przez 15 minut, dwa razy i wysuszyć naturalnie w dygestorium przed uszczelnieniem arkusza.
   5. Dodaj neutralne krople żywicy i uszczelnij szkiełka nakrywkowe. Obserwuj pod mikroskopem świetlnym.
3. Barwienie trichromowe Massona
   1. Plamić żelazną hematoksyliną Weigerta przez 5 minut, spłukać wodą i wytrzeć do sucha.
   2. Frakcjonować etanolem zawierającym 1% kwasu solnego przez 3-5 s i spłukiwać bieżącą wodą, podczas czego kolor staje się nieco jaśniejszy i niebieski. Wytrzyj powierzchnię do sucha.
   3. Zabarwić czerwonym kwaśnym roztworem magenty Lixin przez 5-10 minut i szybko spłukać wodą destylowaną.
   4. Traktować wodnym roztworem kwasu fosfomolibdynowego przez 3-5 minut.
   5. Bezpośrednio ponownie zabarwić roztworem błękitu anilinowego przez 5 minut bez mycia wodą.
   6. Traktować 1% lodowatym kwasem octowym przez 1 minutę.
   7. Odwodnić 70%, 80%, 90% i 100% etanolem przez 10 s każdy, ksylenem przez 15 minut, dwa razy i wysuszyć naturalnie w dygestorium przed uszczelnieniem arkusza.
   8. Dodaj neutralne krople żywicy i uszczelnij szkiełka nakrywkowe. Obserwuj pod mikroskopem świetlnym.

4. Implantacja

1. Znieczulić nagą mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 50 mg/kg pentobarbitalu sodu.
   UWAGA: Upewnij się, że myszy są odpowiednio znieczulone w oparciu o brak odruchu rogówkowego i reakcji kończyn po ściśnięciu opuszki stopy. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.
2. Wytnij poprzeczne nacięcie (~3-4 cm) w skórze za uszami nagiej myszy sterylnymi małymi nożyczkami po dezynfekcji jodoforem.
3. Pociągnij skórę do przodu, aby odsłonić czaszkę. Lekko narysuj krawędzie planowanego obszaru ubytku ostrzem 11# i usuń fragment kości. Obszar wady jest okrągłym obszarem o średnicy około 4 mm. Użyj soli fizjologicznej, aby przepłukać ranę i zapewnić odpowiednią hemostazę.
4. Zanurzyć kruszywa otrzymane w kroku 1.2.5 lub 1.2.6 w sterylnej gazie w celu wchłonięcia wilgoci powierzchniowej przed implantacją. Umieść kruszywa w tym obszarze i lekko zwiększ ciśnienie, aby wypełnić ubytek.
5. Po pociągnięciu wymień skórę, aby upewnić się, że implant jest zamocowany. Zamknij nacięcie za pomocą szwów 1/2, 4 × 10 kątowych i szwów 4-0.
6. Po zabiegu ułóż zwierzęta na kocu rozgrzewającym, aż będą aktywne, a następnie włóż je z powrotem do klatki.
   UWAGA: Zwierzęta nie mogą być pozostawione bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Zwierzęta, które przeszły operację, nie są zwracane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.

Results

Agregaty mogą być z powodzeniem konstruowane z UCMSC zgodnie z eksperymentalnym przepływem pracy (Rysunek 1). Jakość kruszyw musi być oceniona przed użyciem, poprzez obserwację morfologiczną i analizę histologiczną. Utworzona struktura blaszkowata powinna być kompletna i gęsta, z komórkami przeplatającymi się, tworząc utkany wzór na podstawie obserwacji mikroskopowej (Rysunek 2A). Zawijanie krawędzi można wykryć podczas agregacji; nadmiernie wywinięte krawędzie w...

Discussion

Dzięki postępom w biotechnologii inżynierii tkankowej, wielu naukowców skupiło się na strategiach konstruowania wszczepialnej struktury o wysokiej plastyczności i zawierającej długotrwałe komórki, które mogą osiągnąć optymalną regenerację. Obecnie istnieje wiele metod implantacji MSC, takich jak metody oparte wyłącznie na komórkach, rusztowania uzupełnione cytokinami ^6,24 lub połączenie komórek macierzystych i rusztowań⁵. W artykule przeds...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Trypsyna-EDTA (1x)	Sigma	T4049	Pasaż komórkowy
Automatyczna maszyna do odwadniania	LEICA	ASP200s	Odwadnianie agregatu
	Eppendorf	5418R	Wirówka
	Thermo Nunc	339650	Naczynie do kultur wirowania
	Thermo	150466	Kultura UCMSC
Etanol	SCR	10009218	Agregat odwadniający
Śmiertelna surowica bydlęca	Sijiqing	11011-8611	Kultura UCMSC
Kleszcz	JZ	JD1080	Agregat żniwny
Aldehyd glutarowy	Proandy	10217-1	Utrwalanie agregatu
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny	beyotime	C0105S	Barwienie HE
Heksametyldisilazan	SCR	80068416	Sucha powierzchnia kruszywa
Hoechst33342	Sigma	14533	Barwienie jąder komórkowych
L-glutamina	Sigma	G5792	Hodowla UCMSC
Żywa/martwa Żywotność/Cytotoksyczność Zestaw	Invitrogen	L3224	Barwienie żywych/martwych komórek
Zestaw do barwienia Massona	ZHC	CD069	Barwienie
Masson Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Kultura UCMSC
Parafina	Leica	39601006	Osadzanie tkanek
Paraformaldehyd	Saint-Bio	D16013	Utrwalanie kruszywa
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Ponowne zawieszenie i oczyszczanie UCMSC
Penicylina/Streptomycyna	Procell Nauki przyrodnicze	PB180120	Kultura UCMSC
Pentobarbital sodu	Sigma	P3761	Znieczulenie zwierząt
Polysporin	Pfizer		Zapobiegaj wysuszeniu oczu
Skaningowy mikroskop elektronowy	Hitachi	s-4800	Obserwacja SEM
Nożyczki	JZ	Y00030	Nacięcie chirurgiczne dla zwierząt
Płytka sześciodołkowa	Thermo	140675	Kultura UCMSC
Ścieg	Jinhuan	F603	Zamknij rany
Szew	Xy	4-0	Zamknij rany
Sprzęt termostatyczny	Grant	v-0001-0005	Kąpiel wodna
UCMSC	Bai'ao& nbsp;	UKK220201	Komercyjnie UCMSC
Witamina C	Diyibio	DY40138-25g	Agregat indukujący
ksylen	SCR	10023418	Kruszywo odwadniające