Artykuł metodologiczny

Analiza i obrazowanie osteocytów

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64699

⸱

29 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Science and Engineering, University of Missouri-Kansas City, 2Department of Oral and Craniofacial Sciences, School of Dentistry, University of Missouri-Kansas City

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia metodę wizualizacji i rozwoju trójwymiarowych (3D) modeli osteocytów w sieci lacunarno-kanalicznej (LCN) do analizy obliczeniowej dynamiki płynów (CFD). Wygenerowane modele wykorzystujące tę metodę pomagają zrozumieć mechanosensację osteocytów w zdrowych lub chorych kościach.

Streszczenie

Osteocyty to komórki kostne, które reagują na mechaniczne obciążenia i naprężenia ścinające przepływ płynów (FFSS) poprzez aktywację różnych szlaków biologicznych w procesie znanym jako mechanotransdukcja. Konfokalne modele sieci osteocytów oparte na obrazach konfokalnych są cennym narzędziem do przeprowadzania analiz obliczeniowej dynamiki płynów (CFD) w celu oceny naprężeń ścinających na błonie osteocytów, których nie można określić za pomocą bezpośredniego pomiaru. Modelowanie obliczeniowe z wykorzystaniem tych obrazów mikrostrukturalnej architektury kości o wysokiej rozdzielczości wykorzystano do numerycznej symulacji obciążenia mechanicznego wywieranego na kość i zrozumienia stymulacji osteocytów wywołanej obciążeniem.

To badanie omawia metody tworzenia modeli 3D pojedynczych osteocytów przy użyciu obrazów mikroskopu konfokalnego sieci lacunarno-kanałowej (LCN) do przeprowadzania analizy CFD przy użyciu różnych programów do modelowania obliczeniowego. Przed mikroskopią konfokalną kości myszy są cięte i barwione barwnikiem izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w celu oznaczenia LCN. Przy 100-krotnej rozdzielczości obrazy stosu Z są zbierane za pomocą mikroskopu konfokalnego i importowane do oprogramowania MIMICS (oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3D) w celu skonstruowania modelu powierzchniowego LCN i procesów osteocytyczno-dendrytycznych.

Te powierzchnie są następnie odejmowane za pomocą operacji Boole'a w oprogramowaniu 3-Matic (oprogramowanie do optymalizacji danych 3D) w celu modelowania lakunarnej przestrzeni płynowej wokół ciała komórki osteocytów i przestrzeni kanałowej wokół dendrytów zawierających fluid. 3D objętościowej geometrii płynu jest importowana do oprogramowania ANSYS (oprogramowanie symulacyjne) do analizy CFD. ANSYS CFX (oprogramowanie CFD) służy do przykładania obciążenia fizjologicznego kości w postaci ciśnienia płynu, a także określa naprężenia ścinające ścianę osteocytów i procesy dendrytyczne. Morfologia LCN wpływa na wartości naprężeń ścinających wyczuwane przez błonę komórkową osteocytów i procesy komórkowe. W związku z tym szczegółowe informacje na temat opracowywania modeli opartych na obrazach konfokalnych mogą być cenne w zrozumieniu mechanosensacji osteocytów i mogą stanowić podstawę dla przyszłych badań w tej dziedzinie.

Wprowadzenie

Postulatuje się, że osteocyty regulują masę kostną w odpowiedzi na ćwiczenia fizyczne1. Deformacja błony osteocytów i ich procesy dendrytyczne spowodowane obciążeniem mechanicznym poddaje je działaniu FFSS, który jest wykrywany przez osteocyty i wyzwala sygnalizację wewnątrzkomórkową2,3,4. Mikrostruktura kości ulega pogorszeniu lub zmianom w morfologii lacunarno-kanalicznej z powodu starzenia się lub chorób kości, takich jak osteoporoza i cukrzyca, oraz w stanach takich jak niedobór perlekanu, który powoduje upośledzenie reakcji mechanicznej osteocytów5,6. Te zmiany w architekturze kości powodują, że osteocyty doświadczają różnych poziomów FFSS i szczepów7,8. Co ważne, FFSS doświadczane przez osteocyty w odpowiedzi na obciążenie mechaniczne jest trudne do ilościowego określenia in vivo, ponieważ są one osadzone w zwapniałej macierzy kostnej.

Modelowanie oparte na obrazie konfokalnym to potężna technika pozwalająca przezwyciężyć ograniczenia związane z badaniem niedostępnych osteocytów w ich naturalnym środowisku poprzez replikację modeli komputerowych klasy LCN9,10. Przetwarzanie i modelowanie połączonej sieci LCN w 3D było wyzwaniem. Istnieje kilka technik obrazowania, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM), szeregowe wycinanie powierzchni bloku i seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa z skupioną wiązką jonów (FIB/SEM)2,11,12. Opracowano cenną technikę wizualizacji bone13,14,15 i generowania modeli osteocytów 3D za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). CLSM został tutaj wybrany do modelowania komputerowego, a nie do innych technik obrazowania, ze względu na jego zdolność do obrazowania całej objętości luki i większości kanalików w 3D16,17. Geometrię LCN można wygenerować za pomocą CLSM do analizy elementów skończonych osteocytów (MES) w celu przewidywania naprężeń kości. Jednak analiza płynów w celu przewidywania FFSS doświadczanych przez osteocyty jest bardziej skomplikowana, ponieważ wymaga modelowania błony komórkowej osteocytu i jego dendrytów w LCN, aby umożliwić modelowanie wąskiej przestrzeni lacunarno-kanalicznej, w której porusza się płyn śródmiąższowy18.

W tym protokole, barwnik izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) jest nakładany na nieodwapnione grube odcinki kości przed mikroskopią konfokalną w celu oznaczenia LCN wewnątrz kości, a błony osteocytyczno-dendrytyczne są modelowane na podstawie danych obrazowych z LCN. Przestrzeń jeziorno-kanałowa jest symulowana za pomocą modelowania obliczeniowego, a obciążenie fizjologiczne spowodowane aktywnością fizyczną jest modelowane przy użyciu podejścia CFD. Osteocyty są poddawane gradientowi ciśnienia płynu w oprogramowaniu CFD w celu analizy profilu płynu wewnątrz LCN i pomiaru FFSS na osteocytach i błonach dendrytycznych. Co więcej, podejście MES może mierzyć odkształcenia lub naprężenia osteocytów poprzez zastosowanie ściskającego obciążenia mechanicznego.

Technika modyfikacji geometrii została również opracowana w celu modyfikacji mikrostruktur pochodzących z obrazów młodych, zdrowych kości w celu symulacji zmienionej morfologii lacunarno-kanalikowej u zwierząt w podeszłym wieku lub tych z chorobami kości. Zmiany w mikrostrukturze kości obejmowały zmniejszenie liczby kanalików wraz ze starzeniem się, zmniejszenie obszaru przestrzeni lacunarno-kanalicznej w celu modelowania tego, co dzieje się w niedoborze perlekanu i zwiększenie go w celu modelowania efektów starzenia, oraz zmniejszenie obszaru ściany kanałowej i dendrytycznej w celu modelowania kości cukrzycowej5,6. Technika modyfikacji geometrii pozwala nam porównać FFSS doświadczane przez osteocyty w kościach o różnych mikrostrukturach, takich jak młode i starsze lub kości u zdrowych i chorych zwierząt.

Ogólnie rzecz biorąc, modelowanie oparte na obrazie konfokalnym jest cennym narzędziem do symulacji morfologii osteocytów w zdrowej kości, jak również zmian w morfologii osteocytów związanych ze starzeniem się/chorobami. Ponadto parametry morfologiczne osteocytów, takie jak powierzchnia i objętość przestrzeni lacunarno-kanalikowa, mogą być mierzone i porównywane w różnych kościach w celu przewidywania odpowiedzi komórkowych na obciążenie mechaniczne.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Missouri, Kansas City (UMKC) i były zgodne z odpowiednimi wytycznymi federalnymi.

1. Proces przygotowania kości

  1. Zbierz kości udowe od 4-miesięcznych i 22-miesięcznych samic myszy C57BL6 i utrwal je w zimnym 4% paraformaldehydzie w PBS przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z delikatnym kołysaniem, a następnie spłucz je w PBS i przechowuj w 70% etanolu przed zatopieniem.
    UWAGA: Objętość utrwalacza powinna być około 20 razy większa od objętości tkanki
  2. Szybko osadź kości w szybko polimeryzującym akrylu (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Ważne jest, aby na tym etapie użyć żywicy szybko polimeryzującej (~10 min). Celem jest podparcie tkanki kostnej podczas cięcia za pomocą piły diamentowej, ale bez wnikania żywicy do LCN, co zablokowałoby wnikanie barwnika FITC.
  3. Wytnij grube poprzeczne plastry o grubości 300 μm ze znormalizowanego miejsca nad trzecim krętarzem za pomocą piły diamentowej i przechowuj je w temperaturze 4 °C w 70% etanolu przed barwieniem FITC.
  4. Wypolerować sekcje papierem ściernym o ziarnistości 600, 800, a następnie 1200 do końcowej grubości ~90-100 μm.
    UWAGA: Uzyskanie odpowiedniej grubości zostało zapewnione za pomocą suwmiarki cyfrowej.
  5. Opłucz sekcje w 70%, 95% i 100% etanolu przez 5 minut każda.
  6. Zabarwić je w 1% FITC w 100% etanolu przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności z umiarkowanym wstrząsaniem.
  7. Umyj sekcje w 100% etanolu przez 30 minut, delikatnie potrząsając w ciemności. Następnie wysusz je na powietrzu przez noc w ciemności.
  8. Aby zamontować, umieść sekcję w kropli nośnika montażowego na szklanym szkiełku mikroskopowym. Użyj kleszczyków, aby ustawić sekcję tak płasko, jak to możliwe względem szkiełka, unikając generowania pęcherzyków powietrza i używając otaczającej żywicy do manipulowania próbką. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na próbce.

2. Mikroskopia konfokalna

  1. Użyj mikroskopu konfokalnego do obrazowania wycinków kości barwionych FITC.
  2. Użyj obiektywu olejowego 1,44NA o powiększeniu 1,44 μm i rozmiarze kroku 0,126 μm, aby zebrać szczegółowe stosy Z 400 płaszczyzn Z w rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli i 0,089 μm.
  3. Do wzbudzenia należy użyć lasera o długości fali 488 nm z oknem odbioru emisji 496-596 nm. Zbierz stosy obrazów przy użyciu ustawień kompensacji, aby skorygować utratę sygnału wraz ze wzrostem głębokości obrazowania.
  4. Zwiększ dokładność i rozdzielczość obrazów, korzystając z technik zbierania obrazów, takich jak nadpróbkowanie i zwiększone uśrednianie linii. Zbierz również obrazy z rozdzielczością 5x, 20x i 100x przekrojów poprzecznych odcinków kości udowej, jak pokazano w Rysunek 1.
    UWAGA: Obraz o niskiej rozdzielczości (5x) w Rysunek 1 pokazuje pełny obszar przekroju kości udowej, z trzema obszarami wybranymi dla 100-krotnego pola obrazowania.
  5. Użyj 100x Z-stacks do komputerowego modelowania osteocytów.

3. Modelowanie komputerowe

  1. Zaimportuj zebrane obrazy 100x w formacie TIFF do oprogramowania ImageJ, aby zbudować sekwencję obrazów LCN w kierunku Z.
  2. Zaimportuj stosy Z do oprogramowania do przetwarzania obrazów 3D, aby skonstruować maskę LCN po zdefiniowaniu orientacji obrazu.
  3. Oryginalny obraz z młodych i starszych myszy przedział odpowiednio między 30 012-45 677 jednostkami Hounsfielda i 15 000-46 701 jednostkami Hounsfield, aby jak najbardziej przypominał LCN. Dostosuj Próg w menu sekcji, aby zmienić limity intensywności pikseli dla uwzględnienia w masce.
  4. Przytnij jedną lukę wraz z kanalikami jako obszar zainteresowania (ROI) ze stosu za pomocą operacji Crop Mask. Zdefiniuj ROI tak, aby otaczał lukę w środku sześcianu, a wszystkie połączone z nim kanaliki rozciągały się na boki sześcianu. Zamknij lukę w wyimaginowanym większym sześcianie o długości boków 21 μm, 14 μm i 19 μm.
  5. Ponieważ model jest tworzony z wielu części, wykonaj operację powiększania regionu, aby wybrać połączone obszary pikseli, usunąć szum i usunąć plamki, aby wygenerować jednolity LCN.
  6. Przekształć maskę lacunarno-kanalikową w obiekt za pomocą operacji Część obliczeniowa w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów 3D.
  7. Zbuduj osteocyty i błony dendrytyczne, zmniejszając objętość LCN za pomocą operacji wygładzania. Wykonaj tę operację kilka razy, aby uzyskać grubość przestrzeni lakunarnej i kanałowej odpowiednio 0,75 μm i 0,08 μm9,18.
  8. Wyeksportuj obiekty (format STL) jako ostatni krok w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów 3D.
  9. Zaimportuj dwie warstwy LCN i błony osteocytytowo-dendrytyczne do oprogramowania do optymalizacji danych 3D, aby wygenerować siatkę objętości.
  10. Użyj narzędzia Kreator naprawy w oprogramowaniu, aby zidentyfikować problemy z siatką w każdej części. Sprawdź jakość siatki w sekcji diagnostycznej Kreatora naprawy po każdej operacji.
  11. Usuń odwrócone normalne części, przecinające się trójkąty i uszkodzone kontury za pomocą operacji Auto-Fix w Kreatorze naprawy.
  12. Zastąp nakładające się trójkąty ręcznie, definiując nowe lub automatycznie za pomocą operacji Wypełnij otwór Normalny.
  13. Popraw jakość siatki, korzystając z operacji, takich jak filtrowanie ostrych trójkątów, małych krawędzi i małych skorup.
  14. Po poprawie jakości siatki połącz dwie powierzchnie LCN i błony osteocytyczno-dendrytyczne w jedną powierzchnię (lacunarno-kanalikową przestrzeń płynną), która należy do obu części, za pomocą zespołu bez kolektora.
  15. Utwórz model wolumetryczny przestrzeni lacunarno-kanałowej za pomocą operacji Remesh, a następnie wyeksportuj go jako plik STL. Dostosuj skalę obiektu tak, aby była wyrażona w mikrometrach w sekcji eksportu.

4. Technika modyfikacji geometrii w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów 3D i oprogramowaniu do optymalizacji danych 3D

UWAGA: Technika modyfikacji geometrii jest używana do modelowania zmian w morfologii osteocytów, takich jak gęstość i średnica kanałów oraz grubość kanalików jeziornych spowodowanych starzeniem się lub chorobami kości.

  1. Wybierz młody osteocyt jako model podstawowy i zmodyfikuj go, aby zbudować inne odrębne modele osteocytów, stosując zmiany morfologiczne.
  2. Wygeneruj model osteocytów o różnej gęstości kanałów w stosunku do modelu podstawowego, zmieniając progi obrazu w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów 3D.
    1. Wybierz niższy próg, aby zmniejszyć natężenie światła na obrazie i uzyskać lukę z mniejszą liczbą kanalików. Zaletą techniki progowania jest to, że kształt i rozmiar luki pozostaje taki sam, a badany jest tylko wpływ gęstości kanałów. Rysunek 2 pokazuje symulowany model wieku wygenerowany z młodego osteocytu przy użyciu techniki modyfikacji geometrii.
  3. Opracuj modele osteocytów o różnych grubościach przestrzeni jeziorno-kanałowej lub średnicach dendrytów/kanałów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów 3D i oprogramowaniu do optymalizacji danych 3D. Buduj większe lub mniejsze modele osteocytów, odpowiednio wykonując operacje owijania lub wygładzania. Rysunek 3 pokazuje sześć modeli osteocytów ze zmienioną geometrią, które powstały z młodego osteocytu.

5. Analiza CFD

UWAGA: Po wygenerowaniu wolumetrycznych modeli osteocytów, w module CFX oprogramowania symulacyjnego przeprowadza się kilka kroków, w tym geometrię, siatkę i konfigurację.

  1. Utwórz przepływ płynu w oprogramowaniu symulacyjnym, aby przygotować modele do analizy CFD.
  2. Zaimportuj opracowane geometrie oparte na obrazach konfokalnych do sekcji geometrii CFX, znanej jako ANSYS SpaceClaim (narzędzie do modelowania 3D). Ustaw wymiary jednostki na nanometry w ustawieniu.
  3. Geometria jawi się jako dwa aspekty LCN i procesów osteocytowo-dendrytycznych. Kliknij Fasetkę w górnym menu i usuń błędy geometryczne, takie jak przecięcia, ostre lub nadmiernie połączone krawędzie oraz wierzchołki, otwory lub otwory dla każdej fasety.
  4. Kliknij Odejmij w menu Faseta, aby zredukować mniejszy aspekt i procesy osteocytyczno-dendrytyczne z większego aspektu, LCN, aby uzyskać pojedyncze ciało przestrzeni lacunarno-kanałowej. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wygenerowaną fasetę i przekonwertuj ją z fasetek na domenę bryłową bez scalania powierzchni. Rysunek 4 przedstawia obszar przekroju poprzecznego modelu młodego osteocytu, który reprezentuje przestrzeń lacunarno-kanalikową.
  5. Kliknij siatkę i wybierz liniowe elementy czworościenne o rozmiarze elementu 0,06 μm. Udoskonal siatkę za pomocą badania zbieżności siatki, aby mieć wystarczającą liczbę elementów w maleńkim systemie dendrytycznym, aby zapewnić, że wyniki są niezależne od rozmiaru siatki.
  6. Wybierz powierzchnię i wybierz kanaliki na górnej stronie wyimaginowanego sześcianu jako wloty płynów. Zaznacz kanaliki na pozostałych pięciu ścianach jako wyloty płynu za pomocą opcji Wybór ramki.
  7. Wyeksportuj siatkę (płynny format pliku), ponieważ ładuje się szybciej w konfiguracji w następnym kroku.
  8. Utwórz kolejny przepływ płynu w oprogramowaniu symulacyjnym i zaimportuj płynną siatkę do sekcji ustawień CFX. Zdefiniuj dwa warunki brzegowe wlotów i wylotów dla powierzchni wstępnie wybranych jako wloty/wyloty za pomocą opcji Wstaw obwiednię.
  9. Aby imitować warunki fizjologiczne, należy wywierać ciśnienie wlotowe płynu wynoszące odpowiednio 300 Pa i 0 Pa na wlotach i wylotach19,20. Pozostałe powierzchnie należy traktować jako ściany w stanie antypoślizgowym w tym płynie, który ma zerową prędkość na styku ścian. Płyn przepływa z wlotów wokół dendrytów i korpusu komórki osteocytów i wychodzi z innych kanalików przypisanych jako ujścia.
  10. Traktuj śródmiąższowy płyn laminarny jako water9, wybrany z biblioteki materiałów. W sekcjach Przenikanie ciepła, Spalanie i Promieniowanie cieplne należy ustawić wartość Brak, ponieważ w problemie nie zdefiniowano wymiany ciepła. Wybierz tryb turbulencji jako charakterystykę płynu w LCN, który jest płynem laminarnym9.
  11. Uruchom oprogramowanie, używając podwójnej precyzji i startu bezpośredniego jako typu przesyłania. Monitoruj masę i pęd, aż resztki spadną i staną się stałe. Po konwergencji rozwiązania zmierz dane FFSS za pomocą sekcji CFD-post w oprogramowaniu CFD.

6. Przetwarzanie końcowe CFD

  1. Aby zobrazować FFSS doświadczany przez osteocyty i ich dendryty, wstaw nowy kontur w sekcji wyników oprogramowania CFD. Utwórz kontur FFSS, wybierając ścinanie ścian na błonach osteocytów-dendrytycznych jako zmienną w domenie.
    UWAGA: Aby lepiej pokazać wysoki FFSS na membranach dendrytycznych, zakres FFSS jest ustawiony na Określony przez użytkownika, aby zmodyfikować wartości minimalne/maksymalne FFSS.
  2. Wstaw prędkość, usprawnia kontur wewnątrz domeny lacunarno-kanalikowa, zaczynając od wlotów. Ustaw próbkowanie na równomierne rozłożenie i wybierz liczbę punktów jako 2500. Sekcja animacji w oprogramowaniu CFD dokładnie pokazuje w 3D, w jaki sposób cząsteczki płynu przepływają w przestrzeniach lacunarno-kanałowych za pomocą wykresu opływu prędkości.
  3. Użyj narzędzia Kalkulator funkcji w oprogramowaniu CFD do analizy wielkości FFSS lub prędkości na podstawie parametrów geometrycznych, zwłaszcza tam, gdzie istnieją różne modele osteocytów (tj. młody vs. stary). Zmierz objętość i pole powierzchni przestrzeni lacunarno-kanalicznej jako parametry geometryczne wraz z maksymalnymi, minimalnymi lub średnimi wartościami FFSS.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje sposób opracowania modeli osteocytów opartych na obrazowaniu konfokalnym w celu zbadania wartości naprężeń ścinających wywołanych przepływem płynu, którym poddawany jest osteocyt i jego wypustki dendrytyczne w wyniku obciążenia mechanicznego. W celu stworzenia modeli osteocytów opartych na obrazach konfokalnych wybrano myszy szczepu C57BL6 w wieku młodym oraz podzespołowym. Sześć innych symulowanych modeli osteocytów wygenerowano z tego samego modelu młodego osteocytu, stosując technikę modyfikacji geometrii, aby zbadać zmiany morfologii LCN wynikające ze starzenia się lub chorób kostnych. Modyfikowane parametry geometryczne obejmowały grubość lakunarno-kanalikularną, gęstość kanalików oraz ich średnicę. Zmodyfikowane modele osteocytów opracowano poprzez zmianę jednego parametru na raz, przy zachowaniu pozostałych parametrów bez zmian. Dzięki temu wpływ każdego z parametrów morfologicznych na FFSS został zbadany w izolacji. Wyniki wykazały, że wartość FFSS doświadczana przez osteocyt różniła się w tych modelach, co wskazuje na zależność FFSS od morfologii LCN. Wartości FFSS przewidziano dla różnych części modelu osteocytu, takich jak ciało komórki osteocytu lub błony dendrytyczne. Dendryty we wszystkich modelach wykazały wyższe wartości FFSS niż błona ciała komórki osteocytu.

Rysunek 5 przedstawia kontury FFSS dla modeli młodych i starych osteocytów wygenerowanych bezpośrednio ze stosów obrazów konfokalnych FITC oraz sześciu innych modeli osteocytów opracowanych na podstawie Modelu 1 przy użyciu techniki modyfikacji geometrii. Średnia wartość FFSS na błonach osteocytów i dendrytów w modelu młodego osteocytu (Model 1) wyniosła 0,42 Pa, co jest wartością istotniejszą niż średnia wartość FFSS wynosząca 0,13 Pa w modelu starego osteocytu (Model 2). Uzyskane dane wykazują wzrost średniego FFSS w osteocytach z większą przestrzenią lakunarno-kanalikową (Model 7 i Model 8) oraz spadek FFSS w osteocytach o niższej gęstości kanalików (Model 3 i Model 4), podczas gdy FFSS nie zmienił się znacząco przy zmianie średnicy dendrytu w Modelu 5 i Modelu 6. Model 2 i Model 4 miały najniższe wartości FFSS, odpowiednio 0,19 Pa i 0,13 Pa. Wartość FFSS w Modelu 8 jest większa niż w pozostałych modelach osteocytów. W Modelu 8 nie tylko większość dendrytów jest zaznaczona kolorem czerwonym, ale ciało komórki osteocytu również podlega wyższemu FFSS niż w innych modelach.

FFSS doświadczany przez osteocyty przedstawiono również w oparciu o objętość i powierzchnię przestrzeni lakunarno-kanalikowej, które uzyskano poprzez postprocessing w programie ANSYS CFX, aby zbadać korelację między FFSS a zmienioną strukturą LCN. Można było również zmierzyć powierzchnię każdego modelu wystawionego na działanie FFSS większego niż 0,8 Pa, co uznaje się za poziom FFSS powodujący tworzenie kości21,22. Modelowanie osteocytów wykazało korelację między średnim FFSS a objętością lub powierzchnią przestrzeni lakunarno-kanalikowej dla wszystkich modeli osteocytów, co przedstawiono w Tabeli 1. Osteocyt starzejący się (Model 2) oraz symulowany osteocyt w średnim wieku (Model 4) o najniższej gęstości kanalików miały najmniejszą powierzchnię lakunarno-kanalikową wynoszącą odpowiednio 1372,7 µm2 i 1122,6 µm2. Model 2 i Model 4 charakteryzowały się również najmniejszą objętością przestrzeni lakunarno-kanalikowej, wynoszącą odpowiednio 229,4 µm3 i 203,5 µm3, co można powiązać z niskimi wartościami FFSS. Model 6, o największej średnicy dendrytów, miał największą powierzchnię lakunarno-kanalikową. Model 8 charakteryzował się największą objętością przestrzeni lakunarno-kanalikowej oraz najwyższymi wartościami FFSS.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przy powiększeniu 5x, 20x, 100x; analiza struktury komórkowej.
Rysunek 1: Pojedyncze obrazy konfokalne z jednej płaszczyzny Z przekroju poprzecznego kości udowej barwionej FITC, wykonane przy użyciu obiektywów olejowych 5x, 20x i 100x. Sieć lakunarno-kanalikularna jest widoczna na obrazie wykonanym obiektywem 100x. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat morfologii osteocytów, porównanie młodych i starych, pokazujące różnice w strukturze komórek.
Rysunek 2: Modele oparte na obrazowaniu konfokalnym młodego (Model 1) i starego (Model 2) osteocytu, opracowane na podstawie barwionej FITC kości udowej 4-miesięcznej i 22-miesięcznej myszy C57BL6. Powiększony obraz przedstawia grubość układu lakunarno-kanalikularnego (LC) dla młodego osteocytu oraz analogicznie dla osteocytu starego. Obraz Modelu 1 został zmodyfikowany za zgodą Niroobakhsh i wsp.23. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Symulowane modele osteocytów, wariacje średnicy dendrytów i grubości przestrzeni lakunarno-kanalikularnej, schemat.
Rycina 3: Sześć modeli osteocytów opracowanych na podstawie Modelu 1 przy użyciu techniki modyfikacji geometrii. Zredukowano gęstość kanalikularną w celu stworzenia Modelu 3 (symulacja wieku średniego) i Modelu 4 (symulacja starzenia), podczas gdy średnica dendrytów i grubość LC pozostały takie same jak w Modelu 1. Model 5 i Model 6 opracowano z taką samą gęstością kanalikularną i grubością LC jak w Modelu 1, natomiast średnica ich dendrytów była odpowiednio dwu- i czterokrotnie większa niż w Modelu 1. Model 7 i Model 8 posiadały odpowiednio dwu- i czterokrotnie większą grubość lakunarno-kanalikularną, podczas gdy gęstość kanalikularna i średnica dendrytów pozostały takie same jak w Modelu 1. Obraz Modelu 1 został zmodyfikowany za zgodą Niroobakhsh i wsp.23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat struktury komórki; wizualizacja błony; obraz mikroskopowy; model biologii komórkowej.
Rysunek 4: Trójwymiarowy model młodego osteocytu opracowany na podstawie obrazowania konfokalnego. Widok 3D przekroju modelu młodego osteocytu opartego na obrazowaniu konfokalnym, przedstawiający modelowanie przestrzeni lakunarno-kanalikularnej, wykorzystywanej do analizy przepływu płynów wokół osteocytu i dendrytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat modeli osteocytów; obrazowanie konfokalne, symulacja z modyfikacją geometrii; rozkład naprężeń.
Rycina 5: Rozkład FFSS dla wszystkich modeli osteocytów wykazuje zależność wartości FFSS od morfologii osteocytu. Obszary czerwone wskazują najwyższe wartości FFSS, szczególnie na błonach dendrytycznych, a nie na ciele komórki osteocytu. Obraz został zmodyfikowany za zgodą Niroobakhsh i wsp.23. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

ModelePowierzchnia lakunarno-kanalikowa (µm2)Objętość przestrzeni lakunarno-kanalikowej (µm3)Śr. FFSS (Pa)
Modele osteocytów oparte na obrazowaniu konfokalnymModel 12652.92610.42
Młode (4-miesięczne)
Model 21372.7229.40.19
Wiek (22-miesięczne)
Symulowane modele osteocytów wygenerowane przy użyciu techniki modyfikacji geometriiModel 31530.4242.60.27
(Symulowany wiek średni)
Model 41122.6203.50.13
(Symulowane starzenie)
Model 53724.9302.90.49
(2 x średnica dendrytu)
Model 647913370.57
(4 x średnica dendrytu)
Model 73116.3440.61.17
(2 x grubość LC)
Model 83542.2658.21.89
(4 x grubość LC)

Tabela 1: Porównanie modeli osteocytów. Porównanie średniego FFSS, objętości przestrzeni lakunarno-kanalikuarnej oraz powierzchni w ośmiu różnych modelach osteocytów, w tym w dwóch modelach opartych na obrazowaniu konfokalnym i sześciu modelach symulowanych, wygenerowanych z Modelu 1 przy użyciu techniki modyfikacji geometrii.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia technikę obrazowania konfokalnego do wizualizacji i modelowania obliczeniowego osteocytów. Przed obrazowaniem konfokalnym przeprowadza się proces przygotowania kości do przekroju i barwienia próbek kostnych. Obrazy konfokalne o powiększeniu 100x są importowane do różnych programów w celu opracowania modeli komputerowych osteocytów i przestrzeni lacunarno-kanalowej. Na koniec przeprowadzana jest analiza CFD na modelach opartych na obrazie konfokalnym w celu modelowania FFSS otaczających osteocyty i błony dendrytyczne z powodu aktywności fizycznej, co jest technicznie trudne in vivo ze względu na niedostępność osteocytów w macierzy kostnej. Dostarczony protokół jest również pomocny w określaniu innych naprężeń lub odkształceń przy użyciu podejścia opartego na elementach skończonych lub interakcji płyn-struktura (FSI) w modelowaniu wielofizycznym.

Obrazowanie konfokalne zostało wykorzystane do wizualizacji LCN 7,9,24,25 ze względu na obrazy o wysokiej rozdzielczości, które można uzyskać za pomocą barwienia kości FITC. Chociaż średnica kanalików jest bliska granicy rozdzielczości mikroskopu, można uzyskać wiarygodne obrazy konfokalne kanalików, które mogą uchwycić większość kanalików. Ze względu na mniejszą średnicę dendrytów osteocytów, dokładne uchwycenie obrazów dendrytów jest technicznie trudniejsze. W związku z tym opracowano pomocną technikę modelowania osteocytów i dendrytów na podstawie konfokalnych obrazów LCN poprzez zmniejszenie ich objętości za pomocą operacji wygładzania w oprogramowaniu. W niektórych innych opublikowanych badaniach zastosowano podobne podejście do kompensacji LCN w celu wygenerowania błony osteocytowo-dendrytycznej9. Inną zaletą techniki wygładzania jest poprawa niektórych błędów obrazowania w CLSM, takich jak wydłużenie średnicy kanału, które występuje w osi Z z powodu niższej rozdzielczości obrazowania w osi Z, co jest cechą obrazowania optycznego. Dekonwolucja jest również uważana za alternatywną metodę zmniejszania rozciągnięcia optycznego w kierunku Z, ponieważ poprawia stosunek sygnału do szumu w oryginalnym zestawie danych. Przestrzeń lacunarno-kanalikowa jest modelowana na podstawie LCN i błon osteocytyczno-dendrytycznych w celu analizy profilu płynu wewnątrz LCN.

Warto zauważyć, że wprowadzono nową technikę w odniesieniu do istniejących metod w celu opracowania zmodyfikowanych geometrycznie modeli osteocytów bez poświęcania kolejnej myszy. Technika modyfikacji geometrii pomaga również symulować zmianę mikrostruktury kości spowodowaną starzeniem się lub chorobami kości, takimi jak osteoporoza, cukrzyca i stany, takie jak niedobór perlekanu itp. W tej technice wykorzystano konfokalny model osteocytów młodej myszy oparty na obrazie konfokalnym do modelowania morfologii osteocytów w podeszłym wieku lub innych osteocytów z chorobami kości poprzez modyfikację parametrów, takich jak gęstość kanałów, przestrzeń lacunarno-kanałowa i średnica dendrytów. Podejście to zostało potwierdzone przez podobieństwo dwóch starzejących się modeli osteocytów, jeden z konfokalnego modelowania opartego na obrazie rzeczywistego osteocytu od 22-miesięcznej myszy, a drugi z modelowania modyfikacji geometrii osteocytu pierwotnie zobrazowanego przez 4-miesięczną mysz poprzez zmniejszenie jego gęstości kanałów. Te dwa wiekowe modele osteocytów wykazały podobną wielkość FFSS, która była najniższa spośród wszystkich modeli osteocytów. Technika modyfikacji geometrii może mieć wiele zastosowań w różnych dziedzinach biologii, ponieważ może przewidywać wyniki porównywalne do modeli osteocytów wygenerowanych przy użyciu prawdziwych osteocytów od zwierzęcia. Niektóre z ograniczeń tej pracy obejmują utratę niektórych szczegółów chropowatości powierzchni ze względu na technikę wygładzania oraz fakt, że średnice kanałów są na granicy rozdzielczości mikroskopów konfokalnych, co może potencjalnie prowadzić do pewnej niedokładności dla kanalików o mniejszych średnicach, a także idealizacja przepływu płynu zamiast modelowania za pomocą przepływu oscylacyjnego.

Aby zademonstrować funkcjonalność techniki, wartości FFSS osteocytów zmierzono dla różnych modeli osteocytów wygenerowanych z młodej i starszej myszy lub przy użyciu techniki modyfikacji geometrii. Jednym z godnych uwagi odkryć przy użyciu tych modeli komputerowych było to, że objętość przestrzeni lacunarno-kanalicznej jest wprost proporcjonalna do średniego FFSS doświadczanego przez osteocyty. To nowe odkrycie, które nie było wcześniej badane, może mieć różne zastosowania w określaniu reakcji mechanicznej osteocytów, ponieważ może korelować morfologię sieci osteocytów z wykrytymi FFSS przez osteocyty i ich procesy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Narodowej Fundacji Nauki (NSF, numer nagrody NSF-CMMI-1662284 PI: T Ganesh), Narodowemu Instytutowi Zdrowia (NIH - NIA P01 AG039355 PI: LF Bonewald) oraz (NIH/SIG S10OD021665 i S10RR027668 PI: SL Dallas) oraz University of Missouri-Kansas City School of Graduate Studies Research Grant Program.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Papier ścierny o ziarnistości 1,200Buehler30-5170-012-100
Oprogramowanie 3-MaticMaterialisehttps://www.materialise.com/en/industrial/software/3-maticOprogramowanie do optymalizacji danych 3D
Papier ścierny o ziarnistości 600Buehler30-5118-600-100
Papier ścierny o ziarnistości 800OprogramowanieBUEHLER 30-5170-800-100
ANSYSOprogramowanie do symulacji https://www.ansys.com/ ANSYS
Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)Sigma-AldrichF7250
Oprogramowaniehttps://imagej.net/ij/
Olejek immersyjny do mikroskopówLeica Microsystems195371-10-9
Mikroskop konfokalny Leica TCS Sp5 II Leica MicrosystemsTCS Sp5 II 
Piła diamentowa Leitz 1600 do otworów wewnętrznychLeica 
Oprogramowanie MIMICS Innovation SuiteMaterialisehttps://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suiteOprogramowanie do przetwarzania obrazów 3D
Uchwyt do montażu na górze średniFisher scientificSP15-500
Zestaw szybkoutwardzalnego akrylu Sampl-KwickBuehler20-3560
Niezawodny naukowy INCWzór 55S
ImageJ Wytrząsarka laboratoryjna z pojedynczą platformą

Bibliografia

  1. Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review. J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).
  2. Fritton, S. P., Weinbaum, S. Fluid and solute transport in bone: Flow-induced mechanotransduction. Annu Rev Fluid Mech. 41, 347-374 (2009).
  3. Klein-Nulend, J., Bacabac, R. G., Bakker, A. D. Mechanical loading and how it affects bone cells: the role of the osteocyte cytoskeleton in maintaining our skeleton. Eur Cell Mater. 24, 278-291 (2012).
  4. Knothe Tate, M. L. "Whither flows the fluid in bone?" An osteocyte's perspective. J Biomech. 36 (10), 1409-1424 (2003).
  5. Tiede-Lewis, L. M., et al. Degeneration of the osteocyte network in the C57BL/6 mouse model of aging. Aging (Albany NY). 9 (10), 2190-2208 (2017).
  6. Lai, X., et al. The dependences of osteocyte network on bone compartment, age, and disease. Bone Res. 3 (1), 15009(2015).
  7. Schurman, C. A., Verbruggen, S. W., Alliston, T. Disrupted osteocyte connectivity and pericellular fluid flow in bone with aging and defective TGF-β signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (25), e2023999118(2021).
  8. van Tol, A. F., et al. The mechanoresponse of bone is closely related to the osteocyte lacunocanalicular network architecture. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (51), 32251-32259 (2020).
  9. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: a fluid-structure interaction approach. Biomech Model Mechanobiol. 13 (1), 85-97 (2014).
  10. Ganesh, T., Laughrey, L. E., Niroobakhsh, M., Lara-Castillo, N. Multiscale finite element modeling of mechanical strains and fluid flow in osteocyte lacunocanalicular system. Bone. 137, 115328(2020).
  11. Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 49 (2), 304-311 (2011).
  12. Kamioka, H., et al. A method for observing silver-stained osteocytes in situ in 3-microm sections using ultra-high voltage electron microscopy tomography. Microsc Microanal. 15 (5), 377-383 (2009).
  13. Ciani, C., Doty, S. B., Fritton, S. P. An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy. Bone. 44 (5), 1015-1017 (2009).
  14. Sharma, D., et al. Alterations in the osteocyte lacunar-canalicular microenvironment due to estrogen deficiency. Bone. 51 (3), 488-497 (2012).
  15. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Strain amplification in bone mechanobiology: a computational investigation of the in vivo mechanics of osteocytes. J R Soc Interface. 9 (75), 2735-2744 (2012).
  16. Goggin, P. M., Zygalakis, K. C., Oreffo, R. O., Schneider, P. High-resolution 3D imaging of osteocytes and computational modelling in mechanobiology: insights on bone development, ageing, health and disease. Eur Cell Mater. 31, 264-295 (2016).
  17. Kamioka, H., et al. Microscale fluid flow analysis in a human osteocyte canaliculus using a realistic high-resolution image-based three-dimensional model. Integr Biol. 4 (10), 1198-1206 (2012).
  18. Wang, L., et al. In situ measurement of solute transport in the bone lacunar-canalicular system. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (33), 11911-11916 (2005).
  19. Manfredini, P., Cocchetti, G., Maier, G., Redaelli, A., Montevecchi, F. M. Poroelastic finite element analysis of a bone specimen under cyclic loading. J Biomech. 32 (2), 135-144 (1999).
  20. Steck, R., Niederer, P., Knothe Tate, M. L. A finite element analysis for the prediction of load-induced fluid flow and mechanochemical transduction in bone. J Theor Biol. 220 (2), 249-259 (2003).
  21. You, L., Cowin, S. C., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix. J Biomech. 34 (11), 1375-1386 (2001).
  22. Weinbaum, S., Cowin, S. C., Zeng, Y. A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses. J Biomech. 27 (3), 339-360 (1994).
  23. Niroobakhsh, M., Laughrey, L. E., Dallas, S. L., Johnson, M. L., Ganesh, T. Computational modeling based on confocal imaging predicts changes in osteocyte and dendrite shear stress due to canalicular loss with aging. Biomech Model Mechanobiol. 23 (1), 129-143 (2024).
  24. Dallas, S. L., Moore, D. S. Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network. Bone. 138, 115463(2020).
  25. Boyde, A., Wolfe, L. A., Maly, M., Jones, S. J. Vital confocal microscopy in bone. Scanning. 17 (2), 72-85 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie osteocytówmikroskopia konfokalnaścinanie przepływem płynuobliczeniowa dynamika płynówsieć lakunarno-kanalikowamechanotransdukcja osteocytówtrójwymiarowe modele osteocytówbłony dendrytycznemodelowanie oparte na obrazachanaliza naprężeń ścinających
Analiza i obrazowanie osteocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.