Artykuł metodologiczny

Test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny A do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu

DOI:

10.3791/64700

⸱

23 grudnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Skidmore College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda opisuje test sedymentacji in vitro oparty na lektynie, który pozwala określić ilościowo powinowactwo wiązania fosfatazy glukanowej i amylopektyny. Ten test kosedymentacji jest niezawodny w pomiarze wiązania substratu fosfatazy glukanowej i może być stosowany do różnych rozpuszczonych substratów glukanu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfatazy glukanowe należą do większej rodziny fosfataz o podwójnej specyficzności (DSP), które defosforylują substraty glukanu, takie jak glikogen u zwierząt i skrobia u roślin. Struktury krystaliczne fosfatazy glukanowej z modelowymi substratami glukanu ujawniają wyraźne interfejsy wiążące glukan zbudowane z DSP i domen wiążących węglowodany. Jednak ilościowe pomiary interakcji fosfatazy glukan-glukan z fizjologicznie istotnymi substratami mają fundamentalne znaczenie dla biologicznego zrozumienia rodziny enzymów fosfatazy glukanowej i regulacji metabolizmu energetycznego. Niniejszy manuskrypt przedstawia test sedymentacji in vitro oparty na konkanawalinie A (ConA), przeznaczony do wykrywania powinowactwa fosfataz glukanu do wiązania substratu w stosunku do różnych substratów glukanu. Jako dowód słuszności koncepcji określono stałą dysocjacji (KD) fosfatazy glukanowej, Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) i amylopektyny. Charakterystyka mutantów SEX4 i innych członków rodziny enzymów fosfatazy glukanowej dodatkowo pokazuje przydatność tego testu do oceny zróżnicowanego wiązania interakcji białko-węglowodan. Dane te wskazują na przydatność tego testu do scharakteryzowania szerokiego zakresu białek oddziałujących ze skrobią i glikogenem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfatazy glukanu należą do funkcjonalnie zróżnicowanej podrodziny fosfataz o podwójnej specyficzności (DSP) w nadrodzinie białkowej fosfatazy tyrozynowej (PTP)1. Znaleziono je w większości form życia, w tym w bardzo rozbieżnych organizmach fotosyntetyzujących, ludziach, kręgowcach oraz niektórych bezkręgowcach i protistach2,3,4. Rośliny zawierają trzy znane fosfatazy glukanowe: Skrobia Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) i Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Rośliny, które nie mają fosfataz glukanowych, wykazują zmniejszone tempo przejściowej degradacji skrobi i akumulacji skrobi w liściach8,9. Laforyna jest członkiem-założycielem rodziny fosfatazy glukanowej, która defosforyluje glikogen u kręgowców i ludzi3,10. Mutacje laforyny prowadzą do neurodegeneracyjnej choroby Lafora, śmiertelnej autosomalnej recesywnej postaci padaczki11. Fosfatazy glukanu są niezbędne do metabolizmu glikogenu i skrobi i stały się ważnymi enzymami do modulowania zawartości skrobi w roślinach i leczenia neurodegeneracyjnej choroby Lafora12,13. Ostatnie badania krystalografii rentgenowskiej fosfataz glukanu z modelowymi substratami glukanu rzuciły światło na wiązanie substratu i katalityczny mechanizm defosforylacji glukanu14,15,16,17. Jednak obecna wiedza na temat tego, w jaki sposób fosfatazy glukanu wiążą się ze swoimi fizjologicznymi substratami, jest niekompletna.

Skrobia to nierozpuszczalny polimer glukozy składający się z 80%-90% amylopektyny i 10%-20% amylozy18. Substratami fosfataz glukanu roślinnego są fosforylowane cząsteczki węglowodanów, takie jak glikogen i granulki skrobi. Fosforylowane reszty glukozylowe są obecne w stosunku 1:600 fosforan do reszty glukozylowej. Co ciekawe, fosforany są obecne tylko w cząsteczkach amylopektyny19. Główna roślinna fosfataza glukanowa SEX4 działa na granulki skrobi w celu defosforylacji cząsteczek amylopektyny. Rentgenowska struktura krystaliczna SEX4 w połączeniu z badaniami mutagenezy sterowanej strukturą wykazała unikalną specyficzność substratu SEX4 dla różnych pozycji w strukturze glukanu15. Niedawno wykazaliśmy, że biologicznie istotną aktywność SEX4 można zaobserwować tylko wtedy, gdy działa ona na jego rozpuszczone substraty amylopektyny20. Jednak zrozumienie interakcji glukan-SEX4 okazało się trudne ze względu na złożoność strukturalną substratu, szerszą specyfikę wiązania i niskie powinowactwo wiązania między białkiem a jego substratami. Problemy te utrudniły wykorzystanie metod powszechnie stosowanych w interakcjach białko-ligand, takich jak kalorymetria miareczkowania izotermicznego (ITC), spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i testy oparte na testach immunoenzymatycznych (ELISA).

Ciekawe, większość naszej wiedzy na temat interakcji węglowodanów z białkami pochodzi z badania lektyn. Concanavalin A (ConA) to rodzina białek z rodziny lektyn roślin strączkowych, pierwotnie ekstrahowana z fasoli jack. ConA wiąże węglowodany o wysokiej specyficzności, co jest korzystne dla jego stosowania w zastosowaniach związanych z celowaniem i dostarczaniem leków. Wiązanie ConA z różnymi substratami zawierającymi nieredukujący α-D-mannozyl i α-D-glukozyl zostało szeroko zbadane19,20. Dostępne na rynku kulki sefarozy związane z ConA są powszechnie stosowane do oczyszczania glikoprotein i glikolipidów21. ConA wiąże się z tymi gluknami poprzez grupy hydroksylowe C3, C4 i C6 reszt glukozy. Kulki ConA-Sepharose zostały również z powodzeniem wykorzystane do pomiaru wiązania interakcji glikogen-białko i skrobia-białko22,23. W tym badaniu użyliśmy kulek ConA-Sepharose do opracowania testu wiązania w celu zmierzenia specyficzności wiązania interakcji fosfatazy-amylopektyny glukanu.

Poprzednio, test sedymentacji oparty na ConA był stosowany do oceny zdolności wiązania substratu fosfatazy glukanowej14,20,24. W tym badaniu ta sama strategia została wykorzystana do opracowania nowej metody określania powinowactwa wiązania fosfatazy glukan-glukan i interakcji węglowodanowych. Metoda ta ma również zaletę w badaniu różnych rozpuszczonych interakcji węglowodanowo-białkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie koralików ConA-Sepharose

  1. Przygotować 250 ml buforu wiążącego zawierającego 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl2 i 0,2 mM CaCl2. Dostosować pH za pomocą 1 M roztworu NaOH.
  2. Odpipetować 250 μl zawiesiny kulek ConA-Sepharose do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować zawartość w stężeniu 10 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: Na każde stężenie amylopektyny użytej do testu potrzeba 250 μl kulek ConA-Sepharose w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  3. Dodać 750 μl buforu wiążącego do każdej probówki zawierającej 250 μl kulek ConA-Sepharose. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Powtórz ten krok 2x, aby upewnić się, że koraliki są odpowiednio umyte i zrównoważone z buforem wiążącym.

2. Przygotowanie roztworów amylopektyny

  1. Przygotować roztwór podstawowy 10 mg/ml amylopektyny ziemniaczanej. Amylopektyna jest nierozpuszczalna w wodzie i może być rozpuszczalna pod wpływem ciepła. Aby rozpuścić, dodaj 0,1 g amylopektyny ziemniaczanej do 10 ml wody destylowanej. Podgrzewać zawiesinę w łaźni wodnej w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę lub do momentu, gdy roztwór przestanie być mętny.
  2. Pozwól, aby roztwór powrócił do temperatury pokojowej (RT), powtarzając wirowanie, aby uniknąć zbrylania.
  3. Leczenie alkoholowo-alkaliczne jest alternatywną metodą rozpuszczania substratów amylopektyny. Aby rozpuścić solubilizację tą metodą, wykonaj poniższe czynności.
    1. Zawiesić 0,5 g substratu amylopektyny w 5 ml 20% etanolu i 5 ml 2 M NaOH. Energicznie mieszać zawartość przez 15-20 minut w temperaturze RT.
    2. Następnie dodaj 10 ml wody i dostosuj pH roztworu do 6,5, dodając 2 M HCl. Zwiększ objętość powstałego roztworu do 50 ml wodą destylowaną, aby uzyskać 10 mg/ml roztworu amylopektyny.
  4. Rozcieńczyć 10 mg/ml rozpuszczonego roztworu amylopektyny, aby uzyskać serię 2 ml rozcieńczonych roztworów amylopektyny. Na przykład wykonaj połowę rozcieńczeń 10 mg/ml, aby przygotować serię stężeń amylopektyny (5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/mL, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/mL, 0,078 mg/ml, 0,039 mg/ml, 0,019 mg/ml i 0 mg/ml).

3. Przygotowanie ConA-Sepharose: kulki amylopektyny

  1. Dodać 250 μl każdego rozcieńczonego roztworu amylopektyny do 1,5 ml probówek wirówkowych zawierających 250 μl kulek ConA-Sepharose wstępnie zrównoważonych w buforze wiążącym. Dobrze wymieszaj zawartość. Oznaczyć probówki odpowiednim stężeniem amylopektyny.
  2. Inkubować zawartość na obracającym się kole w temperaturze 4 °C przez 30 min.
    UWAGA: Po 20 minutach nie ma zmian w kompleksie związanym ConA-Sepharose:amylopektyna w czasie. 30-minutowy czas inkubacji został wybrany poprzez zmianę czasu inkubacji od 10 minut do 1 godziny, aby zapewnić osiągnięcie równowagi.
  3. Odwirować probówki o sile 10 000 x g przez 1 minutę. Zebrać supernatant do nowo oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zapisz te frakcje supernatantu, aby przeprowadzić test D-glukozy12 (kwasowa hydroliza amylopektyny, a następnie oznaczanie glukozy UV za pomocą testu enzymatycznego). Ten krok jest niezbędny, aby upewnić się, że cała amylopektyna jest związana z kulkami.
  4. Dodać 750 μl buforu wiążącego do kulek ConA-Sepharose: amylopektyna. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 1 minutę. Odrzucić supernatant w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych cząsteczek amylopektyny.
  5. Powtórz krok 3.4, aby zapewnić wystarczające umycie. Każda probówka zawiera teraz kulki ConA-Sepharose związane z różnymi ilościami substratów amylopektyny.

4. Inkubacja SEX4 z ConA-Sepharose:kulki amylopektyny

  1. Wymieszaj 250 μl kulek ConA-Sepharose: amylopektyny ze 100 μl buforu wiążącego, który zawiera 10 μg białka SEX4, 10 mM ditiotreitolu (DTT) i 10 μM koktajlu inhibitorów proteazy (). Należy pamiętać, że całkowita objętość w każdej probówce wynosi 350 μL.
    UWAGA: Koktajl inhibitorów proteazy jest dodawany jako krok zapobiegawczy, aby uniknąć niepotrzebnej degradacji SEX4. Jest to krok opcjonalny. W tym teście stosuje się rekombinowane białko Arabidopsis thaliana SEX4 (AtSEX4). Oczyszczone białko zawiera N-końcowy znacznik histydyny niezbędny do wykrycia białka za pomocą chemiluminescencji. Szczegółowe informacje na temat oczyszczania fosfatazą glukanową opisano w poprzednich publikacjach14,20,24.
  2. Inkubować zawiesinę kulek białka i ConA-Sepharose: amylopektyny w temperaturze 4 °C przez 45 minut z delikatnym obracaniem.
    UWAGA: 45-minutowy czas inkubacji jest tak dobrany, aby zapewnić osiągnięcie równowagi dla kompleksu.
  3. Odwirować probówki o masie 10 000 x g przez 1 min. Ostrożnie odpipetować 50 μl supernatantu za pomocą końcówki do ładowania żelu do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μL 4x barwnika SDS-PAGE i 10 μL wody do każdej probówki zawierającej 50 μL zebranych frakcji sklarowanych sklarowanych sklarowanych nad osadem. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Zachowaj te próbki do uruchomienia żeli SDS-PAGE. Upewnij się, że 10 nowych probówek oznaczonych jako "supernatant (S)" ma odpowiednie stężenia substratu.
  4. Dodać 750 μl buforu wiążącego do kulek ConA-Sepharose:amylopektyna: SEX4, aby usunąć wszelkie niezwiązane białko z kulek. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 1 minutę. Powtórz ten krok jeszcze raz, aby zapewnić prawidłowe mycie. Odrzucić supernatant.
  5. Dodaj 20 μL 4x barwnika SDS-PAGE i 80 μL wody destylowanej do probówek zawierających przemyte kulki ConA-Sepharose:amylopectin:SEX4. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut i wirować przy 10 000 x g przez 1 minutę.
  6. Wyrzuć osad i zachowaj supernatant do uruchomienia żeli SDS-PAGE. Pobrać pipetą 80 μl supernatantu do nowych probówek i oznaczyć je jako "granulki (P)".

5. Uruchamianie żeli SDS-PAGE

  1. Załaduj 40 μl niezwiązanych próbek białka (wykonanych w kroku 2.3, oznaczonych S) do 4%-12% prefabrykowanych dołków żelu poliakrylamidowego od najniższego stężenia substratu do najwyższego, ale pozostaw pierwszy pas wolny, aby załadować marker masy cząsteczkowej białka. Użyj drugiego żelu, aby załadować 10 związanych próbek białka wykonanych w kroku 2.5 (oznaczonych jako P).
  2. Dodaj świeżo przygotowany bufor do pracy 1x SDS-PAGE do obu komór aparatu. Uruchom żel pod napięciem 150 V przez 35 minut lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do dolnej części żelu.
  3. Usuń żel do biegania z aparatu i usuń przekładki i szklane płytki. Użyj oddzielonego żelu, aby przeprowadzić analizę western blot.

6. Western blotting do wykrywania chemiluminescencji14,15

UWAGA: Ta metoda może być łatwo modyfikowana/dostosowywana w zależności od sprzętu do western blotting, który użytkownicy mają w swoich laboratoriach.

  1. Przygotować 1 l buforu transferowego zawierającego 5,8 g zasady Tris, 2,9 g glicyny, 0,37 g SDS i 200 ml metanolu.
  2. Przenieść oddzielone wielkością białka z żelu poliakryloamidowego do membrany nitrocelulozowej. Krótko złóż gąbki, bibuły filtracyjne, żel i membranę nitrocelulozową zgodnie z zachodnim protokołem transferu14,15. Praca pod napięciem 70 V przez 1 godzinę.
  3. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek, należy inkubować błonę nitrocelulozową zawierającą roztwór białka 1%-5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) lub białka mleka w 50 ml buforu TBST (20 mM Tris [pH 7,5], 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) przez 1 godzinę. Przemyć membranę 3x za pomocą buforu TBST, aby usunąć wszelkie niezwiązane roztwory blokujące.
  4. Inkubować błonę z przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) specyficznym dla białka znakowanego His przez 1 godzinę. Przemyć błonę 3 razy w buforze TBST, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Użyj rozcieńczenia przeciwciała przeciwko TBST w stosunku 1:2,000, aby uzyskać optymalną odtwarzalność i czułość.
  5. Przeciwciało połączone z enzymem HRP wiąże się specyficznie ze znacznikiem histydyny białka SEX4, co daje prążek w obecności odczynników chemiluminescencyjnych. W przypadku obrazowania cyfrowego należy przygotować roztwór równych części chemiluminescencyjnych roztworów substratów (po 750 μl każdy) w probówce o pojemności 1,5 ml. Inkubować błonę przez co najmniej 5 minut w roztworze.
  6. Umieść białko błonowe stroną do dołu na skanerze blot i uruchom oprogramowanie do akwizycji, aby określić ilościowo białko zarówno we frakcji osadu, jak i supernatantu.

7. Analiza danych

  1. Wykonaj ilościowe pomiary sygnału za pomocą oprogramowania do akwizycji ze skanerem blotów. Znormalizować wszystkie pomiary ilościowe we frakcjach supernatantu i osadu do całkowitego obciążenia białkiem.
    UWAGA: Oprogramowanie pozwala na ilościowe określenie intensywności każdego pasma białkowego we frakcji supernatantu i osadu.
  2. W eksperymencie wiązania nasycającego wykreśl procent stężenia związanego z białkiem w porównaniu ze stężeniem amylopektyny. Dopasuj dane do Y = Bmax x X/(KD + X), używając oprogramowania do analizy danych w celu obliczenia KD.
    UWAGA: Bmax to maksymalne specyficzne wiązanie, oś Y to procent związania białka, a oś X to stężenie amylopektyny.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd przebiegu testu sedymentacji ConA-Sepharose. (A) Przygotowanie koralików ConA-Sepharose. (B) Inkubacja z substratem amylopektyny. (C) Inkubacja z białkiem SEX4. (D) Rozdzielanie związanych i niezwiązanych frakcji białkowych poprzez odwirowanie. (E) Oddzielenie białka przez SDS-PAGE. (F) Analiza Western-blot. (G) Chemiluminescencyjna detekcja białka SEX4 znakowanego przez His. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z kluczowych cech rodziny białek fosfatazy glukanowej jest ich zdolność do wiązania się z substratami glukanu. Po pierwsze, zdolność wiązania SEX4 z kulkami ConA-Sepharose:amylopektyny przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 2A). Albumina surowicy bydlęcej (BSA) służyła jako kontrola negatywna do wykrywania wszelkich niespecyficznych wiązań białek z kulkami ConA-Sepharose:amylopektyna. Analiza białek SDS-PAGE wykazała obecność białka SEX4 we frakcji osadu oraz BSA we frakcji supernatantu. W2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to wykazało pomyślne opracowanie nowego testu sedymentacji in vitro , który umożliwia określenie powinowactwa wiązania interakcji fosfatazy glukan-glukan. Projekt testu wykorzystuje specyficzne wiązanie lektyny ConA z glukanami poprzez reszty hydroksylowe glukozy w celu pośredniego wychwytywania rozpuszczonych substratów węglowodanowych na kulkach sefalozy. Pozwala to na oddzielenie związanych i niezwiązanych frakcji białkowych poprzez odwirowanie i określenie powinowactwa wiązania rozp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez nagrodę National Science Foundation MCB-2012074. Autorzy dziękują dr Craigowi W. Vander Kooi z Wydziału Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Florydy za cenne dyskusje i wsparcie. Autorzy dziękują również dr Matthew S. Gentry'emu z Wydziału Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Florydy za jego wsparcie. Chcielibyśmy podziękować dr Sarze Lagalwar, przewodniczącej programu Skidmore College Neuroscience, za umożliwienie nam użycia skanera C-digit blot LICOR do obrazowania western blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6x-His Tag przeciwciało monoklonalne (HIS. H8), zestaw doTherm Fisher ScientificMA1-21315-HRP
Biorad
Chlorek wapniaSigma-Aldrich208291
C-cyfrowy skaner plamLICOR3600-00Skaner plam
Kompletny koktajl inhibitorów proteazySigma-Aldrich11836170001
Concanavalin A-sefarozaSigma-AldrichC9017Ten produkt zawiera  w 0,1 M buforze octanowym o pH 6 zawierającym 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 i 1 mM MgCl2 w 20% etanolu 
WirówkaEppendorf 5425R
GlicynaFisher ScientificBP381-5
Oprogramowanie GraphPad Prism 8.0GraphPad Wersja 8.0Oprogramowanie do analizy danych 
HEPESSigma-AldrichH8651
Image StudioLICOR3600-501Oprogramowanie do akwizycji
Chlorek magnezuSigma-AldrichM2670
MetanolFisher ScientificA452SK-4
Dodecylosiarczan soduFisher ScientificPI28312
Amylopektyna ziemniaczanaSigma-AldrichA8515
Prefabrykowane żele SDSPAGEGenscriptM00653S
baza TrisFisher ScientificBP154-1
Tween 20Fisher ScientificMP1TWEEN201
Podłoże chemiluminescencyjne premium Westernsure LI-COR  926-95000
elektroforezy żelowej i Western blot HRP 1703930 TGL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
  2. Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
  3. Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
  4. Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138(2009).
  5. Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
  6. Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
  7. Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
  8. Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
  9. Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
  10. Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
  11. Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
  12. Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
  13. Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
  14. Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
  15. Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
  16. Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
  17. Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
  18. Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
  19. Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
  20. Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
  21. Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
  22. Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
  23. Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
  24. Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
  25. Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
  26. Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
  27. Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza z u yciem konkanawaliny Aoddzia ywania bia ko cukierwi zanie amylopektynySDS PAGEWestern blotsta a dysocjacjinadmiar skrobi4

Powiązane artykuły