Method Article

Przetwarzanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań klinicznych przy użyciu zamkniętego, półautomatycznego przepływu pracy

DOI:

10.3791/64707

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioprocessing Technology Institute (BTI), Agency for Science, Technology and Research (A STAR), 2Thermo Fisher Scientific, 3Thermo Fisher Scientific

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół pobierania przylegających komórek z wielowarstwowych kolb w zamknięty półautomatyczny sposób za pomocą systemu wirowania przeciwprądowego. Protokół ten może być stosowany do zbierania zarówno komórek przylegających, jak i zawiesinowych z innych platform do rozbudowy komórek z niewielkimi modyfikacjami istniejących etapów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) są obecnie badane jako obiecująca metoda terapeutyczna oparta na komórkach dla różnych chorób, a w ciągu najbliższych kilku lat spodziewane są kolejne zatwierdzenia rynkowe do użytku klinicznego. Aby ułatwić to przejście, kluczowe znaczenie ma rozwiązanie problemów związanych ze skalą, odtwarzalnością między partiami, kosztami, zgodnością z przepisami i kontrolą jakości. Wyzwaniom tym można sprostać, zamykając proces i wdrażając zautomatyzowane platformy produkcyjne. W tym badaniu opracowaliśmy zamknięty i półautomatyczny proces pasażowania i zbierania hMSC pochodzących z galaretki Whartona (WJ) (WJ-hMSC) z wielowarstwowych kolb przy użyciu wirowania przeciwprądowego. WJ-hMSCs zostały namnażone przy użyciu zgodnej z przepisami pożywki wolnej od kseno-wirusa (SFM XF) i wykazały porównywalną proliferację komórek (podwojenie populacji) i morfologię do WJ-hMSC namnażanych w klasycznych pożywkach zawierających surowicę. Nasz zamknięty, półautomatyczny protokół zbioru wykazał wysoki odzysk komórek (~98%) i żywotność (~99%). Komórki umyte i zagęszczone za pomocą wirowania przeciwprądowego utrzymywały ekspresję markerów powierzchniowych WJ-hMSC, jednostki tworzące kolonie (CFU-F), potencjał różnicowania trójliniowego i profile wydzielania cytokin. Opracowany w ramach badania półautomatyczny protokół pobierania komórek może być łatwo stosowany do przetwarzania na małą i średnią skalę różnych komórek przylegających i zawiesinowych poprzez bezpośrednie połączenie z różnymi platformami do rozbudowy komórek w celu przeprowadzenia redukcji objętości, mycia i zbierania przy niskiej objętości wyjściowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) są doskonałym kandydatem do zastosowań klinicznych, zarówno w inżynierii tkankowej, jak i w terapiach komórkowych, biorąc pod uwagę ich potencjał terapeutyczny i wysoki potencjał samoodnawiania się do wzrostu in vitro, które są kluczowe dla generowania klinicznie istotnych dawek komórek1,2,3. Według ClinicalTrials.gov, obecnie prowadzonych jest ponad 1000 badań klinicznych dotyczących różnych stanów chorobowych4. Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie wykorzystaniem hMSC, w najbliższej przyszłości planowane są kolejne badania kliniczne i zatwierdzenia rynkowe5,6. Jednak produkcja hMSC wiąże się z wieloma nieodłącznymi wyzwaniami pod względem zmienności między partiami, wykorzystaniem surowców wysokiego ryzyka, obawami dotyczącymi zanieczyszczenia spowodowanego wieloma otwartymi i ręcznymi procesami, ponieważ produkcja obejmuje wiele operacji jednostkowych, wyższymi kosztami pracy, kosztem skalowania w poziomie lub zwiększania skali oraz przeszkodami regulacyjnymi6,7,8,9,10,11,12. Kwestie te nadal stanowią istotną barierę dla obecnego i przyszłego dostępu do rynku.

Rozwój zamkniętych, modułowych, zautomatyzowanych rozwiązań produkcyjnych i użycie odczynników pomocniczych niskiego ryzyka rozwiązałoby te wyzwania. Zapewniłoby to również stałą jakość produktu, zmniejszyłoby prawdopodobieństwo awarii partii z powodu błędu ludzkiego, zmniejszyłoby koszty pracy oraz poprawiło standaryzację procesów i zgodność z przepisami, na przykład w zakresie cyfrowego prowadzenia ewidencji partii8,12,13,14. Aby móc uzyskać klinicznie istotną dawkę komórek, niezależnie od tego, czy jest to autologiczna, czy allogeniczna, kluczowe znaczenie ma usprawniona produkcja, która obejmuje ekspansję komórek i dalsze przetwarzanie w zamknięty, zautomatyzowany sposób.

Dla rozbudowy hMSC, dwie najczęściej stosowane obecnie metody produkcji to scale-out (monolayer 2D) i scale-up (system zawieszenia oparty na mikronośnikach 3D)15,16,17,18. Najbardziej tradycyjną i szeroko stosowaną metodą rozbudowy hMSC jest hodowla 2D oparta na monowarstwach ze względu na niskie koszty produkcji i łatwość konfiguracji19.

Wielowarstwowe kolby składające się z tac o płaskiej powierzchni ułożonych w naczyniu hodowlanym są powszechnie wykorzystywane do zwiększania skali produkcji hMSC. Systemy te są zazwyczaj dostępne w 1-warstwowych do 40-warstwowych naczyniach hodowlanych20 i są obsługiwane ręcznie w szafach bezpieczeństwa biologicznego. Etapy przetwarzania podczas pasżowania i zbierania komórek obejmują ręczne dozowanie i dekantację pożywki eksplatacyjnej, odczynnika dysocjacyjnego i buforu płuczącego poprzez pipetowanie lub fizyczne przechylanie całego naczynia. Poza tym obsługa wielu jednostek jest trudna i czasochłonna ze względu na ich rozmiar i wagę.

Następnie, po zbiorach z wielowarstwowych kolb, wirowanie w celu wymiany pożywki, mycie komórek i redukcja objętości są niezbędnymi krokami w całym procesie produkcji komórek21. Konwencjonalne wirowanie stołowe jest w większości otwartym i ręcznym procesem, który obejmuje wiele etapów, takich jak przenoszenie zawiesiny komórek do zakorkowanych probówek lub butelek wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego, obracanie komórek, ręczne zasysanie supernatantu, ponowne zawieszenie komórek za pomocą buforu i wielokrotne mycie komórek. To znacznie zwiększa zarówno ryzyko zanieczyszczenia z powodu otwierania i zamykania nasadek, jak i ryzyko utraty osadu komórkowego podczas ręcznego procesu aspiracji/pipetowania22. W kontekście obsługi wielowarstwowych systemów hodowli komórek opartych na adherentach, takich jak hMSC, operator musiałby przejść przez pracochłonny proces wielokrotnego przemieszczania się między wirówką a komorą bezpieczeństwa biologicznego i jednoczesnego przenoszenia ciężkiej jednostki. Te ręczne kroki są pracochłonne, stwarzają ryzyko w postaci błędów ludzkich i zanieczyszczenia i muszą być wykonywane w środowisku pomieszczenia czystego klasy B, co jest kosztowne23. Ponadto konwencjonalny proces ręcznego wirowania nie jest skalowalny i może powodować ścinanie i naprężenia komórkowe; W związku z tym maksymalizacja odzysku komórek, żywotności i skuteczności wymywania resztkowych zanieczyszczeń to inne główne wyzwania22. Komercyjna produkcja terapii komórkowych na skalę cGMP wymaga zamkniętych, modułowych rozwiązań automatyzacji w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia, zapewnienia stałej jakości produktu, zmniejszenia kosztów pracy i produkcji oraz zwiększenia niezawodności procesu24,25. Kolby wielowarstwowe mogą być obsługiwane jako system zamknięty dzięki sterylnemu filtrowi 0,2 μm w jednym z portów, który ułatwia sterylną wymianę gazową, a drugi port jest aseptyki podłączony za pomocą złączy lub przyspawany bezpośrednio do automatycznego urządzenia do przetwarzania komórek w celu pobierania komórek. Pracowaliśmy nad zamknięciem i zautomatyzowaniem większości etapów pasażowania i zbioru WJ-hMSC, oceniając innowacyjną wirówkę przeciwprądową przeznaczoną do wytwarzania produktów na bazie komórek, genów lub tkanek. Ta wirówka przeciwprądowa jest również elastyczna do wykonywania różnych zastosowań związanych z przetwarzaniem komórek, takich jak separacja komórek na podstawie rozmiaru, wymiana pożywki/buforu, stężenie i zbieranie dla różnych typów komórek8,26,27,28. Przyrząd wykorzystuje zamknięty zestaw jednorazowego użytku, który można sterylnie podłączyć za pomocą spawania rurowego lub aseptycznych łączników do przenoszenia worków lub można go podłączyć bezpośrednio do dowolnej platformy rozszerzeń.

W tym badaniu zaprojektowaliśmy niestandardowy zestaw przewodów, aby umożliwić zamknięte sterylne połączenia między jednorazowym zestawem do wirowania przeciwprądowego a wielowarstwową kolbą. Zoptymalizowaliśmy protokół enzymatycznego odłączania, mycia i zbierania WJ-MSC z wielowarstwowej kolby w całkowicie zamknięty i półautomatyczny sposób w ciągu jednego cyklu. Zebrane WJ-hMSC scharakteryzowano pod kątem czystości (analiza markerów powierzchniowych) i siły działania (CFU-F, różnicowanie trójliniowe i profile wydzielania cytokin), aby zapewnić, że produkt końcowy spełnia krytyczne atrybuty jakości (CQA) dla uwolnienia partii.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej i powlekanie naczyń hodowlanych

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Skład klasycznej pożywki zawierającej surowicę: Przygotuj klasyczną pożywkę zawierającą surowicę, mieszając αMEM (445 ml), płodową surowicę bydlęcą (FBS) (50 ml) i 100x penicylinę-streptomycynę (5 ml).
    2. Przygotuj kompletne podłoże SFM XF.
      1. Przygotuj butelkę o pojemności 500 ml, aseptycznie dodając 5 ml suplementu SFM XF (100x) i 5 ml 100x L-alanylo-L-glutaminy (patrz Tabele materiałów) do podłoża podstawowego SFM XF (500 ml).
      2. Przygotuj worek na 2 litry podłoża, aseptycznie dodając 20 ml niestandardowego suplementu MSC SFM XF (100x) i 20 ml 100x L-alanylo-L-glutaminy (patrz Tabele materiałów) do worka SFM XF baseal medium (2 L), podłączając strzykawkę o pojemności 50 ml do odpowiedniego portu worka.
        UWAGA: Przed użyciem w hodowli dodaj czynniki wzrostu lub cytokiny (niedostarczane z pożywką) do kompletnej pożywki SF XF: PDGF-BB (20 ng/ml), FGF basic (4 ng/ml) i TGFβ (0,5 ng/ml).
  2. Powlekanie naczyń kultur komórkowych witronektyną do stosowania z podłożami niezawierającymi surowicy
    1. Rozmrozić zapas witronektyny (VTN-N; 0,9 mg/ml) w temperaturze 4 °C.
    2. Użyj sterylnego buforowanego roztworu soli fizjologicznej bez wapnia i magnezu (DPBS) firmy Dulbecco, aby rozcieńczyć rozmrożony VTN-N do stężenia roboczego 5 μg/ml.
      UWAGA: Rozcieńczyć VTN-N bezpośrednio przed użyciem i nie przechowywać rozcieńczonego roztworu witronektyny.
    3. Dodać 1 ml/10cm2 rozcieńczonego roztworu VTN-N do odpowiedniego naczynia hodowlanego; końcowe stężenie wynosi 0,5 μg/cm2. Na przykład dodać 7,5 ml rozcieńczonego roztworu VTN-N do kolby T-75 (75 cm2); dodać 17,5 ml rozcieńczonego roztworu VTN-N do kolby T-175 (175cm2); dodać 250 ml rozcieńczonego roztworu VTN-N do standardowej czterowarstwowej kolby wielowarstwowej (2,528cm2); i dodać 630 ml rozcieńczonego roztworu VTN-N do 10-warstwowej kolby wielowarstwowej (6,320cm2).
    4. W sterylnych warunkach inkubować naczynia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: Powlekane naczynie hodowlane można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia. Owiń naczynie hodowlane folią laboratoryjną, aby zapobiec jego wysychaniu. Przed użyciem należy wstępnie ogrzać naczynie hodowlane do temperatury pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
    5. Odessać roztwór VTN-N, wyrzucić i natychmiast dodać wystarczającą ilość pożywki hodowlanej, aby zapobiec wyschnięciu pokrytej powierzchni naczynia.
      UWAGA: Nie ma potrzeby spłukiwania naczynia hodowlanego po wyjęciu VTN-N.

2. Rozszerzenie WJ-hMSC

  1. Szybko rozmrozić WJ-hMSC (p2), umieszczając kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; powoli obracać fiolkę, aż zawartość zacznie się rozmrażać.
  2. Po rozmrożeniu wysiać WJ-hMSC w ilości 5 000 komórek/cm2 w kolbie T-175 (bez powłoki VTN-N) i inkubować w klasycznej pożywce zawierającej surowicę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w celu ekspansji komórek. Po dwóch pasażach (p4) należy umieścić rozszerzone komórki w pożądanym podłożu do krioprezerwacji jako działający bank komórek (WCB).
  3. Przeprowadź zliczanie komórek przy użyciu automatycznego licznika komórek zgodnie z metodą żywotności i zliczania komórek, aby określić całkowitą liczbę komórek, żywotność komórek i rozmiar komórek29.
  4. Z p4 hodować WJ-hMSC w 5,000 komórek/cm2 w kolbach T-75 w klasycznym podłożu zawierającym surowicę lub pożywce SFM XF (użyć kolb powlekanych VTN-N z podłożem SFM XF).
  5. Utrzymuj komórki w obu pożywkach hodowlanych przez łącznie trzy pasaże (12 dni) i zmierz ekspansję komórek (wzrost fałdowania) przy każdym pasażu, dzieląc liczbę żywotnych komórek zliczonych na końcu hodowli każdego pasażu przez liczbę żywotnych komórek na początku hodowli (dzień wysiewu komórek).

3. Rozszerzenie skali wyjściowej pociągu nasiennego

  1. Rozszerzenie WJ-hMSC w kolbie T-175
    1. Szybko rozmrozić WJ-hMSC w temperaturze p4, umieszczając kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; powoli obracać fiolkę, aż roztwór zacznie się rozmrażać.
    2. Wysiewać 5 000 komórek/cm2 do kolby T-175 pokrytej VTN-N. Pozwolić komórkom rosnąć w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
    3. Zużytą pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 2-3 dni na świeżo przygotowane, wstępnie podgrzane, kompletne podłoże SFM XF, aby uzyskać optymalną wydajność i wzrost komórek.
  2. Obchodzenie się z kolbami wielowarstwowymi (Rysunek 1A, B)
    1. Wszystkie połączenia aseptyczne muszą być wykonywane w sterylnym środowisku.
    2. Rozpakuj wielowarstwową kolbę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Podłącz wstępnie wysterylizowany filtr powietrza (0.2 μm) do jednego portu, aby umożliwić uwolnienie ciśnienia podczas przenoszenia płynu za pomocą wirówki przeciwprądowej.
    4. Zamontuj wielowarstwowe złącze kolby z niestandardowego zestawu przewodów do drugiego portu (Rysunek 1B).
    5. Przyspawaj przewód PVC niestandardowego zestawu przewodów do worka transferowego z PVC o pojemności 2 litrów zawierającego kompletny SFM XF medium.
      UWAGA: Całkowicie wymieszaj pożywkę przed dodaniem jej do systemu wielowarstwowego za pomocą przepływu grawitacyjnego. Upewnij się, że worek transferowy z PVC zwisa wyżej niż kolba wielowarstwowa.
    6. Umieść wielowarstwową kolbę na dłuższym boku, z filtrem powietrza u góry (Rysunek 1B).
    7. Otwórz zacisk na rurce PVC, aby rozpocząć napełnianie wielowarstwowej kolby. Upewnij się, że podłoże jest wypoziomowane między tacami podczas napełniania.
    8. Gdy podłoże całkowicie wyrówna się we wszystkich tacach, obrócić wielowarstwową kolbę na krótszy bok z portami do góry.
    9. Zamknij zacisk na przewodzie PVC i wyjmij worek transferowy, zastępując połączenie rurki niebieską nasadką zamykającą MPC.
      UWAGA: Nie wyjmuj filtra powietrza, ponieważ umożliwia to wymianę gazu podczas rozszerzania się ogniw.
    10. Obrócić kolbę wielowarstwową do pozycji inkubacji.
      UWAGA: Filtr i przyłącze rurki powinny być skierowane do góry.
    11. Opróżnij wielowarstwową kolbę, podłączając ją do butelki z aspiratorem; umieść ją nad butelką z aspiratorem, a płyn wypłynie.
      UWAGA: Przechylić wielowarstwową kolbę na bok, aby całkowicie odsączyć zużyte podłoże grawitacyjnie. Alternatywnie, zużyte podłoże można przelać do butelki na odpady za pomocą niestandardowego zestawu rurek.
    12. Powtórz kroki 3.2.5-3.2.11, aby uzupełnić świeżą pożywkę.
  3. Subkultura WJ-hMSC w kolbie wielowarstwowej (T-175 > 4-warstwowa > 10-warstwowa)
    1. Przed użyciem należy wstępnie podgrzać odczynnik do dysocjacji komórek (TrypLE) i kompletną pożywkę SFM XF w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Odessać zużyte podłoże z kolby T-175 i wyrzucić.
    3. Umyj monowarstwę ogniw wstępnie podgrzanym DPBS, aspiruj i wyrzuć.
    4. Dodać TrypLE do każdej kolby, zapewnić całkowite pokrycie monowarstwy komórek i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Przenieść zawiesinę do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    6. Odwirować probówkę o stężeniu 100-200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i wyrzucić DPBS i uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
    7. Zawiesić osad komórkowy w minimalnej objętości (10 ml) wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki SFM XF w celu zliczenia komórek.
    8. Napełnij czterowarstwowe naczynie hodowlane pokryte VTN-N około 800 ml kompletnego podłoża SFM XF, jak wspomniano w sekcji 2 powyżej. Dodać 5 000 komórek/cm2 (tj. 1,26 x 107 żywotnych komórek/kolbę). Delikatnie zakręć zawiesiną komórek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.
    9. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.
    10. Zużytą pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 2-3 dni na świeżą, wstępnie podgrzaną, kompletną pożywkę SFM XF, aby uzyskać optymalny wzrost komórek, aż komórki osiągną zbieżność 60%-80% lub będą gotowe do subhodowli w 10-warstwowej kolbie wielowarstwowej.
    11. Napełnić 10-warstwową wielowarstwową kolbę z powłoką VTN-N około 2 litrami kompletnego podłoża SFM XF, jak wspomniano w sekcji 2. Dodać 5 000 komórek/cm2 (tj. 3,1 x 107 komórek/kolbę). Delikatnie zakręć zawiesiną komórek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.
    12. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.
    13. Zużytą pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 2-3 dni na świeżą, wstępnie podgrzaną, kompletną pożywkę SFM XF, aby uzyskać optymalny wzrost komórek, aż komórki osiągną 60%-80% zbieżności lub będą gotowe do zbioru.

4. Zamknięta półautomatyczna dysocjacja i zbiór WJ-hMSC przy użyciu zamkniętego wirowania przeciwprądowego

  1. Zespół jednorazowego zestawu do wirowania przeciwprądowego
    1. Połącz zestaw jednorazowego użytku z jednorazowymi workami transferowymi z PVC za pomocą spawania rurowego, podobnie jak w konfiguracji pokazanej na Rysunek 1A.
      UWAGA: Domyślne natężenie przepływu zestawu jednorazowego użytku to 30-165 ml/min.
    2. Podłącz 10-warstwową wielowarstwową kolbę zawierającą zlewające się WJ-hMSC do niestandardowego zespołu przewodów wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Przenieś dołączone 10-warstwowe naczynie hodowlane z niestandardowym zespołem rurek na stół i przyspawaj do linii E (3/32 cala ID PVC) zestawu jednorazowego użytku, jak pokazano na Rysunek 1B.
    4. Upewnij się, że przyspawasz sterylny port próbki do linii G zestawu jednorazowego użytku o wysokim przepływie.
    5. Następnie podłącz linię do pobierania H do sterylnego Luera wyposażonego w strzykawkę o pojemności 50 ml.
      UWAGA: We wszystkich powyższych krokach upewnij się, że ręczne clamps są zamknięte, aby zabezpieczyć płyn w każdej torbie z zestawem.
  2. Ustawianie uruchomienia instrumentu
    1. Włącz przyrząd "ON", włączając przełącznik z tyłu instrumentu.
    2. Podłącz laptopa do portu USB-C w instrumencie za pomocą dostarczonego USB-C (Rysunek 1B).
    3. Uruchom oprogramowanie graficznego interfejsu użytkownika (GUI) wirówki przeciwprzepływowej z pulpitu lub menu Start.
    4. Po zalogowaniu załaduj protokół, klikając przycisk Wybierz protokół na głównej stronie powitalnej.
      UWAGA: Protokół zbierania wirowania przeciwprądowego (Tabela 1) został utworzony przy użyciu oprogramowania Protocol Builder i przechowywany lokalnie.
    5. Naciśnij niebieski przycisk odblokowujący na instrumencie i otwórz szklane drzwi.
    6. Załaduj zmontowany zestaw jednorazowego użytku do systemu wirowania przeciwprądowego.
    7. Zacznij od zawieszenia worków zawieszonych na haczykach wieszaków w kolejności, która najlepiej pokrywa je z portami rurkowymi na paskach czujnika bąbelkowego, z 10-warstwową wielowarstwową kolbą umieszczoną pod kątem, jak pokazano na Rysunek 1B.
    8. Wyrównaj zestaw z dwoma przyciskami lokalizacji zestawu, rozciągnij rurkę pompy wokół pompy perystaltycznej i wciśnij białe złącze w kształcie żarówki na miejsce.
      UWAGA: Upewnij się, że rurka nad czujnikiem ciśnienia jest prawidłowo umieszczona w szynie wężyka.
    9. Zamocuj komorę wirówki, podnosząc srebrną dźwignię wspornika komory wirówki przeciwprądowej i zabezpieczając ją, ustawiając dźwignię w pozycji pionowej.
    10. Wciśnij rurkę z każdego portu w zestawie do ścieżek wzdłuż pasków czujnika pęcherzyków.
      UWAGA: Upewnij się, że torby nie są splątane, aby można było łatwo śledzić proces protokołu.
    11. Zamknij drzwi, naciskając zatrzask drzwi.
      UWAGA: Ramię zaciskowe pompy zamknie się, komora wirówki zacznie się obracać, a zawory zamkną się. Bez zamknięcia drzwi system nie będzie w stanie zainicjować i uruchomić protokołu.
    12. Naciśnij przycisk Inicjuj w graficznym interfejsie użytkownika. Pojawi się lista kontrolna; Pierwsze cztery elementy to kontrole instrumentów, a ostatnie dwie pozycje to kontrole użytkownika (upewnij się, że torby i połączenia pasują do obrazu zestawu i upewnij się, że ręczne zaciski są otwarte).
      UWAGA: W przypadku kontroli przyrządów czerwone znaki X zamiast niebieskich znaczników wyboru są wyświetlane, jeśli coś jest nie tak.
    13. Naciśnij przycisk Potwierdź, aby wyświetlić ekran wejść protokołu.
    14. Ustaw wartość w oknie dialogowym wprowadzania danych (objętość zbioru) na 45 ml i naciśnij przycisk Potwierdź.
      UWAGA: Na ekranie wprowadzania protokołu pojawi się monit, jeśli w protokole utworzonym przez użytkownika ustawiono jakiekolwiek zmienne dane wejściowe. Objętość zbioru jest ustawiana jako zmienna w tym protokole, a użytkownik może zdecydować się na testowanie różnych objętości w zależności od ostatecznych wymagań dotyczących gęstości komórek. Minimalna objętość zbioru, na jaką pozwala system, to 5 ml. System pozwala na ustawienie maksymalnie czterech zmiennych danych dla każdego protokołu.
  3. Uruchamianie protokołu
    1. Kliknij Inicjuj w graficznym interfejsie użytkownika i naciśnij zielony przycisk Start na instrumencie, aby rozpocząć uruchamianie protokołu (patrz Tabela 1).
      UWAGA: System zainicjuje kroki zgodnie z protokołem, zaczynając od sekwencji zalewania, zastępując powietrze w systemie buforem.
    2. Po zakończeniu zalewania (Tabela 1, krok 8) upewnij się, że zużyte podłoże zostało całkowicie wypompowane do worka na odpady.
      UWAGA: Gdy 10-warstwowa wielowarstwowa kolba zostanie opróżniona, system poprosi użytkownika w graficznym interfejsie użytkownika o potwierdzenie, czy naczynie jest puste. Naciśnij przycisk "Pomiń" na instrumencie, jeśli naczynie jest puste; jeśli nie, naciśnij zielony przycisk "Odtwarzaj/Pauza", aby kontynuować spuszczanie pozostałych płynów z naczynia.
    3. W krokach pauzy 15, 19 i 22 (Tabela 1) upewnij się, że podniosłeś wielowarstwową kolbę i potrząśnij, aby równomiernie rozprowadzić bufor na wszystkie tace. Po zakończeniu umieść 10-warstwową wielowarstwową kolbę z powrotem w pierwotnej pozycji rysowania, aby wykonać kolejne kroki.
      UWAGA: Tylko dla kroku 19 w tabeli 1, po wstrząśnięciu, należy umieścić wielowarstwową kolbę płasko i inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej w celu dysocjacji komórek.
    4. W kroku 20 i kroku 23 (Tabela 1) upewnij się, że trypsynizowane komórki zostały całkowicie przeniesione do worka pośredniego.
    5. Dobrze wymieszaj worek pośredni ręcznie w kroku 25 (Tabela 1).
    6. W kroku 26 (Tabela 1) użyj strzykawki Luer o pojemności 2 ml do pobrania próbki przez port pobierania próbek.
      UWAGA: Zaleca się pobieranie próbek co najmniej trzy razy w celu dokładnego zliczenia komórek.
    7. W kroku 29 i kroku 30 (Tabela 1) sprawdź stabilne formowanie się fluidyzowanego łoża komórkowego; powinno być podobne do fluidyzowanego łoża komórkowego, jak pokazano na Rysunek 1C.
      UWAGA: Jeśli stabilne złoże komórek fluidalnych nie jest uformowane podobnie jak pokazano na Rysunek 1C, optymalizacja stosunku siły g do natężenia przepływu (G/F) ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia stabilnego fluidyzowanego łoża komórek (wysoki odzysk komórek) w komorze podczas etapów ładowania i mycia ogniwa. Stosunek G/F zależy od wielkości komórek i gęstości podłoża. W przypadku buforu próbka/płukanie o dużej gęstości wymagany jest wysoki stosunek G/F, podczas gdy w przypadku buforu próbka/płukanie o niskiej gęstości można zastosować niski stosunek G/F.
    8. Przebieg jest zakończony na etapie od rampy do zatrzymania (krok 35 w tabeli 1), a wszystkie wartości zaciskania w systemie wirowania przeciwprądowego zamkną się automatycznie.
      UWAGA: Na koniec upewnij się, że ręczne clamps są zamknięte, aby zabezpieczyć płyn w każdej torbie z zestawem przed otwarciem drzwi.
    9. Po zakończeniu działania protokołu naciśnij niebieski przycisk odblokowujący na instrumencie i otwórz szklane drzwiczki. Wyjmij zestaw jednorazowego użytku z zebranym koncentratem z urządzenia.
    10. Aseptyczne uszczelnienie linii żniwnej za pomocą ręcznej zgrzewarki do rur. Ostrożnie przenieść szczelnie zamkniętą strzykawkę wypełnioną skoncentrowanym pobraniem komórek do komory bezpieczeństwa biologicznego w celu zliczenia komórek i krioprezerwacji.
    11. Ponownie odłącz komorę za pomocą dźwigni, wyciągnij złącze żarówki z oprawy i ostrożnie wyjmij zestaw, a następnie wrzuć do torby na wypadek zagrożenia biologicznego.
    12. Wyczyść instrument chusteczkami na etanol i upewnij się, że drzwi są zamknięte.
    13. Najpierw zamknij aplikację GUI, a dopiero potem wyłącz przełącznik z tyłu urządzenia.
      UWAGA: Protokół pobierania komórek został przetestowany w biologicznych potrójnych próbkach (n = 3).

5. Ocena krytycznych atrybutów jakości (CQA)

  1. Markery powierzchniowe tożsamości komórki (CD73, CD90 i CD105) i markery niezrębowe (CD34 i CD45)
    1. Pobraną zawiesinę komórek WJ-hMSC rozcieńczyć do stężenia 1 x 106 żywotnych komórek/ml, dodając odpowiednią objętość buforu cytometrii przepływowej (DPBS z 1% BSA lub 2% FBS).
    2. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdej probówki mikrowirówkowej lub płytki 96-dołkowej. Upewnij się, że na 100 μl zawiesiny komórek znajduje się co najmniej 0,1 x 106 komórek.
    3. Dodać przeciwciało sprzężone z fluoroforem do próbki w odpowiednim rozcieńczeniu, zgodnie z zaleceniami dostawcy przeciwciał.
    4. Inkubować przez 20 minut w ciemności.
    5. Po inkubacji dodać 100 μl buforu do cytometrii przepływowej w celu przepłukania próbek przez odwirowanie przy 380 x g przez 3 minuty.
    6. Odrzucić supernatant, pozostawiając osad.
    7. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl bufora cytometrii przepływowej i poddać analizie cytometrii przepływowej30.
  2. Test fibroblastyczny jednostek tworzących kolonie (CFU-F)
    1. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do stężenia 1 000 żywotnych komórek/ml kompletnej pożywki hodowlanej.
    2. Płytka ~ 500 komórek na basenie na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w kompletnej pożywce hodowlanej.
    3. Inkubować przez 10-14 dni w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonym CO2 , przemyć PBS i zabarwić 0,5% fioletem krystalicznym w metanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Wylicz kolonie w każdej studzience.
    5. Obliczyć wydajność CFU-F: Podziel liczbę utworzonych kolonii przez oryginalną liczbę wysiewu, aby uzyskać procentową skuteczność tworzenia kolonii i wyraź ją w procentach.
  3. Potencjał różnicowania trilineage
    1. Wysiewaj 5 x 103 komórki/cm2 do pożywki różnicującej osteogenezę i adipogenezę na płytkach 12-dołkowych zgodnie z protokołem producenta. Do chondrogenezy przygotuj 1,6 x 107 żywotnych komórek/ml i wygeneruj mikromasowe kultury, wysiewając 5 μl kropelek roztworu komórkowego w środkach studzienek 96-dołkowych płytek, zgodnie z protokołem producenta.
    2. Podczas różnicowania należy dokonywać pełnych zmian podłoża co 3-4 dni.
    3. Po 14 dniach (w przypadku adipogenezy) lub 21 dniach (w przypadku osteogenezy i chondrogenezy) należy monitorować kultury pod kątem różnicowania za pomocą barwników biologicznych specyficznych dla linii, zgodnie z protokołem producenta. W celu różnicowania adipogenicznego kultury należy zabarwić 0,5% roztworem czerwieni olejowej O. W przypadku osteogenezy należy wykonać barwienie przy użyciu 2% roztworu Alizarin Red S. W celu różnicowania chondrogennego zabarwić granulki mikromasy 1% Alcian Blue.
  4. Profile wydzielania cytokin
    1. Rozmrozić kriokonserwowane komórki zebrane ręcznie lub za pomocą systemu wirowania przeciwprądowego i wysiać 5 000 komórek/cm2 w kolbie T-175 z pożywką SFM XF.
    2. Po 4 dniach zebrać zużytą pożywkę hodowlaną i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
    3. Określ ilościowo ekspresję cytokin za pomocą zestawu panelowego 19-plex Profile ekspresji cytokin na czytniku multipleksowym.
    4. Wykonaj multipleksowe testy immunologiczne zgodnie z zaleceniami producenta.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bank komórek macierzystych (MCB) WJ-hMSC po rozmrożeniu był utrzymywany przez trzy kolejne przejścia (p1-p4) w klasycznym podłożu zawierającym surowicę, aby wytworzyć wystarczającą ilość działających banków komórek (WCB) do eksperymentów. WCB p4 rozmrażono i namnażano zarówno w pożywce zawierającej surowicę, jak i pożywce SFM XF przez trzy kolejne pasaże (p4-p7) w kolbach T-175. WJ-MSC dobrze przystosowały się do namnażania w pożywce SFM XF i były w stanie utrzymać stabilną proliferację podobną do tej w pożywce zawierającej surowicę (Figura 2A). Jednak komórki rozprężające się w pożywce SFM XF wykazywały nieco dłuższą morfologię w kształcie wrzeciona przypominającą fibroblasty, co skutkowało nieco większym rozmiarem komórki (Rysunek 2B) średnio ~ 17 μm w porównaniu do ~ 15 μm w pożywce zawierającej surowicę. W obu warunkach pośrednich w trzech przejściach, WJ-hMSCs konsekwentnie osiągały maksymalną gęstość komórek ~2,3 x 104 komórek/cm2 i czas podwojenia populacji wynoszący ~34 godziny (Rysunek 2C,D).

Dla ekspansji WJ-hMSC na dużą skalę w systemie zamkniętym, przeprowadziliśmy ekspansję ciągu nasion WJ-hMSC najpierw w kolbie 4-warstwowej, a następnie w 10-warstwowej kolbie wielowarstwowej. Przy zbiegu około 80%-90% po 4 dniach hodowli zebraliśmy 9,6 x 107 ± 0,9 x 107 i 2,3 x 108 ± 0,2 x 108 komórek odpowiednio dla stosów 4-warstwowych i 10-warstwowych. Osiągnięto wyższą gęstość komórek 3,6 x 10 4-3,8 x 104 komórek/cm2 w porównaniu z kolbami T-175, co oznacza, że stosy pozwoliły na lepszą ekspansję komórek nawet siedmiokrotnie.

Ponadto, WJ-hMSC rozwinięte w 10-warstwowych naczyniach hodowlanych zostały zebrane bezpośrednio za pomocą wirowania przeciwprądowego. Sterylne połączenie z zestawem jednorazowego użytku było łatwe do ustanowienia w celu bezpośredniego przenoszenia płynu przy maksymalnym natężeniu przepływu 165 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej urządzenia. Półautomatyczny proces zbierania komórek został osiągnięty poprzez najpierw zebranie komórek za pomocą dysocjacji enzymatycznej, załadowanie komórek do komory przeciwprądowej w celu zmniejszenia objętości i zagęszczenia, a następnie mycie buforem myjącym, który stanowił około 3 razy objętość komory wirowania przeciwprądowego. Następnie, umyte komórki zostały następnie zagęszczone i zebrane do żądanej objętości zbioru ustawionej w protokole. Etapy przetwarzania wykorzystywane do półautomatycznego przetwarzania komórek zostały zaprojektowane tak, aby naśladować ręczny proces zbioru. Udało nam się osiągnąć 10-krotne zmniejszenie objętości, co zaowocowało wygenerowaniem stężeń komórek sięgających 5,3 miliona komórek/ml. Protokół był w stanie osiągnąć wysoki odzysk komórek na poziomie ~98% i wysoką żywotność komórek na poziomie ~99% konsekwentnie dla wszystkich trzech niezależnych serii (Rysunek 3A-C).

Przeprowadziliśmy obszerne testy charakterystyki komórek, aby określić kluczowe cechy jakości pobierania komórek za pomocą wirowania przeciwprądowego w porównaniu do wirowania ręcznego. Aby przetestować tożsamość WJ-hMSC, markery powierzchniowe komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Jak pokazano na Rysunek 4A, WJ-hMSC zebrane przy użyciu obu metod wykazywały charakterystyczne profile markerów powierzchniowych zgodnie z przepisami ISCT, pozytywną ekspresję CD73, CD90 i CD105, a także ujemną ekspresję CD34 i CD45. Następnie, w celu oceny potencjału klonogennego WJ-hMSC, przeprowadzono testy CFU-F. Jak pokazano w Rysunek 4B, komórki zebrane z wirowania przeciwprądowego wykazywały podobny potencjał CFU-F w porównaniu z komórkami zebranymi przez ręczne wirowanie (odpowiednio 21% ± 1% vs. 20% ± 1%). Ponadto, jak pokazano w Rysunek 4C, komórki zebrane po wirowaniu przeciwprądowym zachowały zdolność do różnicowania się w adipocyty, osteoblasty i chondrocyty podobnie jak komórki w metodzie wirowania ręcznego. Na koniec zbadaliśmy 18 różnych profili wydzielania cytokin w komórkach za pomocą multipleksowych testów immunologicznych. Jak pokazano na Rysunek 4D, komórki umyte i zagęszczone za pomocą wirowania przeciwprądowego utrzymywały profile wydzielania cytokin, a profile były porównywalne z profilami próbki pobranej przed myciem/zagęszczaniem komórek (wirowanie przed przeciwprądem).

Ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy skuteczne rozszerzanie hMSC w systemie hodowli SFM XF, a komórki umyte i zagęszczone za pomocą zamkniętego, automatycznego systemu wirowania przeciwprądowego przyniosły wysoki odzysk komórek i żywotność po myciu i mogły zachować swój fenotyp i funkcjonalność. Zamknięty, półautomatyczny proces opracowany w tym badaniu może zapewnić stałą jakość produktu pod względem końcowego odzysku WJ-MSC, czego dowodem są trzy niezależne serie.

figure-results-1
Rysunek 1: Konfiguracja i montaż zestawu jednorazowego użytku o wysokim przepływie do zbioru, mycia i zagęszczania hMSC. (A) Schemat zestawu po podłączeniu worków do odpowiednich przewodów. (B) 10-warstwowa wielowarstwowa kolba połączona z zestawem jednorazowego użytku o wysokim przepływie z niestandardowym zespołem przewodów. (C) Wizualizacja stabilnego złoża komórek fluidalnych utworzonych w komorze przeciwprądowej za pomocą funkcji kamery włączonej w graficznym interfejsie użytkownika oprogramowania do wirowania przeciwprądowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Porównanie morfologii komórek i ekspansji hMSC w pożywce zawierającej surowicę i pożywce SFM XF. (A) Reprezentatywna morfologia komórek hMSC w klasycznej pożywce surowicy i pożywce SFM XF. Komórki rozszerzone SFM XF wykazywały dłuższą, wrzecionowatą, charakterystyczną morfologię podobną do fibroblastów, podczas gdy komórki wyhodowane w pożywce zawierającej surowicę wykazywały bardziej spłaszczoną morfologię. (B) Średnia wielkość MSC między pożywką zawierającą surowicę a pożywką SFM XF, mierzona za pomocą automatycznego licznika komórek (n = 3). Wyraźnie widać, że komórki rozszerzone przez SFM XF były na ogół większe niż komórki rozprężone w surowicy w różnych kanałach. Całkowita wydajność komórek w różnych pasażach (n = 3) (C) pod względem liczby komórek na powierzchnię hodowli i (D) poziomy podwojenia populacji. Podobne poziomy wydajności komórek uzyskano między pożywką SFM XF a pożywką zawierającą surowicę w różnych pasażach. Dane są wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Charakterystyka komórek przetwarzanych za pomocą systemu wirowania przeciwprądowego. (A) Całkowita liczba komórek zdolnych do życia przed i po myciu i koncentracji. (B) Osiągnięto 10-krotne zmniejszenie objętości po przetwarzaniu wirowania przeciwprądowego. (C) Całkowity odzysk i żywotność komórek. Dane są uśredniane z trzech powtórzeń biologicznych (n = 3) przebiegów płukania i zatężania. Dane są wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza krytycznych atrybutów jakości. (A) Reprezentatywne dane z cytometrii przepływowej. (B) Reprezentatywne obrazy przedstawiające całkowitą jtk. (C) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe różnicowania trójliniowego. (D) Wyniki analizy ekspresji cytokin przed i po przetworzeniu komórek w systemie wirowania przeciwprądowego (n = 3). Dane są wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Sekwencja pobierania hMSC przez trypsynizację, mycie i protokół koncentracji w systemie wirowania przeciwprądowego, w tym początkowe etapy zalewania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy wykazaliśmy zdolność do zamykania i półautomatyzacji dysocjacji hMSC oraz mycia i zbioru na stole za pomocą przyrządu do wirowania przeciwprądowego. Jednym z krytycznych kroków w całym przepływie pracy jest upewnienie się, że rurki są podłączone zgodnie z wstępnie ustawionym protokołem zdefiniowanym w konstruktorze protokołów systemu wirowania przeciwprądowego. Konfiguracja i obsługa są proste, a czas potrzebny na przetworzenie około 2 litrów kultury z 10-warstwowej kolby od montażu zestawu do zbioru komórek wynosił około 60 minut. Jednym z etapów ograniczających w tym przepływie pracy jest przenoszenie płynu z wielowarstwowej kolby do worków transferowych połączonych z przyrządem do wirowania przeciwprądowego. Jednorazowy zestaw o wysokim przepływie może pracować tylko przy maksymalnym natężeniu przepływu 165 ml/min, co może być trudne w przypadku przetwarzania, na przykład kolby 40-warstwowej. Aby przyspieszyć proces przenoszenia płynu, można użyć zewnętrznych pomp o dużym przepływie, aby najpierw przenieść trypsynizowaną zawartość do worka transferowego, a następnie umyć/zagęścić i zebrać komórki z worka transferowego za pomocą systemu wirowania przeciwprądowego. Co więcej, protokół ten może być również stosowany do pasażowania komórek od 4-warstwowych do 10-warstwowych kolb wielowarstwowych. W dalszej części łańcucha dostaw system wirowania przeciwprądowego można również zoptymalizować pod kątem mycia rozmrożonych hMSC oraz bezpośredniego zbioru i preparatu do wielowarstwowych kolb w celu uruchomienia układu nasion. Należy zauważyć, że minimalna liczba komórek wymagana do uformowania złoża fluidalnego w komorze wirowania przeciwprądowego wynosi około 30 milionów komórek, a maksymalna zalecana objętość do przetworzenia na partię wynosi 20 l.

Obecnie mocowanie niestandardowego zespołu przewodów do wielowarstwowej kolby w komorze bezpieczeństwa biologicznego i autoklawowanie części komponentów nie jest pożądane w warunkach cGMP. Alternatywnie, niestandardowy zespół rurek sterylizowanych promieniami gamma można zlecić dostawcom. Dostawcy dostarczający kolby wielowarstwowe oferują również możliwość wstępnego wyposażenia kolb w żądane zespoły przewodów, w tym filtr 0,2 μm, oraz sterylizację promieniami gamma całego zestawu. Zapewniłoby to, że wielowarstwowe kolby i dołączone rurki są naprawdę zamknięte, co oznacza, że proces mógłby zostać zakończony na stole w pomieszczeniu czystym klasy C.

Proces ten wykorzystujący system wirowania przeciwprądowego nie ogranicza się do hodowanych komórek na bazie adherentów w wielowarstwowym naczyniu i może być dostosowany do dynamicznych (bioreaktory zbiornikowe z mieszadłem lub falowe) i statycznych (przepuszczalnych dla gazu) platform do rozprężania komórek opartych na zawiesinie. W szczególności, w przypadku hMSC namnażonych w kulturach mikronośników 3D, protokoły w systemie wirowania przeciwprądowego mogą być optymalizowane w celu zbierania, mycia i formułowania hMSC oddzielonych od mikronośników.

Ogólnie rzecz biorąc, rosnące zainteresowanie opracowywaniem translacyjnych terapii komórkowych o zwiększonej odporności i niezawodności procesów doprowadziło do opracowania zamkniętych, zautomatyzowanych platform przetwarzania komórek. Systemy te są niezbędne, ponieważ zmniejszają liczbę etapów obsługi, zapobiegają potencjalnemu zanieczyszczeniu przez sterylne połączenia i obniżają koszty produkcji poprzez zmniejszenie nakładu pracy i zwiększenie efektywnego wykorzystania przestrzeni w pomieszczeniach czystych21. W związku z tym wielu twórców produktów terapii komórkowej, którzy starają się o zgodę organów regulacyjnych na tłumaczenie swoich terapii, zdaje sobie sprawę z tego, jak ważne jest zamknięcie procesu i wdrożenie pełnej automatyzacji lub półautomatyzacji już na etapie rozwoju procesu 14,31,32.

Dzięki zastosowaniu przyjaznej dla przepisów pożywki SFM XF oraz wraz z odczynnikami pomocniczymi zgodnymi z 21 CFR GMP Part 11 i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi jakości, ten półautomatyczny proces byłby z łatwością odpowiedni do produkcji klinicznej. Wykazaliśmy powtarzalność procesu zamkniętego i utrzymanie jakości WJ-MSC. Poprawa wydajności i bezpieczeństwa hodowli komórek opartych na adherentach w wielowarstwowych kolbach przyniosłaby korzyści nie tylko dziedzinie terapii hMSC, ale także firmom zajmującym się bankowaniem linii komórkowych i produkcją wirusów adherentnych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.J., A.B., R.L. i J.N. są pracownikami Thermo Fisher Scientific. A.L. i S.O. nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie ze strony funduszy Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) (H18/01/a0/021 i H18/AH/a0/001) z A*STAR, Singapur.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Worek transferowy 2L PVCTerumoBCTBB*B200TM
Niebieski roztwór Alcian, pH 2,5Merck101647
Roztwór do barwienia alizaryny i czerwieni MerckTMS-008-C
APC anty-ludzkie przeciwciało CD73Biolegend344015
Mysz APC IgG1 i kappa; Isotype Ctrl (FC) PrzeciwciałoBiolegend400121
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Multiplex Systemprzeciwprądowego Bio-Rad
Thermo Fisher ScientificA47679Gibco CTS Rotea System wirowania przeciwprądowego
Crystal VioletSigma-aldrichC0775
CTS (L-alanylo-L-glutamina) Suplement GlutaMAXThermo Fisher ScientificA1286001
CTS Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Thermo Fisher ScientificA1285601bez wapnia, bez magnezu
CTS Rekombinowana ludzka witronektyna (VTN-N)Thermo Fisher ScientificA27940
CTS TrypLE Select EnzymeThermo Fisher ScientificA1285901
Niestandardowy montażprzewodówSaint-Gobain and Colder Product Company (CPC)N/ASterylizowane promieniami gamma 3/32" Linia ID PVC wyposażona w sterylny męski MPC (zadzior 1/8") i uszczelniona na drugim końcu. Autoklaw to krótka linia C-Flex wyposażona w sterylne złącze portu Cell Factory na jednym końcu i żeńskie MPC (zadzior 3/8") na drugim. Podłącz linie PVC i C-Flex w komorze bezpieczeństwa biologicznego
Kapsułka Emflon II (filtr 0,2um)PallKM5V002P2G100
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher Scientific12662029Regiony kwalifikowane do mezenchymalnych komórek macierzystych, zatwierdzone przez USDA
FGF-basicThermo Fisher ScientificPHG0024
FITC anty-ludzkie przeciwciało CD105Biolegend323203
FITC anty-ludzkie przeciwciało CD45Biolegend304005
FITC anty-ludzkie przeciwciało CD90 (Thy1)Biolegend328107
FITC IgG1 myszy itp.; Isotype Ctrl (FC) Przeciwciało Biolegend400109
Zestaw jednorazowego użytku Hi-FlowThermo Fisher ScientificA46575Jednorazowy zestaw Gibco CTS Rotea Hi-flow, natężenie przepływu 30 – 165 mL/min
Systemy wielowarstwowe Thermo Fisher Scientific140360 (4-warstwowe); 140410 (10-warstwowe)Nunc Standard Cell Factory Systems
Licznik NucleoCounter NC-3000ChemometecNC-3000
Roztwór barwiący O w kolorze czerwonym olejowymMerck102419
PDGF-BBThermo Fisher ScientificPHG0045
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122
Przeciwciało anty-ludzkie CD34 BiolegendPerCP 343519
Mysz PerCP IgG1, κ Isotype Ctrl PrzeciwciałoBiolegend400147
ProcartaPlex Multipleksowe testy immunologiczneThermo Fisher ScientificNiestandardowy panel 19-Plex: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alfa, VEGF-A 
Port próbkiThermo Fisher ScientificA50111Sterylizowany promieniami gamma port próbki leur z dołączonymi 2 liniami PVC
Zestaw do różnicowania adipogenezy StemProThermo Fisher ScientificA10070-01
StemPro Różnicowanie chondrocytówThermo Fisher ScientificA10071-01
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium)Thermo Fisher ScientificME20236L1zawiera StemPro MSC SFM Basal Medium i niestandardowy suplement MSC SF XF (100x)
StemPro Zestaw do różnicowania osteogenezyThermo Fisher ScientificA10072-01
T175 Nunc EasYFlaskThermo Fisher Scientific159910
T75 Nunc EasYFlaskThermo Fisher Scientific156472
TGFβ 1Thermo Fisher ScientificPHG9204
WJ MSCs Komórka PromoCell(#C12971; Niemcy)Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste
i alfa; Pożywka MEMThermo Fisher Scientific12571063Z nukleozydami
wirowania

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 24(2021).
  2. García-Bernal, D., et al. The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664(2021).
  3. Mastrolia, I., et al. Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review. Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).
  4. Jovic, D., et al. A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).
  5. Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process. Cells. 10, 1320(2021).
  6. Fernández-Santos, M. E., et al. Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome. Frontiers in Immunology. 13, 918565(2022).
  7. Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).
  8. Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472(2021).
  9. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), (2020).
  10. Fričová, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease. npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20(2020).
  11. Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products. Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).
  12. James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
  13. Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).
  14. Doulgkeroglou, M. N., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).
  15. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).
  16. Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A. Engineering Strategies for Regenerative Medicine. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. , Academic Press. Cambridge, MA. 33-71 (2020).
  17. Tsai, A. -C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96(2021).
  18. Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing. Frontiers in Pharmacology. 11, 654(2020).
  19. Mizukami, A., Swiech, K. Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization. Stem Cells International. 2018, 4083921(2018).
  20. Hassan, M., et al. Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2020, 9529465(2020).
  21. Li, A., et al. Advances in automated cell washing and concentration. Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).
  22. Mehta, S. Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing. Cytotherapy. 16, Supplement 101(2014).
  23. Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing. Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).
  24. Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  25. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  26. Li, A., James, D., Lim, R. The Gibco™ CTS™ Rotea™ system story-A case study of industry-academia collaboration. Gene Therapy. , (2021).
  27. Li, A., et al. Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation. Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).
  28. Li, A., et al. Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing. Journal of Visualized Experiments. (154), e60423(2019).
  29. Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).
  30. Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells. Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).
  31. Smith, D., et al. Towards automated manufacturing for cell therapies. Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).
  32. Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesenchymal Stem CellsStem Cell ProcessingClosed Automated WorkflowCounterflow CentrifugationWharton s Jelly MSCsSerum Free MediumCell HarvestingColony Forming UnitsTrilineage DifferentiationSurface Marker Expression

Related Articles