Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64709

⸱

3 lutego 2023

 ,  ,  , 
1CEFE, University of Montpellier, CNRS, EPHE, IRD, Montpellier, France, 2ISEM, University of Montpellier, CNRS, EPHE, IRD, Montpellier, France

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy opłacalną metodę śledzenia dynamiki alleli polimorfizmu niepojedynczego nukleotydu, którą można łatwo dostosować do eksperymentalnej ewolucji zamrożonych archiwów. Technikę tripletowej PCR połączono z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną w celu ilościowego określenia względnej częstości allelu insercji w trakcie ewolucji eksperymentalnej.

Streszczenie

Warianty strukturalne (SV) (tj. delecje, insercje, duplikacje i inwersje) są teraz znane z tego, że odgrywają ważną rolę w zmienności fenotypowej, a w konsekwencji w procesach takich jak determinacja choroby lub adaptacja do nowego środowiska. Jednak wariantom pojedynczych nukleotydów poświęca się znacznie więcej uwagi niż SV, prawdopodobnie dlatego, że są łatwiejsze do wykrycia, a ich efekty fenotypowe są łatwiejsze do przewidzenia. Rozwój technologii głębokiego sekwencjonowania z krótkim i długim odczytem znacznie poprawił wykrywanie SV, ale kwantyfikacja ich częstotliwości na podstawie danych sekwencjonowania zbiorczego (poolseq) jest nadal technicznie złożona i kosztowna.

Tutaj prezentujemy raczej prostą i tanią metodę, która pozwala badaczom śledzić dynamikę częstości allelu SV. Jako przykład zastosowania śledzimy częstotliwość insercji sekwencji insercyjnej (IS) w eksperymentalnych populacjach ewolucyjnych bakterii. Metoda ta opiera się na zaprojektowaniu trójek starterów wokół granic wariantów strukturalnych, tak aby amplikony wytworzone przez amplifikację alleli typu dzikiego (WT) i pochodne różniły się wielkością o co najmniej 5%, a ich skuteczność amplifikacji była podobna. Ilość każdego amplikonu jest następnie określana za pomocą równoległej elektroforezy kapilarnej i normalizowana do krzywej kalibracyjnej. Metodę tę można łatwo rozszerzyć na kwantyfikację częstości występowania innych wariantów strukturalnych (delecje, duplikacje i inwersje) oraz na podejścia typu pool-seq w populacjach naturalnych, w tym w populacjach patogenów wewnątrzszpitalnych.

Wprowadzenie

Warianty strukturalne (SVs) to zmiany sekwencji genomowej, zazwyczaj wpływające na 50 pz lub więcej. Cztery kategorie opisanych SV to duże insercje, duże delecje, inwersje i duplikacje. Do niedawna więcej uwagi poświęcano wariantom pojedynczych nukleotydów (SNV) niż wariantom strukturalnym, pod względem ich skutków fenotypowych i roli jako genetycznych uwarunkowań choroby lub ich wkładu w adaptację. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że łatwiej jest zarówno wykryć SNV, jak i przewidzieć ich skutki fenotypowe. Jednak technologie głębokiego sekwencjonowania z krótkim i długim odczytem znacznie poprawiły wykrywanie SV, przynajmniej w pojedynczych genomach osobniczych lub klonalnych1. Równolegle ich efekty fenotypowe zostały lepiej scharakteryzowane, a wiele przykładów ich implikacji jako genetycznych determinantów chorób u ludzi 2,3 lub adaptacji do nowego środowiska4 zostało udokumentowanych.

Delecje i insercje, często spowodowane insercjami ruchomych elementów genetycznych (MGE), są znacznie bardziej uciążliwe niż polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) i prowadzą do mutacji przesunięcia ramki i modyfikacji struktury białka. Delecje i inserkcje MGE w obrębie genów prawie zawsze powodują inaktywację genów, a inserkcje do regionów niekodujących mogą prowadzić do represji lub konstytutywnej ekspresji sąsiednich genów, gdy sekwencje insercji (IS) zawierają sekwencje promotora lub terminacji5. Podczas gdy nokaut niezbędnych genów prowadzi do wyraźnego szkodliwego wpływu na sprawność bakterii, utrata nieistotnych genów jest w niektórych przypadkach korzystna. Pomimo nieodłącznych kosztów, duplikacje mogą być również korzystne i uczestniczyć w adaptacji, ponieważ prowadzą do zmiany dawki genów; Wzrost aktywności określonego białka może być korzystny w zależności od warunków6.

Eksperymentalne populacje ewolucji mikrobiologicznej są zwykle rozpoczynane od klonów. Ten początkowy brak różnorodności genetycznej, w połączeniu z "zamkniętym środowiskiem" charakterystycznym dla probówek, prowadzi do bardzo ograniczonego potencjału ewolucji przez pozyskiwanie genów poprzez horyzontalny transfer genów i rekombinację. W tych specyficznych warunkach szczególnie ważny jest wkład w adaptację delecji, duplikacji i intragenomowej insercji MGE; Bakterie często adaptują się poprzez mutacje powodujące utratę funkcji (głównie z powodu delecji lub insercji MGE), wpływając na geny, które nie są przydatne w stabilnych, często bogatych w składniki odżywcze, monokulturowych sztucznych środowiskach7. W najdłużej trwającym eksperymencie ewolucji E. coli, inserpcje IS150 są szczególnie częste wśród populacji, które wyewoluowały po 50 000 pokoleń, przy czym elementy IS stanowią 35% mutacji, które osiągają wysoką częstotliwość w populacjach, które zachowują swój wskaźnik mutacji punktowych przodków8.

Ewolucja i badania nad resekwencją łączą eksperymentalne technologie ewolucji i sekwencjonowania nowej generacji (NGS), aby zbadać, jak bakterie adaptują się, na poziomie fenotypowym i genomowym, do różnych warunków środowiskowych i stresów, takich jak różne źródła węgla i energii, antybiotyki i stres osmotyczny9,10,11. Badania te zazwyczaj uzyskują informacje genomowe na temat wyewoluowanych populacji lub klonów wyłącznie w eksperymentalnym punkcie końcowym, a w niektórych przypadkach w kilku pośrednich punktach czasowych12,13,14. Dane te dostarczają informacji na temat genów i szlaków zaangażowanych w adaptację do danego środowiska, ale rzadko pozwalają naukowcom śledzić dynamikę pojawiających się i zanikających alleli de novo w czasie.

Jednym z podejść do śledzenia tej dynamiki jest wybranie ograniczonej liczby interesujących nas alleli segregacji (ze względu na funkcję genów, na które wpływają, ponieważ poruszają się równolegle w niezależnych populacjach, itp.) i użycie sekwencjonowania amplikonów do ilościowego określenia proporcji alleli, łącząc wiele punktów czasowych w tym samym przebiegu sekwencjonowania15. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do śledzenia dynamiki wariantów o małych rozmiarach (SNP lub indele 1 bp) w eksperymentalnych16 i natural17 populacjach drobnoustrojów. Jednak w przypadku większych indeli lub insercji MGE różnica wielkości amplikonów indukuje różnice w wydajności PCR, które zniekształcają zależność między proporcjami odczytu i alleli. W niektórych przypadkach różnica wielkości między dwoma allelami jest większa niż klasyczna długość amplikonu. W tym przypadku połączyliśmy technikę tripletowej PCR z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną, aby określić ilościowo względną częstość allelu insercji w oparciu o dyskryminację wielkości. Podejście to pozwala na wykorzystanie niedostatecznie wykorzystanych eksperymentalnych punktów czasowych w celu określenia dynamiki pojawiającego się zmutowanego allelu i śledzenia jego częstości do utrwalenia lub utraty, w opłacalny sposób. Zastosowaliśmy tę metodę do śledzenia pojawiających się alleli mutS-, zmutowanych poprzez insercję IS10, zapewniając zmutowanemu genotypowi fenotyp hipermutatora.

Ta metoda wymaga dwóch docelowych alleli o ≥5% różnicy wielkości. Po pierwsze, trojaczki starterów są zaprojektowane tak, aby wytwarzać fragmenty o podobnej wielkości, które mają wspólny starter. Po drugie, optymalizuje się warunki PCR, a krzywą kalibracyjną wytwarza się przy użyciu mieszanin dzikiego typu (WT) i zmutowanego gDNA. Na koniec próbki są amplifikowane przez PCR, a względna częstość każdego allelu jest określana ilościowo za pomocą równoległej ilościowej elektroforezy kapilarnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przygotowanie tego protokołu wymaga precyzyjnej wiedzy na temat punktu insercji, delecji, inwersji lub duplikacji w sekwencji przodka. Informacje te są zazwyczaj pozyskiwane poprzez sekwencjonowanie całego genomu (WGS) próbek z punktu końcowego lub pośredniego. W poniższym protokole dla każdego kroku przedstawiono ogólną zasadę dla przypadku mutacji insercyjnej, a obok niej reprezentatywny przypadek, w którym śledzono częstotliwość insercji IS10 w genie mutS w populacji eksperymentalnej ewolucji E. coli. W tej populacji WGS populacji końcowej zidentyfikowało insercję IS10 o długości 1 329 bp między pozycjami 2 463 a 2 471, co doprowadziło do duplikacji tego miejsca insercji. Metoda ta jest stosowalna do trzech pozostałych typów SV, a specyfika każdego przypadku została opisana w dyskusji.

1. Projektowanie starterów tripletowych

  1. Zastosuj klasyczne zasady projektowania starterów (18-24 bp, zawartość GC 40%-60%, rozpoczęcie i zakończenie parą G/C w miarę możliwości, różnica Tm < 5 °C), aby opracować startery FW1 i RV1. Zaprojektuj startery tak, aby amplifikować krótki amplikon w allelu WT w obrębie miejsca insercji allelu zmutowanego (Rysunek 1).
    UWAGA: Rozmiar amplikonu może wynosić od 100 bp do 3 000 bp, zgodnie z zakresem drabinki DNA stosowanej w elektroforezie kapilarnej. W tym przykładzie amplifikowano amplikon o wielkości 155 bp. Wybrany tutaj niewielki rozmiar fragmentu zapobiega niespecyficznej amplifikacji całej sekwencji insercyjnej IS10 (patrz sekcja 2).
  2. Zaprojektuj drugi starter forward FW2 w obrębie sekwencji insercyjnej, aby uzyskać drugi amplikon, który jest o około 5% większy lub mniejszy od amplikonu WT (Rysunek 1). Ta 5-procentowa różnica w rozmiarze jest minimalną różnicą, którą urządzenie do równoległej elektroforezy kapilarnej może wiarygodnie rozróżnić. W związku z tym zaprojektuj startery tak, aby dwa amplikony różniły się rozmiarem powyżej progu względnego, ale możliwie najbliżej niego.
    UWAGA: Należy zadbać o zminimalizowanie różnicy Tm oraz tworzenia się dimerów starterów. W tym przykładzie drugi starter forward został zaprojektowany tak, aby uzyskać amplikon o wielkości 226 bp, czyli o 71 bp większy od amplikonu WT. W tym reprezentatywnym przykładzie sekwencje starterów są następujące:
    FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC
    RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC
    FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG

schemat genu mutS z insercją IS10, przedstawiający proces PCR i pozycje starterów do analizy.
Rysunek 1: Schemat projektowania tripletu starterów dla genu mutS WT oraz mutanta z insercją IS10 w genie mutS. Czarny trójkąt reprezentuje miejsce insercji IS10 w genie mutS. Gen WT zaznaczono kolorem niebieskim, a IS10 kolorem pomarańczowym. Startery FW1 i RV1 wyznaczają miejsce insercji IS10 i generują amplikon WT o długości 155 bp. Starter RV1 oraz starter wewnątrz-IS10 FW2 generują drugi amplikon o długości 226 bp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Optymalizacja warunków PCR

  1. Wyhodować nocną kulturę utrwalonych klonów typu dzikiego (WT) oraz klonów z allelem zmutowanym.
  2. Wyizolować DNA przy użyciu dowolnego zestawu.
  3. Oznaczyć stężenie DNA.
  4. Przygotować próbki DNA poprzez rozcieńczenie wyizolowanego DNA typu dzikiego oraz zmutowanego do stężenia 5 ng/µL. Wymieszać obie próbki DNA w stosunku 50/50.
  5. Amplifikować 10 ng z trzech próbek DNA (WT, zmutowana, mieszanina 50/50), stosując 2x gotowy do użycia master mix PCR, 0,5 µM startera FW1, 1 µM startera RV1 oraz 0,5 µM startera FW2 w objętości reakcyjnej 20 µL. Do rozdziału produktów PCR metodą klasycznej elektroforezy użyć żelu agarozowego 2% i wyznaczyć optymalne warunki PCR.
    UWAGA: Czas elongacji należy zminimalizować, aby zapobiec powstawaniu amplikonu FW1 i RV1 w allelu zmutowanym. Temperaturę przyłączania (annealing) należy dobrać tak, aby zminimalizować stronniczą amplifikację alleli oraz amplifikację nieswoistą.
    1. Aby zastosować program opisany w tym przykładzie, użyć następujących ustawień: 98 °C przez 10 s, następnie 25 cykli: 98 °C przez 1 s, 58 °C przez 15 s, 72 °C przez 8 s oraz końcowy etap elongacji w 72 °C przez 1 min.
      ​UWAGA: Czas elongacji został skrócony do 8 s, aby zapobiec amplifikacji produktu o długości >1 000 bp powstającego z zastosowaniem startera forward i startera RV1 w allelu zmutowanym (mutS z insercją IS10).

3. Krzywa kalibracyjna

  1. Wymieszać dwie próbki DNA, WT oraz mutant, w proporcjach 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 i 90/10.
    UWAGA: Powtórzenia biologiczne są przygotowywane z niezależnych nocnych kultur bakteryjnych.
  2. Przeprowadzić amplifikację, stosując zoptymalizowane warunki PCR (patrz sekcja 2).
  3. Oznaczyć ilość produktu amplikonowego.
  4. Rozcieńczyć produkty PCR do stężenia 0,1 ng/µL.
  5. Przygotować aparat do równoległej elektroforezy kapilarnej.
    1. Wymieszać świeży żel i barwnik (zestaw do analizy ilościowej NGS (22, 33 lub 55); w tym przykładzie fragmenty HS NGS 1-6 000 bp).
      UWAGA: Szczegółowe instrukcje znajdują się w przewodniku do analizy fragmentów HS NGS w równoległej elektroforezie kapilarnej (patrz Tabela materiałów).
  6. Wymienić roztwór do przechowywania kapilar oraz bufor wlotowy, a następnie umieścić płytkę z buforem płuczącym w odpowiednich szufladach aparatu do równoległej elektroforezy kapilarnej.
  7. Do 22 µL każdej rozcieńczonej próbki na płytce 96-dołkowej dodać 2 µL markera rozcieńczającego HS.
  8. Do jednego dołka płytki 96-dołkowej dodać drabinę wielkości (drabina wielkości DNA; zakres 1-6 000 bp) z zestawu do analizy ilościowej HS NGS.
  9. Umieścić płytkę 96-dołkową w odpowiedniej szufladzie aparatu do równoległej elektroforezy kapilarnej i wybrać opcję Run w oprogramowaniu aparatu.
  10. Przeanalizować wyniki za pomocą oprogramowania do analizy danych, które wykrywa i identyfikuje każdy pik drabiny wielkości, przypisując piki próbek do ich znanej rzeczywistej wielkości.
    1. W przypadku korzystania z zestawu ilościowego, użyć oprogramowania do określenia ilości DNA każdego fragmentu poprzez całkowanie pola pod pikiem, analogicznie do analizy danych chromatograficznych. Ponownie, porównać próbki z known amounts w standardach, aby określić ilość każdego piku z próbki i obliczyć stosunki między różnymi pikami wykrytymi w próbkach.
    2. Sporządzić krzywą kalibracyjną (Rysunek 2), wiążąc znaną proporcję allelu mutantowego (mieszanina DNA) z wartością zmierzoną za pomocą aparatu do równoległej elektroforezy kapilarnej. Krzywa kalibracyjna ta pozwala na ocenę wiarygodności metody i skorygowanie niewielkich błędów amplifikacji.

4. Przygotowanie próbek

  1. Próbki z poszczególnych punktów czasowych inkubować przez noc w standardowych warunkach.
  2. Wyizolować DNA.
  3. Oznaczyć ilość DNA.
  4. Przeprowadzić amplifikację próbek przy użyciu zoptymalizowanych warunków PCR (patrz sekcja 2).
  5. Próbki poddać analizie w urządzeniu do równoległej elektroforezy kapilarnej (patrz kroki 3.5-3.10).

5. Ilościowe oznaczanie alleli

  1. Za pomocą oprogramowania wyodrębnij ilości alleli mutantowych z danych urządzenia do kapilarnej elektroforezy równoległej, a następnie oblicz rzeczywiste proporcje, nanosząc te wartości na krzywą kalibracyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując DNA wyekstrahowane z klonu przodka oraz klonu hipermutatora wyizolowanego z populacji S2.11 w pokoleniu 1 000, ustaliliśmy krzywą kalibracyjną przedstawioną na Rysunku 2. Rzeczywiste proporcje mutantów w przygotowanych laboratoryjnie mieszaninach DNA, zmierzone za pomocą urządzenia do kapilarnej elektroforezy równoległej, były powiązane liniowo z nachyleniem 1,0706 i współczynnikiem R2 wynoszącym 0,9705. Ponadto odnotowano dobrą zgodność między powtórzeniami biologic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu zaproponowaliśmy opłacalną metodę, która pozwala śledzić dynamikę pojawiających się adaptacyjnych alleli SV w eksperymentalnych populacjach ewolucyjnych. Metoda ta łączy klasyczne techniki PCR i zautomatyzowaną równoległą elektroforezę kapilarną, co pozwala na określenie względnych ilości dwóch alleli. Po skonfigurowaniu pozwala na ilościowe określenie proporcji alleli w wielu próbkach równolegle i jest znacznie tańsze niż WGS. Metoda ta może być postrzegana jako odpowiednik sekwencjonowania amplikonów dla ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) do S.B. Dane użyte w tej pracy zostały (częściowo) wygenerowane przez urządzenia techniczne GenSeq Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier przy wsparciu LabEx CeMEB, programu ANR "Investissements d'avenir" (ANR-10-LABX-04-01).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96 Płytka do PCR z grubą spódnicą4titude4Ti - 0740PCR
Klasa biologii molekularnej agarozyEurogentecEP-0010-05Elektroforeza w żelu agarozowym 
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Skrócona instrukcja obsługi dla systemów analizatora fragmentówAgilentInstrukcja obsługi PDF
Bufor TBEPanreac appliChemA4228,5000PcElektroforeza w żelu agarozowym 
Kalibrowane jednorazowe pętle i igły do zaszczepianiaLABELIANS8175CSR40HHodowla bakterii
Dneasy Zestaw do krwi i tkanekQiagen69506Ekstrakcja DNA
Zasilacz do elektroforezyAmilaboST606TElektroforeza w żelu agarozowym 
Analizator fragmentów Zautomatyzowany system CEAgilentRównoległa elektroforeza kapilarna
Drabinka fragmentu DNAAgilentDNF-396, zakres 1-6000bpRównoległa elektroforeza kapilarna
BIOODCZYNNIK DO SOLI SIARCZANU GENTAMYCYNYSigma-AldrichG1264-1GKultura bakteryjna
Marker rozcieńczalnika o wysokiej czułościAgilentDNF-373Kapilara równoległa elektroforeza
Zestaw do analizy ilościowej NGS o wysokiej czułościAgilentDNF-474Równoległa elektroforeza kapilarna
Drabinka szybkiego obciążenia 1 kb plus drabinka DNANEBN0469SElektroforeza w żelu agarozowym 
LB Broth, VegitoneNutriSelect PlusMillipore28713Kultura bakteryjna
Master Mix PCR High Fidelity Phusion FlashThermo Fisher ScientificF548LPCR
Primers OprogramowanieEurogentecPCR
Prosize v.4AgilentV.4Równoległa elektroforeza kapilarna
Testy kubitoweInvitrogenMAN0010876Kwantyfikacja DNA Zestaw do oznaczania jakości HS
QBIT SDSTECHNOLOGIES SASQ32854Kwantyfikacja DNA
TermocyklerEppendorfGradienty EpPCR
UVbox, eBOX VX5Vilber LourmatWizualizacja elektroforezy w żelu agarozowym
Woda do preparatu do wstrzykiwańAguettantPROAMPPCR
do analizy danych LIFE

Bibliografia

  1. Mahmoud, M., et al. Structural variant calling: the long and the short of it. Genome Biology. 20 (1), 246(2019).
  2. Bragg, D. C., et al. Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).
  3. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nature Communications. 5, 4846(2014).
  4. Tenaillon, O., et al. The molecular diversity of adaptive convergence. Science. 335 (6067), 457-461 (2012).
  5. Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability. Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).
  6. Andersson, D. I., Gene Hughes, D. amplification and adaptive evolution in bacteria. Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).
  7. Bailey, S. F., Bataillon, T. Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature. Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).
  8. Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980(2021).
  9. Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer. bioRxiv. , (2022).
  10. Slomka, S., et al. Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects. Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).
  11. Choudhury, D., Saini, S. Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations. Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).
  12. Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
  13. Behringer, M. G., et al. Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).
  14. Voordeckers, K., et al. Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways. PLoS Genetics. 11 (11), 1005635(2015).
  15. Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
  16. Bruger, E. L., Marx, C. J. A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution. Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).
  17. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8(2019).
  18. Bedhomme, S., et al. Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer. Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).
  19. Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria. Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ewolucja eksperymentalnaczęstość allelielektroforeza kapilarnaprojektowanie starterówsekwencja insercyjnaamplifikacja PCRpopulacje bakteryjnekrzywa kalibracyjnagen MutS
Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.