Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach

Summary

Opracowaliśmy opłacalną metodę śledzenia dynamiki alleli polimorfizmu niepojedynczego nukleotydu, którą można łatwo dostosować do eksperymentalnej ewolucji zamrożonych archiwów. Technikę tripletowej PCR połączono z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną w celu ilościowego określenia względnej częstości allelu insercji w trakcie ewolucji eksperymentalnej.

Abstract

Warianty strukturalne (SV) (tj. delecje, insercje, duplikacje i inwersje) są teraz znane z tego, że odgrywają ważną rolę w zmienności fenotypowej, a w konsekwencji w procesach takich jak determinacja choroby lub adaptacja do nowego środowiska. Jednak wariantom pojedynczych nukleotydów poświęca się znacznie więcej uwagi niż SV, prawdopodobnie dlatego, że są łatwiejsze do wykrycia, a ich efekty fenotypowe są łatwiejsze do przewidzenia. Rozwój technologii głębokiego sekwencjonowania z krótkim i długim odczytem znacznie poprawił wykrywanie SV, ale kwantyfikacja ich częstotliwości na podstawie danych sekwencjonowania zbiorczego (poolseq) jest nadal technicznie złożona i kosztowna.

Tutaj prezentujemy raczej prostą i tanią metodę, która pozwala badaczom śledzić dynamikę częstości allelu SV. Jako przykład zastosowania śledzimy częstotliwość insercji sekwencji insercyjnej (IS) w eksperymentalnych populacjach ewolucyjnych bakterii. Metoda ta opiera się na zaprojektowaniu trójek starterów wokół granic wariantów strukturalnych, tak aby amplikony wytworzone przez amplifikację alleli typu dzikiego (WT) i pochodne różniły się wielkością o co najmniej 5%, a ich skuteczność amplifikacji była podobna. Ilość każdego amplikonu jest następnie określana za pomocą równoległej elektroforezy kapilarnej i normalizowana do krzywej kalibracyjnej. Metodę tę można łatwo rozszerzyć na kwantyfikację częstości występowania innych wariantów strukturalnych (delecje, duplikacje i inwersje) oraz na podejścia typu pool-seq w populacjach naturalnych, w tym w populacjach patogenów wewnątrzszpitalnych.

Introduction

Warianty strukturalne (SVs) to zmiany sekwencji genomowej, zazwyczaj wpływające na 50 pz lub więcej. Cztery kategorie opisanych SV to duże insercje, duże delecje, inwersje i duplikacje. Do niedawna więcej uwagi poświęcano wariantom pojedynczych nukleotydów (SNV) niż wariantom strukturalnym, pod względem ich skutków fenotypowych i roli jako genetycznych uwarunkowań choroby lub ich wkładu w adaptację. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że łatwiej jest zarówno wykryć SNV, jak i przewidzieć ich skutki fenotypowe. Jednak technologie głębokiego sekwencjonowania z krótkim i długim odczytem znacznie poprawiły wykrywanie SV, przynajmniej w pojedynczych genomach osobniczych lub klonalnych¹. Równolegle ich efekty fenotypowe zostały lepiej scharakteryzowane, a wiele przykładów ich implikacji jako genetycznych determinantów chorób u ludzi ^2,3 lub adaptacji do nowego środowiska⁴ zostało udokumentowanych.

Delecje i insercje, często spowodowane insercjami ruchomych elementów genetycznych (MGE), są znacznie bardziej uciążliwe niż polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) i prowadzą do mutacji przesunięcia ramki i modyfikacji struktury białka. Delecje i inserkcje MGE w obrębie genów prawie zawsze powodują inaktywację genów, a inserkcje do regionów niekodujących mogą prowadzić do represji lub konstytutywnej ekspresji sąsiednich genów, gdy sekwencje insercji (IS) zawierają sekwencje promotora lub terminacji⁵. Podczas gdy nokaut niezbędnych genów prowadzi do wyraźnego szkodliwego wpływu na sprawność bakterii, utrata nieistotnych genów jest w niektórych przypadkach korzystna. Pomimo nieodłącznych kosztów, duplikacje mogą być również korzystne i uczestniczyć w adaptacji, ponieważ prowadzą do zmiany dawki genów; Wzrost aktywności określonego białka może być korzystny w zależności od warunków⁶.

Eksperymentalne populacje ewolucji mikrobiologicznej są zwykle rozpoczynane od klonów. Ten początkowy brak różnorodności genetycznej, w połączeniu z "zamkniętym środowiskiem" charakterystycznym dla probówek, prowadzi do bardzo ograniczonego potencjału ewolucji przez pozyskiwanie genów poprzez horyzontalny transfer genów i rekombinację. W tych specyficznych warunkach szczególnie ważny jest wkład w adaptację delecji, duplikacji i intragenomowej insercji MGE; Bakterie często adaptują się poprzez mutacje powodujące utratę funkcji (głównie z powodu delecji lub insercji MGE), wpływając na geny, które nie są przydatne w stabilnych, często bogatych w składniki odżywcze, monokulturowych sztucznych środowiskach⁷. W najdłużej trwającym eksperymencie ewolucji E. coli, inserpcje IS150 są szczególnie częste wśród populacji, które wyewoluowały po 50 000 pokoleń, przy czym elementy IS stanowią 35% mutacji, które osiągają wysoką częstotliwość w populacjach, które zachowują swój wskaźnik mutacji punktowych przodków⁸.

Ewolucja i badania nad resekwencją łączą eksperymentalne technologie ewolucji i sekwencjonowania nowej generacji (NGS), aby zbadać, jak bakterie adaptują się, na poziomie fenotypowym i genomowym, do różnych warunków środowiskowych i stresów, takich jak różne źródła węgla i energii, antybiotyki i stres osmotyczny9^,10,11. Badania te zazwyczaj uzyskują informacje genomowe na temat wyewoluowanych populacji lub klonów wyłącznie w eksperymentalnym punkcie końcowym, a w niektórych przypadkach w kilku pośrednich punktach czasowych^12,13,14. Dane te dostarczają informacji na temat genów i szlaków zaangażowanych w adaptację do danego środowiska, ale rzadko pozwalają naukowcom śledzić dynamikę pojawiających się i zanikających alleli de novo w czasie.

Jednym z podejść do śledzenia tej dynamiki jest wybranie ograniczonej liczby interesujących nas alleli segregacji (ze względu na funkcję genów, na które wpływają, ponieważ poruszają się równolegle w niezależnych populacjach, itp.) i użycie sekwencjonowania amplikonów do ilościowego określenia proporcji alleli, łącząc wiele punktów czasowych w tym samym przebiegu sekwencjonowania¹⁵. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do śledzenia dynamiki wariantów o małych rozmiarach (SNP lub indele 1 bp) w eksperymentalnych¹⁶ i natural¹⁷ populacjach drobnoustrojów. Jednak w przypadku większych indeli lub insercji MGE różnica wielkości amplikonów indukuje różnice w wydajności PCR, które zniekształcają zależność między proporcjami odczytu i alleli. W niektórych przypadkach różnica wielkości między dwoma allelami jest większa niż klasyczna długość amplikonu. W tym przypadku połączyliśmy technikę tripletowej PCR z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną, aby określić ilościowo względną częstość allelu insercji w oparciu o dyskryminację wielkości. Podejście to pozwala na wykorzystanie niedostatecznie wykorzystanych eksperymentalnych punktów czasowych w celu określenia dynamiki pojawiającego się zmutowanego allelu i śledzenia jego częstości do utrwalenia lub utraty, w opłacalny sposób. Zastosowaliśmy tę metodę do śledzenia pojawiających się alleli mutS^-, zmutowanych poprzez insercję IS10, zapewniając zmutowanemu genotypowi fenotyp hipermutatora.

Ta metoda wymaga dwóch docelowych alleli o ≥5% różnicy wielkości. Po pierwsze, trojaczki starterów są zaprojektowane tak, aby wytwarzać fragmenty o podobnej wielkości, które mają wspólny starter. Po drugie, optymalizuje się warunki PCR, a krzywą kalibracyjną wytwarza się przy użyciu mieszanin dzikiego typu (WT) i zmutowanego gDNA. Na koniec próbki są amplifikowane przez PCR, a względna częstość każdego allelu jest określana ilościowo za pomocą równoległej ilościowej elektroforezy kapilarnej.

Protocol

Konfiguracja tego protokołu wymaga dokładnej wiedzy na temat punktu wstawiania, usuwania, inwersji lub duplikacji w sekwencji przodków. Informacje te uzyskuje się zwykle za pomocą sekwencjonowania całego genomu (WGS) próbek z punktu końcowego lub pośredniego. W poniższym protokole podano ogólną zasadę dla przypadku mutacji insercyjnej dla każdego etapu, wraz z reprezentatywnym przypadkiem, w którym przestrzegana jest częstość insercji IS10 w genie mutS w eksperymentalnej populacji ewolucyjnej E. coli. W tej populacji WGS populacji punktu końcowego zidentyfikował insercję 1,329 pz IS10 między pozycjami 2,463 i 2,471, co spowodowało duplikację tego miejsca insercji. Metoda ta ma zastosowanie do trzech pozostałych typów SV, a specyfika każdego przypadku jest podana w dyskusji.

1. Projektowanie podkładów trypletowych

1. Stosuj klasyczne praktyki projektowania podkładów (18-24 pz, 40%-60% zawartości GC, zaczynaj/kończ parami G/C, jeśli to możliwe, różnica T_m < 5 °C) do produkcji starterów FW1 i RV1. Zaprojektuj startery do amplifikacji krótkiego amplikonu allelu WT wokół miejsca insercji zmutowanego allelu ( Rysunek 1).
   UWAGA: Wielkość amplikonu może wynosić od 100 pz do nawet 3,000 pz, zgodnie z drabinką wielkości DNA stosowaną w elektroforezie kapilarnej. W tym przykładzie amplikon o wartości 155 pz został wzmocniony. Wybrany tutaj mały rozmiar fragmentu zapobiega niedocelowemu wzmocnieniu całej sekwencji insercji IS10 (patrz sekcja 2).
2. Zaprojektuj drugi starter FW2 w sekwencji insercji, aby wytworzyć drugi amplikon, który jest o około 5% większy lub mniejszy niż amplikon WT (Rysunek 1). Ta 5% różnica wielkości to minimalna różnica rozmiarów, którą urządzenie do elektroforezy kapilarnej równoległej może niezawodnie rozróżnić. Dlatego należy zaprojektować startery w taki sposób, aby oba amplikony różniły się rozmiarem, który jest powyżej, ale jak najbliżej progu względnego.
   UWAGA: Pamiętaj, aby_{zminimalizować różnicę} TM i tworzenie się dimerów startera. W tym przykładzie drugi starter do przodu został zaprojektowany tak, aby wytworzyć amplikon o wartości 226 pz, czyli o 71 pz większy niż amplikon WT. W tym reprezentatywnym przykładzie sekwencje starterów są następujące:
   FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC
   RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC
   FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG

Rysunek 1: Schemat projektu startera trypletowego na genie mutS WT i insercji mutanta mutS IS10.trójkąt reprezentuje miejsce insercji IS10 w genie mutS. Gen WT jest w kolorze niebieskim, a IS10 w kolorze pomarańczowym. Startery FW1 i RV1 oznaczają miejsce insercji IS10 i wytwarzają amplikon WT o wartości 155 pz. Starter RV1 i starter intra-IS10 FW2 wytwarzają drugi amplikon o wartości 226 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Optymalizacja warunków PCR

1. Hoduj przez noc kulturę stałych WT i zmutowanych klonów alleli
.
2. Wyodrębnij DNA za pomocą dowolnego zestawu.
3. Określ ilościowo DNA.
4. Przygotować próbkę DNA, rozcieńczając ekstrakcję WT i zmutowanego DNA do 5 ng/μl. Wymieszać dwie próbki DNA w stosunku 50/50.
5. Amplifikować 10 ng z trzech próbek DNA (WT, mutant, mieszanka 50/50) za pomocą 2x gotowej do użycia mieszanki głównej PCR, 0,5 μM startera FW1, 1 μM startera RV1 i 0,5 μM startera FW2 w objętości reakcyjnej 20 μL. Użyj 2% żelu agarozowego, aby przeprowadzić migrację produktu PCR za pomocą klasycznej elektroforezy i określić optymalne warunki PCR.
   UWAGA: Czasy wydłużenia powinny być zminimalizowane, aby zapobiec tworzeniu się amplikonów FW1 i RV1 na zmutowanym allelu. Temperaturę wyżarzania należy dostosować, aby zminimalizować spolaryzowaną amplifikację alleli i amplifikację niespecyficzną.
   1. Aby postępować zgodnie z programem w tym przykładzie, użyj następujących ustawień: 98 °C przez 10 s, następnie 25 cykli po 98 °C przez 1 s, 58 °C przez 15 s, 72 °C przez 8 s i końcowy krok wydłużania w 72 °C przez 1 min.
      UWAGA: Czas wydłużenia został skrócony do 8 s, aby zapobiec amplifikacji produktu >1,000 pz ze startera do przodu i startera RV1 na zmutowanym allelu (mutS z insercją IS10).

3. Krzywa kalibracyjna

1. Wymieszaj dwie próbki DNA, WT i mutanta, w proporcjach 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 i 90/10.
   UWAGA: Kontrpróby biologiczne są przygotowywane z niezależnych kultur bakteryjnych zebranych przez noc.
2. Amplifikować przy użyciu zoptymalizowanych warunków PCR (patrz punkt 2).
3. Określ ilościowo produkt amplikonu.
4. Rozcieńczyć produkty PCR do 0,1 ng/μl.
5. Przygotuj przyrząd do równoległej elektroforezy kapilarnej.
   1. Wymieszaj świeży żel i barwnik (zestaw do analizy ilościowej NGS (22, 33 lub 55); HS NGS fragment 1-6,000 pz dla tego przykładu).
      UWAGA: Szczegółowe instrukcje można znaleźć w przewodniku po fragmentach równoległej elektroforezy kapilarnej HS NGS (patrz Tabela materiałów).
6. Wymień kapilarny roztwór do przechowywania i bufor wlotowy, a następnie umieść płytkę buforową płukania we właściwych miejscach szuflady przyrządu do elektroforezy kapilarnej równoległej.
7. Dodać 2 μl markera rozcieńczalnika HS do 22 μl każdej rozcieńczonej próbki na 96-dołkowej płytce.
8. Dodaj drabinkę wielkości (drabinka wielkości DNA; zakres 1-6,000 pz) z zestawu do analizy ilościowej HS NGS do jednego dołka na 96-dołkowej płytce.
9. Umieść 96-dołkową płytkę w odpowiedniej szufladzie przyrządu do równoległej elektroforezy kapilarnej i wybierz opcję Uruchom w oprogramowaniu przyrządu do równoległej elektroforezy kapilarnej.
10. Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania do analizy danych, które wykrywa i identyfikuje każdy pik drabiny wielkości, przypisując każdy pik próbek do ich znanego rzeczywistego rozmiaru.
    1. W przypadku korzystania z zestawu ilościowego należy użyć oprogramowania do określenia ilości DNA w każdym fragmencie poprzez całkowanie obszaru pod pikiem, tak jak w przypadku analizy danych chromatograficznych. Ponownie porównaj próbki ze znanymi ilościami w wzorcach, aby określić ilościowo każdy pik z próbki i obliczyć stosunki między różnymi pikami wykrytymi w próbkach.
    2. Skonstruuj krzywą kalibracyjną (Rysunek 2), łącząc znaną proporcję zmutowanego allelu (mieszanki DNA) z proporcją zmierzoną za pomocą przyrządu do elektroforezy kapilarnej równoległej. Ta krzywa kalibracyjna pozwala na ocenę wiarygodności metody i skorygowanie jej pod kątem niewielkiego odchylenia wzmocnienia.

4. Przygotowanie próbki

1. Próbki punktu czasowego wzrostu przez noc w standardowych warunkach.
2. Wyodrębnij DNA.
3. Określ ilościowo DNA.
4. Amplifikować próbki w zoptymalizowanych warunkach PCR (patrz sekcja 2).
5. Umieścić próbki w równoległym przyrządzie do elektroforezy kapilarnej (patrz kroki 3.5-3.10).

5. Kwantyfikacja alleli

1. Wyodrębnij ilości zmutowanych alleli z danych przyrządu do elektroforezy kapilarnej równoległej za pomocą oprogramowania i oblicz rzeczywiste proporcje, wykreślając te wartości na krzywej kalibracyjnej.

Results

Korzystając z DNA wyekstrahowanego z klonu przodka i klonu hipermutatora wyizolowanego z populacji S2.11 w pokoleniu 1000, ustaliliśmy krzywą kalibracji pokazaną w Rysunek 2. Rzeczywiste proporcje zmutowanych z laboratoryjnie przygotowanych mieszanek DNA i zmierzone za pomocą równoległego instrumentu do elektroforezy kapilarnej były połączone liniową zależnością nachylenia 1,0706, z R² wynoszącym 0,9705. Ponadto istniała dobra zgodność między replikami biologicznymi; Odchylenie standardowe ...

Discussion

W tym miejscu zaproponowaliśmy opłacalną metodę, która pozwala śledzić dynamikę pojawiających się adaptacyjnych alleli SV w eksperymentalnych populacjach ewolucyjnych. Metoda ta łączy klasyczne techniki PCR i zautomatyzowaną równoległą elektroforezę kapilarną, co pozwala na określenie względnych ilości dwóch alleli. Po skonfigurowaniu pozwala na ilościowe określenie proporcji alleli w wielu próbkach równolegle i jest znacznie tańsze niż WGS. Metoda ta może być postrzegana jako odpowiednik sekwencjonowania amplikonów dla ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Płytka do PCR z grubą spódnicą	4titude	4Ti - 0740	PCR
Klasa biologii molekularnej agarozy	Eurogentec	EP-0010-05	Elektroforeza w żelu agarozowym
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Skrócona instrukcja obsługi dla systemów analizatora fragmentów	Agilent		Instrukcja obsługi PDF
Bufor TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Elektroforeza w żelu agarozowym
Kalibrowane jednorazowe pętle i igły do zaszczepiania	LABELIANS	8175CSR40H	Hodowla bakterii
Dneasy Zestaw do krwi i tkanek	Qiagen	69506	Ekstrakcja DNA
Zasilacz do elektroforezy	Amilabo	ST606T	Elektroforeza w żelu agarozowym
Analizator fragmentów Zautomatyzowany system CE	Agilent		Równoległa elektroforeza kapilarna
Drabinka fragmentu DNA	Agilent	DNF-396, zakres 1-6000bp	Równoległa elektroforeza kapilarna
BIOODCZYNNIK DO SOLI SIARCZANU GENTAMYCYNY	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Kultura bakteryjna
Marker rozcieńczalnika o wysokiej czułości	Agilent	DNF-373	Kapilara równoległa elektroforeza
Zestaw do analizy ilościowej NGS o wysokiej czułości	Agilent	DNF-474	Równoległa elektroforeza kapilarna
Drabinka szybkiego obciążenia 1 kb plus drabinka DNA	NEB	N0469S	Elektroforeza w żelu agarozowym
LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	Kultura bakteryjna
Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
Primers Oprogramowanie	Eurogentec		PCR
Prosize v.4	Agilent	V.4	Równoległa elektroforeza kapilarna
Testy kubitowe	Invitrogen	MAN0010876	Kwantyfikacja DNA Zestaw do oznaczania jakości HS
QBIT SDS	TECHNOLOGIES SAS	Q32854	Kwantyfikacja DNA
Termocykler	Eppendorf	Gradienty Ep	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Wizualizacja elektroforezy w żelu agarozowym
Woda do preparatu do wstrzykiwań	Aguettant	PROAMP	PCR