Wprowadzenie
Badania w dziedzinie nefrologii znacznie poprawiły samopoczucie osób dotkniętych chorobą nerek. Jednak choroby nerek są nadal poważnym problemem zdrowotnym, który dotyka ponad 10% populacji i jest odpowiedzialny za zwiększone koszty opieki zdrowotnej i śmiertelność na całym świecie1. Niestety, dokładne mechanizmy prowadzące do chorób nerek nie zostały w pełni wyjaśnione. Ta kolekcja metod JoVE przedstawia najnowsze strategie definiowania patofizjologii nerek. W szczególności grupy badawcze prezentują nowy model zwierzęcy i metody oceny lub leczenia chorób nerek przy użyciu modeli eksperymentalnych lub próbek klinicznych. Prace przedstawione w tym zbiorze są kolejną serią doskonałych wkładów w dziedzinę nefrologii i mogą zapewnić nowe możliwości zapobiegania, diagnozowania lub leczenia chorób nerek w przyszłości.
Translacyjny model zwierzęcy ostrego uszkodzenia nerek
Ostre uszkodzenie nerek (AKI) jest powszechną postacią choroby nerek2. Do badania uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji nerek (I/R) wykorzystano kilka modeli eksperymentalnych 3,4,5. Jednak przełożenie tych wyników na poprawę warunków klinicznych stworzyło wiele wyzwań, ponieważ istnieją znaczne różnice między gatunkami6. Doulamis i wsp. opracowali model I/R nerki świń przy użyciu obustronnego cewnika balonowego, aby rozwiązać ten problem7. Ich model był wysoce powtarzalny, powodował zmniejszenie wydalania moczu i szacowanego współczynnika filtracji kłębuszkowej oraz zwiększenie poziomu kreatyniny w osoczu i azotu mocznikowego we krwi u zwierząt. Ponadto badanie tkankowe i histologiczne wykazało zawał i krwotok w obrębie nerek. Ten nowy model ma znaczenie kliniczne i może pomóc w lepszym zrozumieniu AKI u ludzi.
Strategie badania mechanizmów komórkowych zaangażowanych w chorobę nerek
Cytokiny mogą przyczyniać się do uszkodzenia i naprawy nerek8. Dlatego ważne jest, aby zidentyfikować źródło i rolę cytokin w nerkach. Taguchi i wsp. opracowali technikę zrozumienia wydzielania białek przy użyciu brefeldyny A (BFA), inhibitora wydzielania białka, w AKI i mysich modelach przewlekłej choroby nerek9. Wstrzyknęli BFA do żyły ogonowej myszy, a następnie ocenili ich nerki za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Ustalili, że BFA hamuje wydzielanie białek i powoduje gromadzenie się cytokin w niektórych typach komórek za pomocą markerów specyficznych dla komórki. Ten innowacyjny protokół może być wykorzystany do badania wydzielania białek w kilku patologiach nerek.
Innym proponowanym mechanizmem, który uważa się za przyczyniający się do choroby nerek, są mikroRNA (miRNA)10, o których wiadomo, że degradują i hamują transkrypcję mRNA. Doniesiono, że istnieje korelacja między ekspresją miRNA w tkance a surowicą u ludzi11. Nie ma jednak metody oczyszczania i ilościowego oznaczania zarówno nerek myszy, jak i miRNA w surowicy. Yanai i wsp. zoptymalizowali ilościową metodę łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym w celu oceny ekspresji miRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek12. Ustalili również korelację między obydwoma poziomami miRNA. Protokół ten jest wysokoprzepustowy i może mieć zastosowanie w wielu stanach patologicznych.
Nowe techniki obrazowania do oceny choroby nerek
Nieinwazyjne obrazowanie nerki może ocenić wady strukturalne i funkcjonalne. Istnieją jednak pewne ograniczenia związane z obecnymi metodami. Aby obejść ten problem, Holmes i in. opracowali prostą, opłacalną technikę obrazowania 3D opartą na technologii ultrasonografii robotycznej (US) do ilościowego określania funkcji nerek, wątroby iserca13. Opracowany przez nich protokół zapewnił niezmiennie wysoką jakość obrazów i może być wykorzystany do badań, w których można monitorować tkankę grubą, rozmiary guza lub korzyści płynące z terapii. Największą zaletą tej metody jest wysoka wydajność danych. Na przykład można obrazować trzy szczury jednocześnie lub 20–30 myszy na godzinę. Protokół ten jest szybką alternatywą dla tradycyjnych nieinwazyjnych metod obrazowania.
Inna grupa badawcza w kolekcji wykorzystała obrazowanie do zbadania jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO), modelu uszkodzenia, który indukuje kłębuszki nerkowe. Wagner i in. wykorzystali przyżyteczną mikroskopię dwufotonową do monitorowania UUO u szczurów, u których rozwijają się kłębuszki powierzchniowe i tych, u których nie rozwijają się kłębuszki powierzchniowe14. Mikroskopia dwufotonowa zapewnia zwiększoną głębokość penetracji i badania różnych obszarów nerki. Autorzy odkryli, że UUO wywołało stan zapalny i zwłóknienie, a także zmniejszyło przepływ czerwonych krwinek w nerkach szczurów. Kwantyfikacja przepływu krwi, zwężenia naczyń krwionośnych i rozszerzenia w odpowiedzi na leki i stan zapalny to kilka korzyści, jakie zapewnia ta metoda. Podsumowując, badania te dostarczają nowych strategii obrazowania do badania różnych tkanek.
Oszacowanie nanokrystalurii jako predyktora choroby nerek
Zaproponowano, że ocena kryształów w moczu może być przydatna do przewidywania ryzyka wystąpienia kamieni nerkowych15. Opracowaliśmy protokół ilościowego oznaczania nanokryształów moczu (≤1 μm) od zdrowych osób dorosłych przed i po spożyciu przez nich ładunku szczawianów w diecie, o którym wiadomo, że indukuje poziom szczawianów w moczu16. Wyizolowaliśmy i przeanalizowaliśmy nanokryształy moczu zawierające wapń za pomocą fluoroforu wapnia i analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Ustaliliśmy, że NTA może specyficznie wykrywać nanokryształy zawierające wapń w moczu, a wyniki były zgodne z naszymi wcześniejszymi ustaleniami17. Protokół ten może być wykorzystany do badania nanokryształów moczu w postaciach kamiennych lub w różnych dziedzinach badań, w których występują krystalopaty.
Podejścia terapeutyczne w leczeniu chorób nerek
Sztucznie zsyntetyzowane mimiki miRNA zostały zasugerowane jako możliwe leczenie chorób nerek. Jednak RNAaza w surowicy może degradować egzogenne miRNAnaśladujące 18. Yanai i in. wyprodukowali wektory niewirusowe oparte na liniowym polimerze, nanocząstkach polietyleniminy (PEI-NPs), aby bezpiecznie dostarczyć mimimikę miRNA do nerek myszy18. Udowodnili, że mimik był skuteczny w nadekspresji docelowego miRNA. Do ograniczeń tej metody należy znaczna ilość PEI-NP wymaganych dla większych modeli zwierzęcych oraz brak swoistości dla nerek. Jednak w oparciu o sukces szczepionek RNA, mimimiki mogą być idealną opcją terapeutyczną w przypadku chorób nerek.
Uwagi końcowe
Przedstawione tutaj kompleksowe badania wprowadzają nowy model zwierzęcy i techniki do badania powszechnych problemów związanych z nefrologią. Należy zauważyć, że niektóre z tych metod mogą mieć zastosowanie w innych obszarach poza nefrologią. Kolejnym logicznym krokiem będzie zbadanie, w jaki sposób te metody mogą być testowane na większych modelach zwierzęcych i badaniach klinicznych. Mamy nadzieję, że udostępnienie tych protokołów poszerzy naszą wiedzę na temat patofizjologii nerek i narodzin nowych pomysłów na łagodzenie chorób nerek u osób.