Artykuł metodologiczny

Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych in vitro

DOI:

10.3791/64712

⸱

21 kwietnia 2023

 ,  , 
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzamy cztery metody oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząsteczek i powierzchni nanostrukturalnych za pomocą technik in vitro. Metody te można zaadaptować do badania interakcji różnych nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych z szeroką gamą gatunków drobnoustrojów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antybakteryjne działania nanocząsteczek i powierzchni nanostrukturalnych, takich jak srebro, tlenek, dwutlenek tytanu i tlenek magnezu, były wcześniej badane w warunkach klinicznych i środowiskowych oraz w produktach spożywczych do spożycia. Jednak brak spójności w stosowanych metodach eksperymentalnych i materiałach doprowadził do sprzecznych wyników, nawet w przypadku badań nad tymi samymi typami nanostruktur i gatunkami bakterii. W przypadku badaczy, którzy chcą zastosować nanostruktury jako dodatek lub powłokę w projekcie produktu, te sprzeczne dane ograniczają ich wykorzystanie w warunkach klinicznych.

Aby stawić czoła temu dylematowi, w tym artykule przedstawiamy cztery różne metody określania aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząsteczek i powierzchni nanostrukturalnych oraz omawiamy ich zastosowanie w różnych scenariuszach. Oczekuje się, że dostosowanie spójnych metod doprowadzi do uzyskania powtarzalnych danych, które będzie można porównywać w różnych badaniach i wdrażać dla różnych typów nanostruktur i gatunków drobnoustrojów. Wprowadzamy dwie metody określania aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek oraz dwie metody aktywności przeciwdrobnoustrojowej powierzchni nanostrukturalnych.

Dla nanocząstek, metoda bezpośredniej kohodowli może być użyta do określenia minimalnych hamujących i minimalnych bakteriobójczych stężeń nanocząstek, a metoda hodowli bezpośredniej ekspozycji może być użyta do oceny aktywności bakteriostatycznej w czasie rzeczywistym w porównaniu z bakteriobójczą wynikającą z ekspozycji na nanocząstki. W przypadku powierzchni nanostrukturalnych metodę hodowli bezpośredniej stosuje się w celu określenia żywotności bakterii mających pośredni i bezpośredni kontakt z powierzchniami nanostrukturalnymi, a metodę ekspozycji kontaktowej w ognisku stosuje się do zbadania aktywności przeciwdrobnoustrojowej na określonym obszarze powierzchni nanostrukturalnej. Omówiono kluczowe zmienne eksperymentalne, które należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu badań in vitro przy określaniu właściwości przeciwdrobnoustrojowych nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych. Wszystkie te metody są stosunkowo tanie, wykorzystują techniki, które są stosunkowo łatwe do opanowania i powtarzalne w celu zapewnienia spójności, a także mają zastosowanie do szerokiego zakresu typów nanostruktur i gatunków drobnoustrojów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W samych Stanach Zjednoczonych 1,7 miliona osób rocznie zapada na zakażenie szpitalne (HAI), przy czym jedna na 17 z tych infekcji kończy się śmiercią1. Ponadto szacuje się, że koszty leczenia zakażeń szpitalnych wynoszą od 28 miliardów do 45 miliardów dolarów rocznie1,2. Te zakażenia związane z opieką szpitalną są zdominowane przez oporne na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 i Pseudomonas aeruginosa4, które są zwykle izolowane z przewlekłych zakażeń ran i zwykle wymagają intensywnego leczenia i czasu, aby uzyskać korzystny wynik leczenia.

W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat opracowano wiele klas antybiotyków do leczenia infekcji związanych z tymi i innymi bakteriami chorobotwórczymi. Na przykład analogi ryfamycyny były stosowane w leczeniu MRSA, innych zakażeń Gram-dodatnich i Gram-ujemnych oraz zakażeń Mycobacterium spp. 5. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku, aby skutecznie leczyć coraz większą liczbę zakażeń M. tuberculosis, połączono dodatkowe leki z analogami ryfamycyny, aby zwiększyć ich skuteczność. Jednak około 5% przypadków M. tuberculosis pozostaje opornych naryfampicynę5,6, a obawy dotyczące bakterii wielolekoopornych rosną 7. Obecnie stosowanie samych antybiotyków może nie być wystarczające w leczeniu zakażeń szpitalnych, co sprowokowało ciągłe poszukiwania alternatywnych terapii przeciwdrobnoustrojowych1.

Metale ciężkie, takie jak srebro (Ag)8,9,10 i złoto (Au)11, oraz ceramika, taka jak dwutlenek tytanu (TiO2)12 i tlenek (ZnO)13, w postaci nanocząstek (NP) (AgNP, AuNP, TiO2NP i ZnONP) zostały przebadane pod kątem ich aktywności przeciwdrobnoustrojowej i zostały zidentyfikowane jako potencjalne alternatywy dla antybiotyków. Ponadto materiały bioresorbowalne, takie jak stopy magnezu (stopy Mg)14,15,16, nanocząstki tlenku magnezu17,18,19,20,21, oraz nanocząstki wodorotlenku magnezu [odpowiednio nMgO i nMg(OH)2]22,23,24, również zostały sprawdzone. Jednak w poprzednich badaniach przeciwdrobnoustrojowych nanocząstek stosowano niespójne materiały i metody badawcze, co skutkowało danymi, które są trudne lub niemożliwe do porównania, a czasami mają charakter sprzeczny18,19. Na przykład minimalne stężenie hamujące (MIC) i minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC) nanocząstek srebra różniły się znacznie w różnych badaniach. Ipe i wsp.25 ocenili aktywność przeciwbakteryjną AgNP o średniej wielkości cząstek ~26 nm, aby określić wartości MIC przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym. Zidentyfikowane wartości MIC dla P. aeruginosa, E. coli, S. aureus i MRSA wynosiły odpowiednio 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml i 10 μg/ml. Z kolei Parvekar i in.26 ocenili AgNP o średniej wielkości cząstek 5 nm. W tym przypadku stwierdzono, że MIC AgNP i MBC 0,625 mg/ml są skuteczne przeciwko S. aureus. Ponadto Loo i wsp.27 ocenili AgNP o wielkości 4,06 nm. Gdy E. coli była wystawiona na działanie tych nanocząstek, MIC i MBC wynosiły 7,8 μg/ml. Na koniec Ali i wsp.28 zbadali właściwości przeciwbakteryjne sferycznych AgNP o średniej wielkości 18 nm. Gdy P. aeruginosa, E. coli i MRSA zostały wystawione na działanie tych nanocząstek, MIC został zidentyfikowany odpowiednio na poziomie 27 μg/ml, 36 μg/ml, 27 μg/ml i 36 μg/ml, a MBC zidentyfikowano odpowiednio na poziomie 36 μg/mL, 42 μg/ml i 30 μg/ml.

Chociaż aktywność przeciwbakteryjna nanocząsteczek była intensywnie badana i opisywana w ostatnich dziesięcioleciach, nie ma standardu dla stosowanych materiałów i metod badawczych, które pozwoliłyby na bezpośrednie porównania między badaniami. Z tego powodu przedstawiamy dwie metody, metodę bezpośredniej kohodowli (metoda A) i metodę bezpośredniej ekspozycji (metoda B), w celu scharakteryzowania i porównania aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek przy zachowaniu spójności materiałów i metod.

Oprócz nanocząstek, powierzchnie nanostrukturalne zostały również zbadane pod kątem działania przeciwbakteryjnego. Należą do nich materiały na bazie węgla, takie jak nanoarkusze grafenu, nanorurki węglowe i graphite29, a także czyste stopy Mg i Mg. Każdy z tych materiałów wykazywał co najmniej jeden mechanizm przeciwbakteryjny, w tym fizyczne uszkodzenia błon komórkowych przez materiały na bazie węgla oraz uszkodzenia procesów metabolicznych lub DNA poprzez uwalnianie reaktywnych form tlenu (ROS) podczas degradacji Mg. Ponadto, gdy (Zn) i wapń (Ca) są łączone w tworzeniu stopów Mg, zagęszczenie wielkości ziaren matrycy Mg jest zwiększone, co prowadzi do zmniejszenia adhezji bakteryjnej do powierzchni podłoża w porównaniu z próbkami zawierającymi tylko Mg14. Aby wykazać aktywność przeciwbakteryjną, przedstawiamy metodę hodowli bezpośredniej (metoda C), która określa adhezję bakterii do i wokół materiałów nanostrukturalnych w czasie poprzez ilościowe określenie jednostek tworzących kolonie bakteryjne (CFU) przy bezpośrednim i pośrednim kontakcie powierzchniowym.

Geometria nanostruktur na powierzchniach, w tym rozmiar, kształt i orientacja, może wpływać na bakteriobójcze działanie materiałów. Na przykład Lin et al.16 wytworzyli różne nanostrukturalne warstwy MgO na powierzchniach substratów Mg poprzez anodowanie i osadzanie elektroforetyczne (EPD). Po okresie ekspozycji na powierzchnię nanostrukturalną in vitro, wzrost S. aureus został znacznie zmniejszony w porównaniu z Mg niepoddanym działaniu substancji chemicznej. Wskazywało to na większą siłę działania powierzchni nanostrukturalnej przeciwko adhezji bakteryjnej w porównaniu z niepoddawaną działaniu metalicznej powierzchni Mg. Aby ujawnić różne mechanizmy właściwości przeciwbakteryjnych różnych powierzchni nanostrukturalnych, w artykule omówiono metodę ekspozycji kontaktowej (metoda D), która określa interakcje komórka-powierzchnia w obszarze zainteresowania.

Celem tego artykułu jest przedstawienie czterech metod in vitro, które mają zastosowanie do różnych nanocząstek, powierzchni nanostrukturalnych i gatunków drobnoustrojów. Omówiono kluczowe kwestie dotyczące każdej metody w celu uzyskania spójnych, odtwarzalnych danych w celu porównania. W szczególności do badania właściwości przeciwdrobnoustrojowych nanocząstek stosuje się metodę bezpośredniej hodowli 17 oraz metodę bezpośredniej ekspozycji. Dzięki metodzie bezpośredniej kohodowli można określić minimalne stężenia hamujące i minimalne bakteriobójcze (odpowiednio MIC i MBC 90-99,99) dla poszczególnych gatunków, a najsilniejsze stężenie (MPC) można określić dla wielu gatunków. Dzięki metodzie bezpośredniej ekspozycji, bakteriostatyczne lub bakteriobójcze działanie nanocząstek przy minimalnych stężeniach hamujących można scharakteryzować za pomocą odczytów gęstości optycznej w czasie rzeczywistym. Metoda direct culture14 jest odpowiednia do badania bakterii mających bezpośredni i pośredni kontakt z powierzchniami nanostrukturalnymi. Na koniec przedstawiono metodę focused-contact exposure16 w celu zbadania aktywności przeciwbakteryjnej określonego obszaru na powierzchni nanostrukturalnej poprzez bezpośrednie zastosowanie bakterii i scharakteryzowanie wzrostu bakterii na granicy komórka-nanostruktura. Metoda ta została zmodyfikowana w stosunku do japońskiego standardu przemysłowego JIS Z 2801:200016 i ma na celu skupienie się na interakcjach między drobnoustrojami a powierzchnią i wykluczenie wpływu degradacji próbki masowej w kulturze drobnoustrojów na aktywność przeciwdrobnoustrojową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przedstawić metody bezpośredniej kokultury i bezpośredniej ekspozycji, używamy nanocząsteczek tlenku magnezu (nMgO) jako materiału modelowego do zademonstrowania interakcji bakteryjnych. Aby przedstawić metody hodowli bezpośredniej i ekspozycji w kontakcie skoncentrowanym, jako przykłady używamy stopu Mg z powierzchniami nanostrukturalnymi.

1. Sterylizacja nanomateriałów

UWAGA: Wszystkie nanomateriały muszą zostać wysterylizowane lub zdezynfekowane przed hodowlą mikroorganizmów. Metody, które mogą być stosowane, obejmują ciepło, ciśnienie, promieniowanie i środki dezynfekujące, ale tolerancja materiałów dla każdej metody musi zostać określona przed eksperymentami in vitro.

  1. Nanocząstki
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w rozpuszczalniku organicznym, takim jak etanol, lub pakowane do naczynia lub pudełka, a następnie sterylizowane lub dezynfekowane w odpowiedni sposób. Nanocząstki wysterylizowano przy użyciu następującej metody w celu zademonstrowania metody bezpośredniej wspólnej hodowli17 i metody bezpośredniej ekspozycji.
    1. Sterylizuj nanocząstki MgO w piecu konwekcyjnym o temperaturze 200 °C30 przez 60 minut przed każdym eksperymentem in vitro.
      UWAGA: Ta metoda została wybrana, ponieważ para wodna i światło UV mogą wpływać na strukturę nanocząstek MgO (nMgO)17.
  2. Materiały sypkie
    UWAGA: Materiały nanostrukturalne wysterylizowano następującą metodą w celu wykazania metody hodowli bezpośredniej.
    1. W przypadku metody hodowli bezpośredniej14, dezynfekuj przygotowane próbki ZC21, Mg i T64 za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV) przez 4 godziny przed rozpoczęciem badań in vitro.
    2. W przypadku metody skoncentrowanej ekspozycji kontaktowej16, dezynfekować wszystkie próbki za pomocą promieniowania UV przez 2 godziny przed rozpoczęciem badań in vitro.
  3. Alternatywnie można użyć tlenku etylenu (EtO) do sterylizacji materiałów wrażliwych na ciepło.

2. Metoda bezpośredniej kokultury (metoda A)

UWAGA: W metodzie A, bakterie w kulturze siewu w fazie opóźnionej są bezpośrednio mieszane z nanocząstkami o określonych stężeniach. W celu zbadania aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek postępujemy zgodnie z protokołem opisanym przez Nguyen et al.17.

  1. Charakterystyka nanocząstek i nanostruktur
    UWAGA: Skład i kształt nanostruktury potwierdza się za pomocą dyfrakcji proszków rentgenowskich.
    1. Pomiar nanocząstek
      1. Zważyć nanocząstki z prędkością 9 razy większą niż pożądana masa na ml, aby pomieścić 3 ml próbek w trzech powtórzeniach. Na przykład waż 0,2 mg/ml nMgO przy 1,8 mg/ml.
        UWAGA: Zapewnia to równomierne rozprowadzenie nanocząstek w kulturach bakteryjnych i bulionach.
      2. Zmierz wszystkie nanocząstki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 5,0 ml, która została wstępnie zważona i wytarowana za pomocą wagi analitycznej.
  2. Przygotowanie i hodowla kultur bakterii
    1. Do każdego doświadczenia in vitro należy pobrać zapasy komórek bakteryjnych z magazynu w temperaturze -80 °C. Dodać 10 μl każdego zapasu komórek bakteryjnych do 5 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej.
    2. Umieścić zaszczepioną pożywkę w inkubatorze-wytrząsarce w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min na około 16 godzin przez noc.
      1. W przypadku hodowli gatunków Staphylococcus należy przeprowadzić subkulturę, umieszczając 400 μl każdej kultury na noc w 20 ml świeżej pożywki (100 μl/5 ml pożywki) i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 250 obr./min przez dodatkowe 4-6 godzin.
  3. Mycie i liczenie komórek bakterii w celu określenia gęstości wysiewu
    UWAGA: Pożądana gęstość wysiewu wynosząca 7,8 ×10 6 CFU/ml została zidentyfikowana jako liczba komórek większa niż wymagana do potwierdzenia infekcji dróg moczowych.
    1. Zebrać wyhodowane bakterie, dzieląc 1 ml nocnej kultury bakterii do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Stworzyć wystarczającą liczbę podwielokrotności z nocnych kultur bakteryjnych i odwirować je przez 10 minut w temperaturze 1,956 × g, aby osiągnąć pożądaną gęstość wysiewu.
    2. Po odwirowaniu odpipetować w celu usunięcia supernatantu z granulowanych komórek i umieścić supernatant w pojemniku zbiorczym. Zawiesić granulki komórkowe w 0,5 ml świeżej pożywki wzrostowej. Połączyć dwie zawiesiny o stężeniu 0,5 ml, aby utworzyć 1 ml zawiesiny, aby zmniejszyć liczbę 1 ml porcji zawieszonych komórek do sześciu. Powtarzać wirowanie przez 10 minut przy stężeniu 1,956 × g.
    3. Zakończyć drugi cykl płukania przy użyciu świeżej pożywki wzrostowej, jak w kroku 2.3.2, w celu zmniejszenia liczby 1 ml podwielokrotności ponownie zawieszonych umytych komórek do trzech.
    4. Zakończyć trzeci cykl, jak w kroku 2.3.2, z wyjątkiem ponownego zawieszenia osadów komórek w 0,33 ml buforu Tris (hydroksymetylo) aminometanowego (bufor Tris, pH 8,5). Połączyć trzy zawiesiny, każda o objętości 0,33 ml, w jedną mikrowirówkę o pojemności 1,5 ml. Powtarzać wirowanie przez 10 minut przy 1,956 × g.
      UWAGA: Bufor Tris nie zawiera jonów Mg2+ ani Ca2+ 31. Jest to ważne dla zastosowania optycznej spektrometrii emisyjnej ze wzbudzoną plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP-OES) do pomiaru jonów Mg2+ i Ca2+ w bulionach po hodowli. Natomiast fosforany obecne w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)32, na przykład, sekwestrują zarówno jony Mg2+, jak i Ca2+33,34,35 i powodują zamieszanie w interpretacji danych ICP-OES.
    5. Usunąć supernatant z granulowanych komórek. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml świeżego buforu Tris, znanego jako zawiesina komórkowa - kultura bakterii w fazie opóźnionej.
    6. Określ stężenie zawiesiny komórkowej (komórki/ml) za pomocą hemocytometru.
  4. Stworzenie kultury bakterii siewnych
    UWAGA: Próbka ma całkowitą objętość 3 ml i jest wypełniana w trzech egzemplarzach (łącznie 9 ml).
    1. Określ całkowitą objętość potrzebnej kultury wysiewu bakterii. Aby utworzyć kulturę wysiewu, użyj C1V1 = C2V2, aby obliczyć objętość zawiesiny komórkowej potrzebną do stworzenia kultury wysiewu 7,8 × 106 komórek/ml. Dodać obliczoną objętość zawiesiny komórek (V1) do wymaganej objętości pożywki wzrostowej (V2).
    2. Określ rzeczywistą gęstość wysiewu bakterii w jtk/ml. Utworzyć dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie do 10-4. Rozprowadzić rozcieńczenie 10-4 na odpowiednim agarze wzrostowym i inkubować przez noc. Po inkubacji policz liczbę kolonii i oblicz CFU/ml.
  5. Powstawanie bakterii i kultur nanocząstek
    1. W 12-dołkowych, niepoddanych działaniu tkanek płytkach polistyrenowych należy umieścić 2 ml kultury bakterii w każdym dołku na potrzebną liczbę studzienek.
    2. Na każde 5 ml probówki do mikrowirówki zawierającej wstępnie zważone nMgO dodać 3 ml kultury bakterii. Krótko wirować, aby wymieszać nMgO z bakteriami. Podwielokrotność 1 ml mieszaniny rozmieścić w trzech oddzielnych studzienkach w celu utworzenia potrójnych próbek każdej z uprzednio zmierzonej masy nMgO. Odpipetować mieszaninę bakterii/nMgO 2-3 razy przed przygotowaniem każdej 1 ml podwielokrotności, aby utrzymać nMgO w zawiesinie.
      UWAGA: Próbki kontrolne będą składać się z 3 ml samych komórek, 3 ml samych pożywek i 3 ml zawierających najniższe i najwyższe stężenia użytych nanocząstek. Są one przygotowywane jak w kroku 2.5.2. Wszystkie próbki kontrolne wypełnia się w trzech egzemplarzach.
    3. Inkubować wszystkie 12-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 120 obr./min przez 24 godziny.
  6. Określanie wzrostu komórek bakteryjnych po ekspozycji na nMgO
    1. Po całonocnej inkubacji kultur bakteryjnych zebrać każdą próbkę o pojemności 3 ml, pipetując ją do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Użyj płytki 96-dołkowej, aby utworzyć seryjne rozcieńczenia 1:10. Określić liczbę kolumn niezbędnych do seryjnego rozcieńczenia wszystkich próbek zawierających bakterie. Dodać 180 μl buforu Tris do każdej studzienki w rzędzie B do rzędu G dla odpowiedniej liczby kolumn.
      3. Krótko przemieszać
    3. każdą stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą próbki bakterii i dodać 50 μl do pojedynczej studzienki w rzędzie A.
    4. Dla każdej studzienki w rzędzie A przenieść 20 μl do rzędu B (np. A1 do B1) i krótko wymieszać pipetując, aby uzyskać objętość 200 μl. Używając sterylnej końcówki pipety, przenieść 20 μl z dołka w rzędzie B do dołka w rzędzie C. Kontynuować ten wzór, aż studzienka w rzędzie G będzie zawierała 200 μl, kończąc szeregowe rozcieńczanie od 10−1 w rzędzie B do 10−6 w rzędzie G.
    5. Odpipetować 100 μl każdej studzienki na odpowiednią płytkę z agarem do wzrostu i rozprowadzić na płytce w celu rozproszenia kultury komórkowej. Umieścić płytki w inkubatorze-wytrząsarce na noc w temperaturze 37 °C. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    6. Zbadaj płytki i policz te, które mają około 25-300 kolonii. Jeśli to możliwe, wybierz płytki o tej samej wartości rozcieńczenia. Użyj liczby kolonii na płytce, aby obliczyć jtk/ml.
  7. Ocena pH po inkubacji
    UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dla każdego modelu pH-metru.
    1. Wstępnie skalibruj pH-metr przy użyciu roztworów standaryzujących o pH 4, pH 7 i pH 10. Odczytaj każdą próbkę bakteryjną, umieszczając sondę pH w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  8. Przygotowanie próbek do ICP-OES
    UWAGA: ICP-OES służy do oznaczania stężenia jonówMg2+ iCa2+. Te kationy są uważane za ważne, ponieważ każdy z nich uczestniczy w metabolizmie komórkowym.
    1. Odwirować każdą stożkową probówkę o pojemności 15 ml przygotowaną w kroku 2.6.1 przez 5 minut w temperaturze 5,724 × g w celu osadzenia szczątków komórkowych i nanocząstek.
    2. Używając stożkowej probówki o pojemności 15 ml, rozcieńczyć 30 μl supernatantu w 2,97 ml 18,2 Ω przefiltrowanej wody, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100.
      UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia można regulować w oparciu o przewidywane stężenia jonów i granicę wykrywalności przyrządu spektrometru.
    3. Odczyt próbek przy użyciu ICP-OES.

3. Metoda bezpośredniej ekspozycji (metoda B)

UWAGA: Jeśli tempo wzrostu wybranych bakterii jest nieznane, to przed zastosowaniem tej metody musi zostać zakończona standaryzacja krzywej wzrostu.

  1. Określ aktywność bakteriostatyczną i bakteriobójczą w czasie rzeczywistym po ekspozycji na interesujące nanocząstki.
    1. Przygotować pożądane stężenia nanocząstek, stosując metody opisane w kroku 2.1-2.1.2.2. Przygotować dwa zestawy nanocząstek o każdej masie do użycia: jeden do dodania do 3 ml porcji kultury bakterii w logarytmicznej fazie wzrostu, a drugi do dodania do 3 ml podwielokrotności pożywki wzrostowej bez bakterii jako grup kontrolnych.
    2. Określ odpowiednie antybiotyki bakteriostatyczne i bakteriobójcze dla badanych gatunków bakterii.
      UWAGA: Wymagana jest wiedza na temat minimalnego stężenia hamującego dla każdego antybiotyku.
  2. Obliczyć całkowitą objętość kultury bakteryjnej potrzebnej do trzykrotnego pobrania próbek o objętości 3 ml dla wszystkich nanocząstek, antybiotyków i próbek kontrolnych.
    UWAGA: Wymagana jest równa objętość sterylnego podłoża wzrostowego. Jeżeli planowane jest zastosowanie spektrofotometrii, wymaga to dostosowania całkowitej objętości potrzebnej do pomieszczenia objętości od 0,5 ml do 1,0 ml potrzebnej dla kuwet.
  3. Dzień 1: Dla każdego eksperymentu in vitro utwórz zapasy na noc zgodnie z krokami 2.2.1-2.2.2.
  4. Dzień 2: Upewnij się, że ustawienia czytnika płytek mogą pomieścić 96-dołkową płytkę o gęstości optycznej 600 nm. Zmierzyć próbki w podwielokrotnościach o objętości 200 μl za pomocą płytki 96-dołkowej.
    1. Oznaczyć początkową hodowlę bakteryjną OD600 przy gęstości 0,01 - gęstości użytej do rozpoczęcia początkowego okresu inkubacji przed dodaniem nanocząstek i antybiotyków.
    2. Zebrać nocną kulturę bakterii z inkubatora-wytrząsarki.
      1. Dla każdego badanego materiału (np. wstępnie zmierzonych nanocząstek lub antybiotyków) należy utworzyć oddzielną kulturę bakteryjną o OD600 0,01. Użyć pojemnika wystarczająco dużego, aby pomieścić potrzebną objętość hodowli komórkowej (np. wysterylizowaną kolbę Erlenmeyera lub stożkowe probówki o pojemności 50 ml).
      2. Rozcieńczyć nocne próbki bakteryjne pożywką wzrostową, umieszczając trzy 200 μl podwielokrotności pożywki wzrostowej w trzech studzienkach i trzy podwielokrotności 200 μl kultury bakteryjnej w dodatkowych studzienkach (np. A1 do A6).
      3. Umieść 96-dołkową płytkę w czytniku płytek i zeskanuj ją.
        UWAGA: Odczyty są uśredniane dla każdej zeskanowanej studni w celu uzyskania wartości średniej.
      4. Aby obliczyć gęstość bakterii w zawiesinie, należy uśrednić średnią wartość dla każdej studzienki zawierającej potrójną próbkę.
      5. Aby określić gęstość optyczną bakterii, odejmij średnią próbki bulionu od średniej bakteryjnej.
      6. Jeśli konieczne jest dalsze dostosowywanie zawiesiny bakteryjnej, należy kontynuować dodawanie bulionu lub nocnej kultury bakteryjnej w zależności od potrzeb i w razie potrzeby powtarzać skanowanie w czytniku płytek, aż do osiągnięcia OD600 około 0,01.
      7. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min, aż do osiągnięcia wzrostu logarytmicznego.
  5. Usunąć kultury bakterii z wytrząsarki inkubatora.
    1. Podatkować 3 ml kultury bakteryjnej OD600 0,01 do znakowanych stożkowych probówek o pojemności 15 ml do próbek testowych i kontrolnych w trzech powtórzeniach.
    2. Podzielić 200 μl kultury bakteryjnej na trzy dołki 96-dołkowej płytki i zmierzyć próbki za pomocą czytnika płytek.
    3. Oblicz odczyty zgodnie z opisem w kroku 3.4.2.2 i kroku 3.4.2.6 - "Odczyt -0.5 godziny".
  6. Tworzenie i pomiar mieszanin bakterii/nanocząstek
    1. Podwielokrotność 3 ml sterylnej pożywki wzrostowej w liczbie równej kulturom bakteryjnym do znakowanych stożkowych probówek o pojemności 15 ml do próbek kontrolnych (w trzech powtórzeniach).
    2. Aby przygotować zawiesiny bakterii/nanocząstek i sterylne zawiesiny pożywki/nanocząstek, należy usunąć 1 ml kultury bakteryjnej lub pożywki z każdego potrójnego zestawu 15 ml stożkowych probówek.
      1. Umieścić 1 ml porcji w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml zawierającej wstępnie odmierzone nanocząstki i krótko odmieszać.
      2. Z probówki wirówkowej o pojemności 5 ml wsypać 1 ml porcji zawiesin bakterii/nanocząstek lub pożywki/nanocząstek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu jednorodnego rozprowadzenia nanocząstek.
        UWAGA: Odpipetować mieszaninę bakterii/nanocząstek 2x-3x przed pipetowaniem każdej 1 ml porcji, aby utrzymać nanocząstki w zawiesinie.
  7. Tworzenie i pomiar mieszanin bakterii/antybiotyków
    1. Aby utworzyć kultury bakterii/antybiotyków, należy podać 3 ml inkubowanej kultury bakteryjnej do odpowiednio oznakowanych stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    2. Po przygotowaniu wszystkich próbek, podwielokrotność 200 μl każdej próbki do poszczególnych studzienek na 96-dołkowej płytce.
    3. Umieść płytkę (płytki) w czytniku płytek i rozpocznij skanowanie - odczyt "0 h".
    4. Umieścić stożkowe probówki o pojemności 15 ml zawierające próbki w inkubatorze-wytrząsarce w temperaturze 37 °C i prędkości 150 obr./min. Zapisz wszystkie dane zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 3.4.2.2 i 3.4.2.6.
  8. Po około 15 minutach od zakończenia odczytu 0 godzin powtórz kroki opisane w krokach 3.7.2-3.7.3 - odczyt "0.5 godziny".
    1. Po ustalonym upływie 0 godzin powtarzać kroki opisane w kroku 3.7.2-kroku 3.7.3 co 90 minut przez sześć cykli; zakończyć w ciągu 9 godzin.
    2. Po zakończeniu szóstego cyklu umieścić próbki w inkubatorze-wytrząsarce na dodatkowe 15 godzin w temperaturze 37 °C i przy prędkości 150 obr./min. Powtórz kroki opisane w krokach 3.7.2-3.7.3, aby uzyskać odczyt z 24 godzin. Zapisz wszystkie dane zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 3.4.2.2 i 3.4.2.6.

4. Metoda hodowli bezpośredniej (metoda C)

UWAGA: W metodzie C, bakterie w kulturze wysiewu w fazie opóźnionej są umieszczane bezpośrednio na interesujących nas powierzchniach nanostrukturalnych. W celu zbadania aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanostruktury postępujemy zgodnie z protokołem opisanym przez Zhang et al.14. Aby zademonstrować tę metodę hodowli bezpośredniej, jako próbki użyto ZC21 (stop Mg-Zn-Ca) i szpilek Mg.

  1. Przygotowanie i hodowla kultur bakterii
    1. Dla każdego eksperymentu in vitro należy utworzyć zapasy overnight zgodnie z krokami 2.2.1-2.2.2.
  2. Mycie i liczenie bakterii w celu określenia gęstości wysiewu
    UWAGA: Pożądana gęstość wysiewu wynosząca 7,5 × 105 CFU/ml została zidentyfikowana jako zgłoszone stężenie komórek, które powoduje infekcje ortopedyczne14.
    1. Pobrać wyhodowaną przez noc kulturę bakteryjną z inkubatora-wytrząsarki.
    2. Umyj i zbierz bakterie, postępując zgodnie z krokami 2.3.2-2.3.2.3, ale zastąp świeżą pożywkę zmienionym symulowanym płynem ustrojowym (rSBF) dla każdego etapu mycia.
      UWAGA: rSBF jest roztworem buforowym, który naśladuje stężenie jonów w ludzkim osoczu krwi. Jednak rSBF zawiera tylko związki nieorganiczne i nie zawiera żadnych związków bioorganicznych, takich jak białka. Aby rozwiązać ten problem, płodową surowicę bydlęcą (FBS) łączy się z rSBF, aby symulować skład ludzkiej krwi, aby lepiej naśladować naturalne tworzenie się apatytu w zwapniałych tkankach w warunkach eksperymentalnych36.
    3. Usunąć supernatant z granulowanych komórek. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml rSBF uzupełnionym 10% FBS - zawiesiną komórkową.
    4. Określ stężenie zawiesiny komórkowej (komórki/ml) za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do stężenia 7,5 × 105 komórek/ml w rSBF uzupełnionym 10% FBS. Utwórz kulturę wysiewu, wykonując krok 2.4.1.
    5. Określić rzeczywistą gęstość wysiewu zgodnie z krokiem 2.4.2.
  3. Rozprowadzić zawiesinę komórek bakteryjnych na próbkach w dołkach hodowlanych.
    1. Umieścić zarówno próbki, jak i próbki kontrolne w indywidualnych dołkach 48-dołkowej płytki polistyrenowej niepoddanej obróbce tkankowej.
    2. Podwielokrotność 0,75 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki zawierającej próbki i kontrole. Umieścić 48-dołkową płytkę (płytki) w inkubatorze-wytrząsarce na 24 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 120 obr./min.
  4. Charakterystyka stężenia bakterii
    1. Po 24 godzinach inkubacji pobrać próbki i umieścić je w oddzielnych, oznakowanych probówkach zbiorczych.
    2. Zbierz dwie próbki z każdej grupy i umieść je pojedynczo w oznakowanych probówkach do mikrowirówek o pojemności 5,0 ml. Dodać 2 ml rSBF do każdej probówki.
    3. Umieścić próbki pobrane w kroku 4.4.2 w kąpieli dźwiękowej i poddać sonikacji przez 10 minut. Po każdym 5-minutowym okresie wirować każdą próbkę przez 5 sekund.
    4. Zebrać rSBF zawierający nowo odłączone komórki bakteryjne i umieścić zawiesinę w oznakowanej, świeżej probówce do mikrowirówki.
  5. Seryjne rozcieńczania i powlekanie bakterii
    1. Zawiesinę bakteryjną należy rozcieńczyć seryjnie i płytkowo wykonać krok 2.6.2-2.6.6.
  6. Oceń pH pożywek hodowlanych po inkubacji, wykonując krok 2.7.
  7. Przygotować pożywkę po hodowli dla ICP-OES, postępując zgodnie z metodami opisanymi w kroku 2.8.

5. Metoda kontaktu z ogniskiem (metoda D)

UWAGA: W metodzie D, bakterie na bibule filtracyjnej nitrocelulozy są umieszczane w bezpośrednim kontakcie z obszarem zainteresowania na powierzchniach nanostrukturalnych. Metoda ta minimalizuje interferencję degradacji próbki masowej w kulturach bakteryjnych z aktywnością bakteryjną. Aby zbadać aktywność przeciwdrobnoustrojową nanopowierzchni, postępujemy zgodnie z protokołem opisanym przez Lin et al.16.

  1. Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 2.2.1-2.2.2.1, aby utworzyć bakteryjną kulturę siewu. Potwierdź rzeczywistą gęstość wysiewu zgodnie z krokiem 2.4.2.
  2. Przygotować próbki o wielkości 1 × 1cm2 w kształcie kwadratu. Przygotować wszystkie rodzaje próbek w trzech egzemplarzach. W razie potrzeby umieścić próbki na trójwymiarowym (3D) uchwycie o średnicy 15 mm i wysokości 10 mm. Umieścić próbkę i uchwyt w studzience z płytką studzienkową z polistyrenu niepoddanego kulturze tkankowej.
  3. Przygotuj wysterylizowane bibułki nitrocelulozowe, przycinając je do średnicy 1 cm. Przygotowane bibułki nitrocelulozowe umieszczać na płytce agarowej zawierającej odpowiednią pożywkę.
  4. Odpipetować 50 μl rozcieńczonej kultury bakteryjnej na bibułę filtracyjną.
  5. Odmierzyć pipetą 50 μl odpowiedniego podłoża na środek każdej powierzchni próbki.
  6. Za pomocą wysterylizowanej pęsety podnieś papier nitrocelulozowy z powierzchni agaru. Ostrożnie odwróć papier nitrocelulozowy i umieść go na powierzchni próbki tak, aby bakterie miały kontakt z 50 μl pożywki i badaną powierzchnią nanostrukturalną.
  7. Dodaj 1 ml buforu Tris do każdej studzienki zawierającej próbkę, aby utrzymać wilgotność. Inkubować płytkę studzienki polistyrenowej zawierającą wszystkie próbki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  8. Zbierz bibułę nitrocelulozową z każdej powierzchni próbki. Umieść każdy z nich w 5 ml buforu Tris. Wirować zebrane bibuły filtracyjne i nanopowierzchniowe próbki materiałów przez 5 sekund.
  9. Sonikować każdą próbkę przez 10 minut. Wirować przez 5 s po 5 minutach i ponownie po 10 minutach.
  10. Zebrać zawiesiny buforowe Tris ze wszystkich próbek i umieścić każdą objętość w oddzielnych świeżych probówkach zbiorczych.
  11. Próbki należy stopniowo rozcieńczać i platerować zgodnie z etapem 2.6.2-2.6.6.

6. Charakterystyka bakterii i nanomateriałów po hodowli

  1. Badanie adhezji i morfologii bakterii z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
    1. Po całonocnej inkubacji dodać 10% aldehydu glutarowego do każdej studzienki 48-dołkowej, niepoddanej obróbce tkankowej płytki polistyrenowej, aż próbki zostaną całkowicie pokryte. Inkubować próbki przez 1 godzinę w celu utrwalenia komórek bakteryjnych.
    2. Odessać aldehyd glutarowy do butelki na odpady i przepłukać wszystkie próbki 3x roztworem buforowym Tris, aby usunąć nieprzylegające bakterie.
    3. Odwodnić próbki przy użyciu 30%, 75% i 100% etanolu przez 30 minut każda16.
      UWAGA: Do suszenia próbek zaleca się użycie suszarki do punktu krytycznego. Suszenie próbek na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny nie jest idealnym rozwiązaniem.
    4. Użyj przewodzących taśm klejących, takich jak taśmy miedziane lub węglowe, aby przymocować próbki do króćca SEM. Pokryj powierzchnie próbki za pomocą powłoki napylającej, aby zapewnić przewodność przed obrazowaniem (np. pokryj płytki Mg przylegającymi bakteriami pod platyną/palladem (Pt/Pd) przez 45 s przy 20 mA16).
      UWAGA: Materiały powłokowe, czas przetwarzania i prąd operacji mogą się różnić w zależności od typów próbek.
    5. Wykonaj zdjęcia bakterii na próbkach za pomocą SEM z odpowiednią odległością roboczą i przyspieszającym napięciem oraz przy pożądanych powiększeniach. Na przykład, użyj SEM z wtórnym detektorem elektronów, aby wykonać zdjęcia w odległości roboczej 5 mm i przy napięciu przyspieszającym 10 kV16.
  2. Zbadanie morfologii powierzchni próbek nanomateriałów po hodowli za pomocą SEM.
    1. W przypadku nanomateriałów należy umyć próbki za pomocą buforu Tris 3x, aby usunąć wolne bakterie, które nie są przyczepione do próbki. W przypadku nanocząstek należy zdyspersować cząstki w rozpuszczalniku, który nie wpływa na właściwości próbki poprzez ultradźwięki, aby w razie potrzeby uzyskać lepszą dyspersję.
    2. Wysuszyć próbki po procedurze mycia.
    3. Użyj dwustronnych taśm klejących węglowych lub miedzianych, aby przykleić próbki do króćca SEM.
    4. Przed obrazowaniem należy utworzyć przewodzącą warstwę powierzchniową Pt/Pd za pomocą napylarki, jak opisano w kroku 6.1.4. Wykonaj przykładowe obrazy zgodnie z opisem w kroku 6.1.5.
    5. Analizuj skład pierwiastkowy powierzchni za pomocą EDS o odpowiednim napięciu przyspieszającym i przy pożądanych powiększeniach (np. przy 10 kV po wykonaniu analizy SEM16).
  3. Obrazowanie fluorescencyjne adhezji bakteryjnej
    1. Przygotuj próbki do wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, najpierw przemywając je buforem Tris 3x. Wysusz próbki na powietrzu w temperaturze pokojowej.
    2. Wybarwić każdą próbkę barwnikiem fluorescencyjnym 10 μM tioflawiny T zgodnie z ustalonym protokołem37.
    3. Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne adhezji bakteryjnej za pomocą mikroskopu odwróconego sprzężonego z aparatem cyfrowym z urządzeniem do zwielokrotniania elektronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja antybakteryjnej aktywności nanocząsteczek tlenku magnezu i powierzchni nanostrukturalnych została przedstawiona przy użyciu czterech metod in vitro, które mają zastosowanie do różnych typów materiałów i gatunków drobnoustrojów.

Metoda A i metoda B badają aktywność bakterii po wystawieniu na działanie nanocząsteczek w fazie opóźnionej (metoda A) i fazie logarytmicznej (metoda B) przez okres 24 godzin lub dłużej. Metoda A dostarcza wyników dotyczących MIC i MBC, podczas gd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy cztery metody in vitro (A-D) charakteryzujące działanie przeciwbakteryjne nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych. Chociaż każda z tych metod określa ilościowo wzrost i żywotność bakterii w czasie w odpowiedzi na nanomateriały, istnieją pewne różnice w metodach stosowanych do pomiaru początkowej gęstości wysiewu bakterii, wzrostu i żywotności w czasie. Trzy z tych metod, metoda bezpośredniej hodowli (A)17, metoda hodowli bezpośredniej (C)14 ora...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy doceniają wsparcie finansowe od U.S. National Science Foundation (nagroda NSF CBET 1512764 i NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) oraz UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant przyznany Patricii Holt-Torres. Autorzy doceniają pomoc udzieloną przez Centralny Ośrodek Zaawansowanej Mikroskopii i Mikroanalizy (CFAMM) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside w zakresie stosowania SEM/EDS oraz dr Perry Cheung w zakresie stosowania XRD. Autorzy chcieliby również podziękować Morgan Elizabeth Nator i Samhitha Tumkur za ich pomoc w eksperymentach i analizach danych. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym artykule są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation lub National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlMilipore SigmaZ336777
80 L Certyfikowany piec do suszenia konwekcyjnego NTRL MTI CorporationBPG-7082
Bufor https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx(hydroksymetylo)aminometanowy pH 8,5; Bufor Tris Sigma-Aldrich 42457
AnaSpec  THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADEFisher Scientific50-850-291
Aparat cyfrowy ze sprzężeniem ładunku zwielokrotniającego elektrony HamamatsuC9100-13
Falcon 15 ml rurki stożkoweFisher Scientific14-959-49B
Aldehyd gluterowySigma-Aldrich G5882
HemocytometrBrightline, Hausser Scientific1492
Plazma sprzężona indukcyjnie - optyczna spektrometria emisyjna (ICP-OES)PerkinElmer8000
Mikroskop odwrotnyNikonEclipse Ti-S
Luria Bertani BrothSigma Life Science L3022
Bulion Luria Bertani + agarSigma Life Science L2897
Rurka MacroTube 5.0   Benchmark ScientificC1005-T5-ST
Nanocząstki tlenku magnezuUS Research Nanomaterials, IncNr akcji #:  US3310      MMgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro BalanceMettler ToledoMS105D
Papier nitrocelulozowyFisherbrand09-801A 12-dołkowa płytka
Marka Falcon Corning 
48-dołkowa płytka polistyrenowa niepoddana obróbce tkankowejMarka Falcon Corning 
96-dołkowa płytka polistyrenowa niepoddana obróbce tkankowejMarka Falcon Corning 
szalka Petriego 100 mmVWR470210-568
Szalka Petriego, 15 mmFisherbrand
VWRSP70P
Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)TESCAN Vega3 SBH
SonicatorVWR97043-936
Wirówka stołowaFisher ScientificaccuSpin Micro 17
Wirówka stołowa EppendorfWirówka 5430
Tryptyczny agar sojowyMP1010617
Tryptyczny bulion sojowySigma-Aldrich22092-500G
Spektrofotometr UV-Vis TecanInfinite 200 PROhttps://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Wytrząsarka Incu-shaker 10LVWRN/A
Defrakcjoncja mocy promieniowania rentgenowskiego  PanalyticalN/APANalytical Empireum serii 2
polistyrenowa niepoddana obróbce tkankowej 351143351178351172 pH-metr FB0875713A

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19(2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441(2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260(2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54(2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41(2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074(2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555(2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178(2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066(2017).
  30. MTI Corporation. 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx (2022).
  31. CHEBI. Tris (CHEBI:9754). , https://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do;?chebiId=CHEBI:9754 (2023).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Antimicrobial NanoparticlesNanostructured SurfacesIn Vitro EvaluationMinimum Inhibitory ConcentrationBactericidal ConcentrationDirect Co CultureSerial DilutionBacterial ViabilityMagnesium Oxide NanoparticlesMRSA Antimicrobial Activity

Powiązane artykuły