Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie AlDeSense do stratyfikacji komórek raka jajnika w oparciu o aktywność dehydrogenazy aldehydowej 1A1

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64713

⸱

31 marca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Biochemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 4Cancer Center of Illinois, University of Illinois Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Metody pomiaru aktywności ALDH1A1 w żywych komórkach są kluczowe w badaniach nad rakiem ze względu na jego status jako biomarkera macierzystości. W tym badaniu zastosowaliśmy selektywną izoformę sondy fluorogenicznej, aby określić względne poziomy aktywności ALDH1A1 w panelu pięciu linii komórkowych raka jajnika.

Streszczenie

Nawroty po leczeniu raka są często przypisywane utrzymywaniu się subpopulacji komórek nowotworowych znanych jako rakowe komórki macierzyste (CSC), które charakteryzują się niezwykłą zdolnością do inicjowania nowotworu i samoodnawiania. W zależności od pochodzenia guza (np. jajników), profil biomarkerów powierzchniowych CSC może się znacznie różnić, co sprawia, że identyfikacja takich komórek za pomocą barwienia immunohistochemicznego jest trudnym przedsięwzięciem. Wręcz przeciwnie, dehydrogenaza aldehydowa 1A1 (ALDH1A1) okazała się doskonałym markerem do identyfikacji CSC, ze względu na jej konserwatywny profil ekspresji w prawie wszystkich komórkach progenitorowych, w tym CSC. Izoforma ALDH1A1 należy do nadrodziny 19 enzymów, które są odpowiedzialne za utlenianie różnych endogennych i ksenobiotycznych aldehydów do odpowiadających im produktów kwasu karboksylowego. Chan i in. opracowali niedawno AlDeSense, selektywną izoformę sondy "włączającej" do wykrywania aktywności ALDH1A1, a także niereaktywnego odczynnika kontrolnego (Ctrl-AlDeSense) w celu uwzględnienia barwienia poza celem. Wykazano już, że to narzędzie do selekcji izoform jest wszechstronnym narzędziem chemicznym poprzez wykrywanie aktywności ALDH1A1 w komórkach białaczki szpikowej K562, mammosferach i ksenoprzeszczepach CSC pochodzących z czerniaka. W tym artykule użyteczność sondy została zaprezentowana poprzez dodatkowe eksperymenty z fluorymetrią, mikroskopią konfokalną i cytometrią przepływową, w których określono względną aktywność ALDH1A1 w panelu pięciu linii komórkowych raka jajnika.

Wprowadzenie

Rakowe komórki macierzyste (CSCs) stanowią subpopulację komórek nowotworowych wykazujących właściwości charakterystyczne dla komórek macierzystych1. Podobnie jak ich niezłośliwe odpowiedniki, CSCs posiadają niezwykłą zdolność do samoodnawiania i proliferacji. W połączeniu z innymi wbudowanymi mechanizmami, takimi jak nadekspresja transporterów z kaskady ATP-binding cassette, CSCs często unikają skutków początkowej chirurgicznej redukcji masy guza, a także późniejszej terapii adjuwantowej2. Ze względu na ich kluczową rolę w oporności na leczenie3, nawrotach choroby4 oraz przerzutach5, CSCs stały się priorytetem w badaniach nad nowotworami. Choć istnieje wiele antygenów powierzchniowych komórek (np. CD133), które można wykorzystać do identyfikacji CSCs6, atrakcyjną alternatywą stało się wykorzystanie aktywności enzymatycznej aldehydodehydrogenaz (ALDHs) występujących w cytoplazmie7. ALDHs to superfamilia 19 enzymów odpowiedzialnych za katalizowanie utleniania reaktywnych endogennych i ksenobiotycznych aldehydów do odpowiadających im produktów w postaci kwasów karboksylowych8.

Generalnie detoksykacja aldehydów jest kluczowa dla ochrony komórek przed niepożądanymi zdarzeniami sieciowania oraz stresem oksydacyjnym, który może uszkodzić integralność komórek macierzystych9. Ponadto izoforma 1A1 kontroluje metabolizm kwasu retinowego, co z kolei wpływa na wielopotencjałowość (stemness) via sygnalizację retinaldehydu10. Niedawno opracowano AlDeSense11,12, małocząsteczkową sondę opartą na detekcji aktywności (activity-based sensing – ABS), służącą do selektywnego wykrywania aktywności ALDH1A1. Konstrukcje ABS umożliwiają detekcję anality poprzez zmianę chemiczną, a nie zdarzenie wiązania, co pozwala na wysoką selektywność i zmniejszenie odpowiedzi poza celem (off-target)13,14,15,16. Zasada działania tej izoformo-selektywnej sondy fluorogennej opiera się na mechanizmie gaszenia poprzez fotoindukowany transfer elektronów od donora (d-PeT)17, wynikającym z obecności grupy funkcyjnej aldehydowej, która służy do tłumienia sygnatury fluorescencyjnej sondy18. Po konwersji do kwasu karboksylowego katalizowanej przez ALDH1A1, następuje odblokowanie relaksacji radiacyjnej, co prowadzi do powstania silnie fluorescencyjnego produktu. Ponieważ gaszenie d-PeT nigdy nie jest w 100% wydajne, podczas opracowywania tego testu wzięto pod uwagę fluorescencję resztkową, która może prowadzić do możliwych wyników fałszywie dodatnich, poprzez stworzenie Ctrl-AlDeSense – odczynnika nieodpowiadającego, o dopasowanych charakterystykach fotofizycznych (np. wydajności kwantowej) i identycznym wzorcu barwienia cytoplazmatycznego w komórkach. Używane razem, to unikalne zestawienie pozwala wiarygodnie odróżnić komórki o wysokiej aktywności ALDH1A1 od tych wykazujących niskie poziomy via fluorymetrię, obrazowanie molekularne i cytometrię przepływową. Stosowanie izoformo-selektywnych barwników aktywowalnych wiąże się z kilkoma kluczowymi zaletami w porównaniu do tradycyjnych metod immunohistochemicznych. Na przykład zakłada się, że CSC są ukryte głęboko w guzie, przez co są bardziej dostępne dla małych cząsteczek niż dla dużych przeciwciał19. Dodatkowo, powstały w wyniku obrotu fluorescencyjny produkt nie modyfikuje kowalencyjnie żadnego komponentu komórkowego, co oznacza, że może zostać łatwo usunięty via cykle płukania, pozostawiając CSC w stanie niemodyfikowanym. Wreszcie, odpowiedź typu „turn-on” identyfikuje wyłącznie żywe komórki i ich funkcje, podobnie jak test MTT, ze względu na zależność od kofaktora NAD+.

figure-introduction-1
Rycina 1: Schemat obrazujący fluorescencyjne włączenie sygnału AlDeSense. Barwnik selektywny względem izoform jest aktywowany przez ALDH1A1 i może być wykorzystywany do identyfikacji podwyższonej aktywności ALDH1A1 w komórkach raka jajnika poprzez fluorymetrię, obrazowanie molekularne oraz cytometrię przepływową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W poprzednich badaniach test z użyciem izoformowo-selektywnej sondy fluorogennej pozwolił na skuteczną stratyfikację komórek z wysoką aktywnością ALDH (ALDH+) od komórek z niską aktywnością ALDH (ALDH-) w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki K562, ludzkich komórkach raka piersi MDA-MB-231 oraz mysich komórkach czerniaka B16F0. Jest to istotne, ponieważ w wielu typach nowotworów wysoka ekspresja białka ALDH1A1 oznacza gorsze rokowanie kliniczne20. Zakłada się, że podwyższone poziomy ALDH1A1 są charakterystyczne dla CSC, które mogą unikać leczenia, rozwijać oporność i rozprzestrzeniać się w organizmie. Jednakże w przypadku raka jajnika istnieją badania raportujące przeciwne wyniki (wysoka ekspresja ALDH1A1 jest powiązana z lepszą przeżywalnością pacjentek)21,22,23,24. Choć na pierwszy rzut oka może się to wydawać sprzeczne, ekspresja niekoniecznie koreluje z aktywnością enzymatyczną, na którą mogą wpływać zmiany w mikrośrodowisku guza (np. zmiany pH, gradienty tlenu), dostępność kofaktora NAD+ lub substratów aldehydowych, poziomy kwasów karboksylowych (inhibicja produktowa) oraz modyfikacje potranslacyjne, które mogą zmieniać aktywność enzymu25. Dodatkowo rak jajnika dzieli się na pięć głównych typów histologicznych (surowiczy wysokiego stopnia, surowiczy niskiego stopnia, endometrioidalny, jasnokomórkowy i śluzowy), w których, według naszej hipotezy, wystąpią zmienne poziomy aktywności ALDH1A126. W celu zbadania aktywności ALDH1A1 w guzach jajnika zastosowano test z izoformowo-selektywną sondą fluorogenną, aby zidentyfikować populacje ALDH1A1+ w panelu pięciu linii komórkowych raka jajnika należących do wspomnianych wyżej typów histologicznych. Linie komórkowe przebadane w niniejszym badaniu obejmują komórki BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 i PEO4, reprezentujące histotypy jasnokomórkowy i surowiczy. W niniejszej pracy podkreślono wszechstronność i uniwersalność sondy w identyfikacji CSC dla badaczy dążących do przeprowadzenia podobnych badań w innych unieśmiertelnionych liniach komórkowych nowotworów, a także w próbkach pacjentów. Zastosowanie AlDeSense rzuci światło na szlaki biochemiczne zaangażowane w utrzymanie CSC w złożonych mikrośrodowiskach tkankowych i potencjalnie może służyć jako narzędzie kliniczne do określania rokowań oraz pomiaru agresywności nowotworu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zmierz całkowitą aktywność ALDH1A1 w homogenatach komórek raka jajnika za pomocą fluorymetrii

  1. Rozmrozić 1 × 106 komórek w kolbie do hodowli komórek T25 w 5 ml następujących pożywek do hodowli komórkowych:
    1. IGROV-1 i PEO4: Pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S).
    2. BG-1 i Caov-3: Zmodyfikowany Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% FBS i 1% P/S.
    3. OVCAR-3: RPMI 1640 z 20% FBS, 1% P/S i 0,01 mg/ml insuliny.
  2. Utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dwa do trzech pasaży. Upewnij się, że komórki nie przekraczają 80%-90% konfluencji przed przejściem.
  3. Trypsynizować komórki w 0,25% trypsyny przez 10 minut, liczyć je za pomocą automatycznego licznika komórek i osadzać 1 × 107 komórek przez odwirowanie (180 × g) w temperaturze 25 °C przez 5 minut.
  4. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację, przemyć osad przez ponowne zawieszenie komórek w 1 ml 1x PBS i ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 4.
  5. Ponownie zawiesić komórki w roztworze 1x inhibitora proteazy w 1x PBS. Użyj 1 ml tego roztworu na 2,5 × 106 komórek.
  6. Sonikuj zawiesinę komórek na lodzie przez 2 minuty (impuls 1 s, amplituda 40%) za pomocą sondy homogenizatora komórek.
  7. Frakcje nierozpuszczalne/membranowe osadów przez odwirowanie (3 200 × g) w temperaturze 25 °C przez 15 min. Usunąć i zachować supernatant, ponieważ jest to homogenat, który będzie używany w kolejnych etapach. Rozdziel homogenaty na trzy kuwety, aby przeprowadzić eksperyment w trzech egzemplarzach.
  8. Dodaj sondę do homogenatu, aby uzyskać końcowe stężenie sondy 4 μM. Pipetować w górę i w dół trzy razy, aby dobrze wymieszać roztwór.
  9. Zmierz sygnał fluorescencyjny natychmiast po dodaniu i po pożądanym czasie inkubacji na fluorymetrze. Czas inkubacji można zoptymalizować, aby zobaczyć maksymalne włączenie składania (1 godzina w tym eksperymencie). Czas inkubacji musi być stały dla wszystkich porównywanych linii komórkowych.
    1. Ustaw długość fali wzbudzenia na 496 nm.
    2. Ustaw emisję na 510-600 nm.
    3. Ustaw szerokość szczeliny na 0,5 mm.
    4. Odpipetuj roztwór do kuwety kwarcowej o pojemności 1 ml, umieść we fluorymetrze i naciśnij skanowanie.
  10. Podzielić końcową intensywność fluorescencji przy 516 nm (maksymalna długość fali fluorescencji) przez intensywność przy tej samej długości fali z początkowego odczytu, aby określić aktywację krotności barwnika selektywnego izoformowo.

2. Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania komórek o wysokiej aktywności ALDH1A1

  1. Rozmrozić 1 × 106 komórek w kolbie do hodowli komórek T25 w 5 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.
  2. Utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dwa do trzech pasaży. Upewnij się, że komórki nie przekraczają 80%-90% konfluencji przed przejściem.
  3. Dzień przed obrazowaniem konfokalnym płytka 4 × 105 komórek w 8-dołkowym szkiełku komorowym.
    1. Pokryj dno każdej studzienki poli-L-lizyną (0,1 mg/ml, 100 μl na studzienkę) przez 10 minut, a następnie zasysaj.
    2. Umyj każdą studzienkę 3 razy, dodając wodę klasy do hodowli komórkowych (100 μl na studzienkę) i zasysając.
    3. Trypsynizuj komórki w 0,25% trypsyny przez 10 minut, policz je za pomocą automatycznego licznika komórek i plateruj komórki w 4 × 105 komórek na dołek.
    4. Pozwól komórkom osiąść i przyczepić się na noc (12-16 godzin).
  4. Odessać pożywkę wzrostową i dodać pożywkę bez surowicy (500 μl na studzienkę), uzupełnioną 2 μM sondy lub sondy kontrolnej.
  5. Inkubować z sondą w temperaturze pokojowej przez 30 minut i natychmiast obrazować komórki.
  6. Włącz mikroskop konfokalny i dostosuj do próbki.
    1. Ostrożnie załaduj próbkę przy najmniejszym powiększeniu; znajdź komórki, aby zapewnić prawidłowe ustawienie.
    2. Upewnij się, że soczewka obiektywu ma 10-krotne powiększenie i zlokalizuj komórki.
  7. Do tego eksperymentu wymagany jest kanał FITC (wzbudzenie: laser 488 nm; emisja: 516-521 nm) i kanał T-PMT (światło przechodzące). Zlokalizuj i skup się na komórkach za pomocą T-PMT, aby ustawić ostrość na tej samej płaszczyźnie Z przez cały eksperyment, aby usunąć odchylenie.
  8. Dostosuj moc lasera i wzmocnienie FITC do odpowiedniego ustawienia, w którym sygnał z próbek AM Ctrl-AlDeSense jest minimalnie wykrywalny, a jednocześnie nadal widzi sygnał w próbkach AM AlDeSense. Każdy parametr można dostosować, przesuwając odpowiedni pasek. Może być konieczne kilkakrotne dostosowanie ustawień w celu zidentyfikowania prawidłowych parametrów. Po zoptymalizowaniu zakończ resztę eksperymentu w tej linii komórkowej przy użyciu identycznych parametrów.
  9. Zrób trzy obrazy na studzienkę, co daje w sumie trzy dołki na warunek leczenia (w sumie dziewięć obrazów). Ustaw ostrość na właściwej płaszczyźnie za pomocą T-PMT, aby uniknąć odchyleń, zamiast używać kanału fluorescencji lub scalonego obrazu.
  10. Przetwarzaj obrazy, aby określić procent komórek ALDH1A1+.
    1. Korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazu, podziel plik czi na różne kanały.
    2. Policz całkowitą liczbę komórek i całkowitą liczbę komórek fluorescencyjnych.
    3. Aby określić procent komórek ALDH1A1+, podziel liczbę komórek fluorescencyjnych przez całkowitą liczbę komórek na każdym obrazie. Konieczne jest liczenie w ten sam sposób dla każdego obrazu bez manipulowania obrazami, ponieważ, na przykład, dostosowanie jasności może dodać zmienną zakłócającą.

3. Zastosowanie cytometrii przepływowej do identyfikacji komórek o wysokiej aktywności ALDH1A1

  1. Rozmrozić 1 × 106 komórek w kolbie do hodowli komórek T25 w 5 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.
  2. Utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dwa do trzech pasaży. Upewnij się, że komórki nie przekraczają 80%-90% konfluencji przed przejściem.
  3. Trypsynizować, liczyć i granulować komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przez odwirowanie (180 × g) w temperaturze 25 °C przez 5 minut.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu sondy/sondy kontrolnej 2 μM w PBS. Kołysz ogniwa w temperaturze pokojowej przez 60 minut, aby zapewnić równomierną ekspozycję na barwnik.
  5. Po okresie inkubacji osadzać komórki przez odwirowanie (180 × g) w temperaturze 25 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml PBS. Przepuść komórki przez sitko komórkowe (siatka nylonowa 35 μm), aby usunąć grudki komórek, które mogą zatkać cytometr przepływowy. Natychmiast umieść komórki na lodzie.
  6. Włącz przyrząd i uruchom protokół rozruchowy.
  7. Sprawdź, czy nie ma płynu w osłonie i pustych odpadów.
  8. Uruchom linie z 10% wybielaczem i wodą przez 5 minut każda.
  9. Uruchom koraliki kontroli jakości, aby zapewnić prawidłowe działanie.
  10. W zakładce ustawień wybierz FSC (rozproszenie do przodu), SSC (rozproszenie boczne) i FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) dla filtra fluorescencyjnego.
  11. Narysuj poniższe wykresy, aby określić żywotność, singlety i fluorescencję. Zoptymalizuj moc lasera (specyficzną dla instrumentu użytkownika) tak, aby populacje komórek mieściły się w podanych parametrach do dalszej analizy.
    1. Wykres punktowy FSC-A i SSC-A: główna populacja komórek znajduje się w pobliżu środka wykresu.
    2. Wykres punktowy FSC-A kontra FSC-W: wąskie pasmo poziome wskazujące na pojedyncze (a nie skupiska komórek).
    3. Wykres punktowy FITC-A w porównaniu z FSC-A: obserwuj rozkład komórek posortowanych przez selektywną sondę fluorogeniczną z izoformą.
    4. Histogram FITC-A: obserwuj przesunięcie populacji na podstawie FITC w celu określenia procentu komórek ALDH1A1+.
  12. Aby zoptymalizować moc lasera FITC, uruchom próbkę za pomocą sondy tak, aby prawy ogon krzywej histogramu znajdował się w pobliżu maksymalnego sygnału FITC-A. Następnie uruchom próbkę za pomocą sondy kontrolnej. Przesunięcie populacji powinno być możliwe do zaobserwowania, aby ujawnić maksymalny zakres dynamiki. Etap optymalizacji mocy lasera może wymagać wielokrotnego powtórzenia, ale moc lasera nie powinna być zmieniana w próbkach po wyznaczeniu ustawienia do eksperymentu.
  13. Uruchom każdą próbkę przez 10 000 zliczeń (wykonaj w trzech egzemplarzach).
  14. Powtórz krok 3.12 dla każdej linii komórkowej, ponieważ wystąpi zmienność w wychwytywaniu i ALDH1A1 aktywności.
  15. Po zakończeniu pobierania próbki uruchom linie z 10% wybielaczem i wodą na 5 minut każda, a następnie zainicjuj wyłączenie urządzenia.
  16. Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej i bramkuj żądaną populację komórek. Ustaw bramki tak, aby wszystkie zdarzenia wpadały do bramki ALDH1A1- lub ALDH1A1+. Korzystając z wyboru bramki prostokątnej, ustaw bramkę ALDH1A1 tak, aby >99,5% zdarzeń w próbkach sondy kontrolnej zachodziło w tej bramce. Pozostałe komórki zostaną uznane za ALDH1A1+. Te same bramki można następnie zastosować do próbki sondy w celu ilościowego określenia liczby zdarzeń branych pod uwagę ALDH1A1- i ALDH1A1+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Całkowita aktywność ALDH1A1 w homogenatach komórek raka jajnika
Średnie wartości wzrostu sygnału (fold turn-ons) dla każdej linii komórkowej uzyskane w tym teście wynoszą: BG-1 (1.12 ± 0.01); IGROV-1 (1.30 ± 0.03); Caov-3 (1.72 ± 0.06); PEO4 (2.51 ± 0.29) oraz OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (Rycina 2).

figure-results-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pan-selektywność jest głównym ograniczeniem wielu sond ALDH; Jednak ostatnio zgłoszono kilka przykładów selektywności izoformowej: 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Selektywna izoforma sondy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Ujawniamy zgłoszony patent (US20200199092A1) na technologię AlDeSense.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez The National Institutes of Health (R35GM133581 do JC) oraz Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (przyznane SG). JC dziękuje Fundacji Camille i Henry'ego Dreyfusów za wsparcie. Autorzy dziękują dr Thomasowi E. Bearroodowi za jego początkowy wkład w przygotowanie akcji AlDeSense i AlDeSense AM. Dziękujemy Panu Oliverowi D. Pichardo Peguero i Panu Josephowi A. Forzano za pomoc w przygotowaniu różnych syntetycznych prekursorów. Dziękujemy prof. Erikowi Nelsonowi (Zakład Fizjologii Molekularnej i Integracyjnej, UIUC) za komórki Caov-3, IGROV-1 i PEO4. Dziękujemy prof. Paulowi Hergenrotherowi (Wydział Chemii, UIUC) za ogniwa BG-1. Dziękujemy Centralnym Placówkom Instytutu Biologii Genomowej Carla R. Woese'a za dostęp do mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 700 i odpowiedniego oprogramowania. Dziękujemy Zakładowi Cytometrii Przepływowej za dostęp do analizatora CMtO BD LSR II. Dziękujemy dr Sandrze McMasters i Cell Media Facility za pomoc w przygotowaniu pożywek do hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  0,25% trypsyna, 0,1% EDTA w HBSS bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i sodu    25-050-CI
1x Bufor fosforanowy Solanka Corning21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
AlDeSenseZsyntetyzowany we własnym zakresie
BG-1Prezent dostarczony przez Laboratorium Prof. Paula Hergenrothera, University of Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 KolbaThermo Fisher Scientific 
130189 Szafa bezpieczeństwa biologicznego seria 1300 A2Thermo Fisher Scientific 
Caov-3Prezent dostarczony przez Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Homogenizator komórkowyFisher Scientific
Wirówka 5180REppendorf22627040
Contrl-AlDeSenseZsyntetyzowany we własnym
DMEM, 10% FBS, 1% P/SPrzygotowany przez komórkę UIUC placówka medialna
Falcon Probówki z polistyrenu okrągłodennego z zatrzaskiem z filtrem siatkowym, 5 mlCorning352003
FCS Express 6Dostarczone przez UIUC CMtO
FLEVOS
FluorometrPhoton Technology International
Forma Series II z płaszczem wodnym CO2  InkubatorFisher Scientific3110
IGROV-1Prezent dostarczony przez Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
ImageJNIH
Wytrząsarka
LSM 700Zeiss
LSR IIBD
Nunc Lab-Tek Komorowy #1.0 System szkła borokrzemowegoThermo Fisher Scientific 
OVCAR-3ATCCHTB-161
PEO4Prezent dostarczony przez Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Pierce Inhibitor Inhibitor TabletsThermo ScientificA32963
Poly-L-LysineCultrex3438-100-01
RockerVWR
RPMI, 10% FBS, 1% P/SPrzygotowane przez pożywkę komórkową UIUC
RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0,01 mg/ml InsulinaPrzygotowana przez pożywkę komórkową UIUC
Mikroskop inkubacyjna Innova 42R155383

Bibliografia

  1. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
  2. Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).
  3. Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
  4. Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment. Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).
  5. Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis. Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).
  6. Kim, W. T., Ryu, C. J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).
  7. Pors, K., Moreb, J. S. Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development. Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).
  8. Jackson, B., et al. Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily. Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).
  9. Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism. Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).
  10. Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
  11. Anorma, C., et al. Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1. ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).
  12. Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity. Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).
  13. Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging. Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).
  14. East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging. Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).
  15. Yadav, A. K., et al. Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide. ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).
  16. Yadav, A. K., et al. An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells. Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).
  17. Ueno, T., et al. Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein. Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).
  18. Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).
  19. Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).
  20. Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
  21. Meng, E., et al. ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling. PLoS One. 9 (9), e107142(2014).
  22. Kaipio, K., et al. ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors. The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).
  23. Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers. PLoS One. 5 (4), e10277(2010).
  24. Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).
  25. Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity. Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).
  26. Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).
  27. Tulake, W., et al. Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma. Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).
  28. Nwani, N. G., et al. A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer. Cancers. 11 (4), 502(2019).
  29. Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathology. 73, 1-6 (2018).
  30. Landen Jr, C. N., et al. Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).
  31. Condello, S., et al. β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids. Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).
  32. Storms, R. W., et al. Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).
  33. Duellman, S. J., et al. A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity. Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).
  34. Minn, I., et al. A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase. Nature Communications. 5, 3662(2014).
  35. Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).
  36. Yagishita, A., et al. Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).
  37. Maity, S., et al. Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer. Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).
  38. Koenders, S. T. A., et al. Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells. ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).
  39. Oe, M., et al. Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells. ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).
  40. Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells. Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).
  41. Okamoto, A., et al. Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1. Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

nowotworowe kom rki macierzysteaktywno ALDH1A1sonda AlDeSensecytometria przep ywowamikroskopia konfokalnabiomarker kom rek macierzystychbramkowanie populacji kom rkowychsonda fluorogeniczna
Zastosowanie AlDeSense do stratyfikacji komórek raka jajnika w oparciu o aktywność dehydrogenazy aldehydowej 1A1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.