Zoptymalizowane metody powierzchniowej immobilizacji kolagenów i oznaczania wiązania kolagenu

Summary

Ta praca przedstawia zoptymalizowany protokół do powtarzalnego unieruchamiania i ilościowego oznaczania kolagenu typu I i III na mikropłytkach, a następnie ulepszony protokół testu wiązania in vitro do badania interakcji kolagen-związek przy użyciu metody fluorescencji rozdzielczej w czasie. Zapewniona jest późniejsza analiza danych i interpretacja danych krok po kroku.

Abstract

Zwłóknienie występuje w różnych tkankach jako reakcja naprawcza na uraz lub uszkodzenie. Jednak nadmierne zwłóknienie może prowadzić do bliznowacenia tkanek i niewydolności narządów, co wiąże się z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością. Kolagen jest kluczowym czynnikiem powodującym zwłóknienie, przy czym kolagen typu I i typu III jest głównym typem zaangażowanym w wiele chorób zwłóknieniowych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych protokołów stosowanych do immobilizacji innych białek (np. elastyny, albuminy, fibronektyny itp.), kompleksowe protokoły powtarzalnego unieruchamiania różnych typów kolagenów w celu wytworzenia stabilnych powłok nie są łatwo dostępne. Unieruchomienie kolagenu jest zaskakująco trudne, ponieważ wiele warunków eksperymentalnych może wpływać na skuteczność unieruchomienia, w tym rodzaj kolagenu, pH, temperatura i rodzaj użytej mikropłytki. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół powtarzalnego unieruchamiania i ilościowego oznaczania kolagenów typu I i III, w wyniku czego powstają stabilne i powtarzalne żele/filmy. Ponadto praca ta pokazuje, jak wykonywać, analizować i interpretować badania in vitro czasowo-rozdzielczych wiązań fluorescencyjnych w celu zbadania interakcji między kolagenami a potencjalnymi związkami wiążącymi kolagen (np. peptydem sprzężonym z chelatem metalu przenoszącym, na przykład, europ [Eu(III)]). Takie podejście może być powszechnie stosowane w różnych zastosowaniach biomedycznych, w tym w dziedzinie obrazowania molekularnego w celu opracowania ukierunkowanych sond obrazowania, opracowywania leków, badań toksyczności komórek, badań proliferacji komórek i testów immunologicznych.

Introduction

Nagromadzenie włóknistej tkanki łącznej jako część naturalnego procesu gojenia się ran po uszkodzeniu tkanki jest znane jako zwłóknienie. Jeśli jednak odkładanie się tkanki włóknistej nie zakończy się i będzie kontynuowane poza to, co jest potrzebne do naprawy tkanki, zwłóknienie staje się nadmierne^1,2. Nadmierne zwłóknienie upośledza fizjologię i funkcję narządów oraz może prowadzić do uszkodzenia narządów i potencjalnej niewydolności narządów^3,4,5. Dwa główne czynniki powodujące zwłóknienie to białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), kolagen typu I i typu III⁶. Kolagen jest białkiem strukturalnym występującym w różnych narządach, które stanowi około jednej trzeciej całkowitej zawartości białka w ludzkim ciele¹. Istnieje 28 różnych typów kolagenów zidentyfikowanych przez sekwencjonowanie ludzkiego genomu, a najliczniejsze są kolageny fibrillar collagens⁷. Podstawowym kolagenem fibrylarnym jest kolagen typu I, który zapewnia ECM wytrzymałość na rozciąganie i odporność na odkształcenia⁸. Kolagen typu III jest składnikiem strukturalnym, który zapewnia elastyczność i kolokalizuje się z kolagenem typu I. Ulega ekspresji podczas embriogenezy i naturalnie występuje w niewielkich ilościach w skórze, mięśniach i naczyniach krwionośnych dorosłych⁹.

Synteza kolagenu in vivo rozpoczyna się od procesu wewnątrzkomórkowego, w którym mRNA jest transkrybowane w jądrze, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy, gdzie ulega translacji. Po translacji utworzony łańcuch ulega modyfikacji potranslacyjnej w retikulum endoplazmatycznym, gdzie powstaje prokolagen (prekursor kolagenu). Pro-kolagen następnie przemieszcza się do aparatu Golgiego w celu ostatecznej modyfikacji, zanim zostanie wydalony do przestrzeni zewnątrzkomórkowej¹⁰. Poprzez rozszczepienie proteolityczne prokolagen przekształca się w tropokolagen. Jest to następnie sieciowane albo za pośrednictwem enzymatycznego szlaku sieciowania, katalizowanego przez enzym oksydazę lizylową (LOX), albo za pośrednictwem nieenzymatycznego szlaku sieciowania obejmującego reakcję Maillarda¹¹. Protokoły in vitro mające na celu unieruchomienie kolagenu opierają się głównie na zdolności kolagenu do samoorganizacji. Kolagen jest ekstrahowany z tkanek na podstawie jego rozpuszczalności, która w dużej mierze zależy od stopnia usieciowania poszczególnych włókien kolagenowych⁷. Kolagen fibrylarny rozpuszcza się w kwasie octowym, a włókna mogą się odkształcać, gdy pH i temperatura są dostosowane¹². In vitro fibrylogenezę kolagenu można postrzegać jako proces dwuetapowy⁷. Pierwszym etapem jest faza zarodkowania, w której włókna kolagenowe tworzą dimery i włókienka trimerowe, zanim zostaną przegrupowane, tworząc strukturę potrójnej helisy. Druga faza to faza wzrostu, w której włókienka zaczynają rosnąć bocznie i powodują charakterystyczne tworzenie się pasma D, które jest zwykle obserwowane przez zmiany zmętnienia⁷. Badania mikroskopii sił atomowych (AFM) wykazały również, że kolagen typu I i typu III ma różne cechy (Tabela 1)¹³.

Aby zbadać interakcje wiążące między kolagenem a innymi związkami, kolagen musi być powtarzalnie unieruchomiony w studzienkach mikropłytek. Istnieją różne protokoły unieruchamiania rozpuszczalnego kolagenu^14,15,16. Dostępne na rynku mikropłytki, które są wstępnie pokryte kolagenem, są zwykle używane do hodowli komórkowych. Jednak wstępnie powlekane mikropłytki mają bardzo cienką warstwę nieznanej ilości kolagenu pokrytą na studzienkach, co sprawia, że nie nadają się do testów wiązania in vitro. Istnieje kilka wyzwań związanych z unieruchamianiem kolagenu na płytce. Jednym z kluczowych wyzwań jest wybór odpowiedniego rodzaju mikropłytki, ponieważ różne rodzaje kolagenów (np. typ I i III) mają różne właściwości chemiczne, a co za tym idzie, unieruchamiają się stabilniej i skuteczniej w zależności od materiału, z którego wykonana jest mikropłytka. Kolejnym wyzwaniem są warunki eksperymentalne protokołu immobilizacji, ponieważ proces fibrylogenezy zależy od wielu czynników, w tym temperatury, pH, stężenia kolagenu i stężenia jonów w buffer⁷.

Do badania interakcji między kolagenem (celem) a innymi związkami (tj. peptydem docelowym), konieczne jest również opracowanie solidnego testu przesiewowego w celu zbadania specyficzności i selektywności związku w stosunku do celu poprzez pomiar stałej dysocjacji, K_d. Położenie równowagi tworzenia kompleksu dwucząsteczkowego między białkiem (kolagenem) a ligandem jest wyrażone w postaci stałej asocjacyjnej_Kå, której wielkość jest proporcjonalna do powinowactwa wiązania. Jednak najczęściej biochemicy wyrażają relacje powinowactwa w kategoriach stałej dysocjacji równowagi, K_d, kompleksu dwucząsteczkowego, który jest zdefiniowany jako K_d = 1/K_a (K_d i jest odwrotnością_{Ka ).} Im niższa wartość K_d, tym silniejsza siła wiązania między białkiem a ligandem. Zaleta użycia K_d do porównania powinowactwa wiązania różnych ligandów dla tego samego białka (i na odwrót) jest związana z faktem, że jednostkami K_d dla kompleksu dwucząsteczkowego są mol/L (tj. jednostka stężenia). W większości warunków eksperymentalnych wartość K_d odpowiada stężeniu liganda, które prowadzi do 50% nasycenia dostępnych miejsc wiązania na celu w równowadze^17,18. Stała dysocjacji jest zwykle ekstrahowana przez analizę ułamkowego zajętości receptora (FO), która jest definiowana jako stosunek zajętych miejsc wiązania do całkowitej liczby dostępnych miejsc wiązania, w funkcji stężenia ligandów. Można tego dokonać pod warunkiem, że dostępny jest test analityczny zdolny do rozróżnienia i zmierzenia ilości związanego liganda.

Testy wiązania ligandów in vitro mogą być wykonywane przy użyciu różnych metod bioanalitycznych, w tym fotometrii optycznej, metod radioligandowych, spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) i powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR). Spośród metod fotometrycznych, te oparte na emisji fluorescencji zazwyczaj wymagają znakowania ligandów lub białek fluoroforami w celu zwiększenia czułości i poprawy granicy wykrywalności testu. Chelaty niektórych jonów lantanowca(III), takich jak Eu(III), są bardzo atrakcyjne jako fluorofory, ponieważ mają duże przesunięcia Stokesa, wąskie pasma emisji (zapewniające dobry stosunek sygnału do szumu), ograniczone fotobielenie i długi czas emisji. Co ważne, ta ostatnia właściwość umożliwia wykorzystanie fluorescencji czasowo-rozdzielczej (TRF) z fluoroforów Eu(III) w celu zniesienia autofluorescencji tła¹⁹. W teście immunologicznym na bazie Eu(III) opartym na Eu(III) w wersji testu immunologicznego na bazie Eu(III) ze wzmocnioną dysocjacją lantanowców ligandy znakowane nieluminescencyjnym chelatem Eu(III) są inkubowane z receptorem unieruchomionym na mikropłytkach. Znakowany kompleks ligand/receptor jest oddzielany od niezwiązanego liganda, a fluorescencja Eu(III) jest aktywowana przez dysocjację kompleksu Eu(III) przy kwaśnym pH, a następnie ponowne kompleksowanie chelatorem wzmacniającym fluorescencję, tworząc osadzony w miceli, wysoce fluorescencyjny kompleks Eu(III)²⁰.

Etap dekompleksacji można osiągnąć za pomocą chelatorów, takich jak pentaoctan dietylenotriaminy (DTPA), które wykazują szybką kinetykę dekompleksacji. Jednak kompleksy Eu(III) z niektórymi makrocyklicznymi chelatorami, takimi jak DOTA (kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekan1,4,7,10-tetraoctowy) i jego pochodne monoamidowe (DO3AAm), wykazują wysoką stabilność termodynamiczną i bardzo dużą obojętność kinetyczną. W takim przypadku etapy dekompleksacji muszą być dokładnie zoptymalizowane, aby osiągnąć wystarczającą i powtarzalną aktywację TRF^{21 opartej na Eu(III).} Warto zauważyć, że kompleksy lantanowców (Ln(III))-DOTA i Ln(III)-DO3AAm są najczęściej stosowane jako środki kontrastowe do obrazowania molekularnego in vivo technikami rezonansu magnetycznego (MRI)²². W związku z tym test TRF oparty na Ln (III) jest narzędziem z wyboru do badania in vitro powinowactwa wiązania sond molekularnych MRI z ich zamierzonymi celami biologicznymi. Obecnie brakuje kompleksowych i powtarzalnych protokołów immobilizacji kolagenu typu I i typu III oraz powtarzalnego procesu przeprowadzania eksperymentów z wiązaniem Eu(III) TRF in vitro. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano powtarzalne metody samoorganizacji i immobilizacji kolagenu typu I i typu III oraz generowania stabilnych żeli i filmów o wystarczającym stężeniu kolagenu wymaganym do testów wiązania in vitro. Przedstawiono zoptymalizowany protokół dla Eu(III) TRF wysoce obojętnych kompleksów opartych na Eu(III)-DO3Aam. Na koniec pokazano zoptymalizowany test TRF in vitro mikropłytki Eu (III) do pomiaru K_d ligandów znakowanych Eu (III) w kierunku unieruchomionego kolagenu typu I i typu III (Rysunek 1).

Protocol

UWAGA: Wszystkie informacje o produkcie użyte do tej pracy są przedstawione w Tabeli Materiałów.

1. Unieruchomienie kolagenu

UWAGA: Upewnij się, że każda studzienka w mikropłytce używanej podczas testu wiązania ma przylegające dołki wolne, aby uniknąć fluorescencji krzyżowej. Przeprowadź tę część protokołu na lodzie, ponieważ kolagen samoorganizuje się pod wpływem rosnących temperatur i poziomów pH. Procedurę tę należy wykonać w kapturze do hodowli tkankowej i w sterylnych warunkach, ponieważ mikropłytki są następnie inkubowane w inkubatorze do hodowli tkankowych (TC).

1. Unieruchomienie kolagenu typu I na 96-dołkowych mikropłytkach (Rysunek 2)
   Dzień 1
   1. Przygotuj silikonową tackę z lodem. Umieść fiolkę zawierającą kolagen typu I, zimną sól fizjologiczną buforowaną 10 razy fosforanem (PBS) i mikropłytki na lodzie i spryskaj wszystko 70% etanolem. Umieść materiał pod maską TC.
   2. Zneutralizuj kolagen za pomocą równych objętości kolagenu typu I i 10x PBS (pH 7,4).
   3. Odwróć roztwór kilka razy, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki.
   4. Dodać 100 μl zneutralizowanego kolagenu do co drugiego dołka i co drugiego rzędu mikropłytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18-20 godzin, aby odparować kolagen do sucha.
      Dzień 2
   5. Umyj mikropłytki 100 μl 1x PBS o pH 7,4 dwukrotnie, aby usunąć niezwiązany kolagen.
   6. Przenieść mikropłytki do inkubatora w temperaturze 37 °C na kolejne 2 godziny do wyschnięcia przed użyciem ich do dalszych doświadczeń wiążących.
2. Unieruchomienie kolagenu typu III na 96-dołkowych mikropłytkach (Rysunek 3)
   Dzień 1
   1. Przygotuj silikonową tackę z lodem. Umieść fiolkę zawierającą kolagen typu III, zimny 10x PBS i mikropłytki na lodzie i spryskaj wszystko 70% etanolem. Umieść materiał pod maską TC.
   2. Zneutralizuj kolagen za pomocą równych objętości kolagenu typu III i 10x PBS (pH 7,4).
   3. Dodać 70 μl zneutralizowanego kolagenu do co drugiego dołka i co drugiego rzędu mikropłytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, umieszczając mikropłytkę pod kapturem do hodowli tkankowej w celu odparowania kolagenu do sucha.
      Dzień 2
   4. Umyj mikropłytki 70 μl 1x PBS o pH 7,4 dwukrotnie, aby usunąć niezwiązany kolagen.
   5. Przenieść mikropłytki do inkubatora na 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie przenieść mikropłytki na stół laboratoryjny i pozostawić na 1 godzinę do wyschnięcia przed użyciem ich w dalszych doświadczeniach wiążących.

2. Ocena stabilności unieruchomionych żeli/filmów kolagenowych

1. Inkubacja z PBS przez 1 h
   UWAGA: Podczas eksperymentu wiązania inkubuj unieruchomiony kolagen z interesującym go związkiem. Ważne jest, aby zbadać stabilność powstałego żelu lub filmu kolagenowego. Aby to zrobić, zmierz stabilność trzech warunków: brak mycia = mierzy unieruchomiony kolagen bezpośrednio po inkubacji; mycie = mierzy unieruchomiony kolagen po dwukrotnym umyciu płytki 100 μL PBS; i 1 h PBS mimic & wash = mierzy unieruchomiony kolagen po inkubacji przez 1 godzinę z PBS, a następnie dwóch płukaniach PBS. Poniżej wyjaśniono metodę inkubacji PBS.
   1. Dodać 70 μl PBS (1x) do każdej z studzienek pokrytych kolagenem i inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   2. Odessać nadmiar płynu z każdej studzienki za pomocą pipety i przemyć PBS (1x) dwukrotnie przed przeprowadzeniem opisanego poniżej testu oznaczania ilościowego białka.
2. Oznaczanie ilościowe ilości unieruchomionego kolagenu za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA)
   UWAGA: Użyj zestawu do oznaczania białek Pierce BCA (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Stwórz odpowiednie standardy kolagenu dla tego testu. Zakres stężeń dla kolagenu I wynosi od 0-3 000 μg/ml, a dla kolagenu III od 0-750 μg/ml. W sumie wykonaj 11 wzorców na kolagen.
   1. Przygotuj całkowitą objętość potrzebnego odczynnika roboczego (WR), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Dodać 25 μl każdego ze wzorców kolagenu do studzienek na mikropłytkę (w dwóch częściach). Rozwiązania te służą do rysowania krzywej standardowej.
   3. Dodać 200 μl roboczego roztworu odczynnika do każdej ze studzienek zawierających wzorce i studzienek pokrytych nieznanymi stężeniami kolagenu.
   4. Umieścić mikropłytkę na wytrząsarce na 30 s. Przykryć mikropłytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   5. Wyjmij mikropłytki i pozostaw do ostygnięcia w temperaturze pokojowej. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 560 nm za pomocą czytnika płytek.
   6. Wykreślić krzywą kalibracyjną, wykreślając A₅₆₀ (AU) w stosunku do stężenia (μg/ml) 11 roztworów wzorcowych i użyć krzywej kalibracyjnej do obliczenia ilości kolagenu.

3. Test wiązania ligandów TRF europ(III) (Rysunek 1)

UWAGA: Użyty związek to peptyd wiążący kolagen (CBP) oznaczony pojedynczym kompleksem Eu(III)-DO3AAm, określanym jako Eu(III)-DO3AAm-CBP (Rysunek 4).

1. Inkubacja płytek pokrytych kolagenem ze związkiem Eu(III)-DO3AAm-CBP
   1. Przygotować roztwory związku Eu(III)-DO3AAm-CBP o stężeniach w zakresie 0,1-15 μM (0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 3 μM, 5 μM, 7 μM, 10 μM i 15 μM) w 1x PBS.
   2. Dodać 75 μl każdego stężenia związku do studzienek pokrytych kolagenem (tablica A). Wykonaj eksperyment w trzech egzemplarzach, aby obliczyć ilość związku, który wiąże się z kolagenem.
   3. Użyć drugiej niepowlekanej płytki (płytki B) i dodać 75 μl każdego związku do pustych studzienek, aby obliczyć niespecyficzne wiązanie związku z płytką. Dla każdego stężenia należy użyć trzech egzemplarzy.
   4. Inkubować mikropłytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   5. Za pomocą pipety odessać i wyrzucić nadmiar roztworu z każdej studzienki, a następnie dwukrotnie umyć studzienki 1x PBS, aby usunąć nadmiar, niezwiązany związek. Wykonaj ten krok, używając zarówno mikropłytek pokrytych kolagenem, jak i niepowlekanych.
   6. Do trzeciej niepowlekanej płytki (Tabliczka C) dodać 10 μl tego samego zakresu stężeń Eu(III)-DO3AAm-CBP (dwukrotnie). Użyj odczytu fluorescencji z Eu(III)-DO3AAm-CBP w roztworze, aby wykonać krzywą kalibracyjną.
      UWAGA: Nie myj ani nie odsysaj roztworu z tej płytki.
2. Ekstrakcja kwasowa europu(III) i odczyty fluorescencji czasowo-rozdzielczej (TRF)
   UWAGA: Należy zapoznać się z informacjami uzupełniającymi dotyczącymi przygotowania i kalibracji objętości roztworu kwaśnego (AS) i roztworu buforowego (BS). Objętości AS i BS wymagane do powtarzalnego osiągnięcia optymalnego pH wynosiły odpowiednio 54 μl i 46 μl w tej pracy. Wykonaj następującą operację na płycie A, płycie B i płycie C.
   1. Dodać 54 μl kwaśnego roztworu (AS) do każdego dołka i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 90 minut, przykrywając mikropłytki folią, aby uniknąć parowania. Temperatura i czas inkubacji muszą być dokładnie kontrolowane, aby uzyskać powtarzalną dekompleksację.
   2. Dodać 46 μl roztworu buforowego (BS) do każdego dołka i delikatnie wstrząsać płytką przez 30 s.
   3. Dodać 100 μl roztworu wzmacniającego (ES) i wstrząsać płytką przez 30 s.
   4. Odczekaj 30 minut przed odczytaniem tabliczki za pomocą czytnika płytek TRF. Należy użyć parametrów wymienionych w tabeli 2.

4. Analiza danych

1. Kwantyfikacja stężenia kolagenu unieruchomionego na studzienkach
   1. Uzyskać równanie krzywej kalibracyjnej A₅₆₀ (AU) w stosunku do stężenia (μg/ml) 11 roztworów wzorcowych.
      1. Wykorzystaj odczyty absorbancji uzyskane ze studzienek zawierających wzorce kolagenu.
      2. Sporządzić tabelę średnich wartości ze zduplikowanych studzienek i wykreślić średnią absorbancję w stosunku do znanych stężeń białka (kolagenu) (μg/ml), aby uzyskać równanie dla krzywej wzorcowej.
   2. Użyj wartości absorbancji, aby obliczyć masę (μg) i stężenie (M) unieruchomionego kolagenu.
      1. Oblicz średnie wartości absorbancji w trzech studzienkach, które zawierały unieruchomiony kolagen i zapisz odchylenie standardowe.
      2. Użyć równania krzywej standardowej uzyskanego z krzywej wzorcowej kolagenu (krok 2.2.6), aby przeliczyć absorbancję zmierzoną z dołków pokrytych kolagenem na uzgodnienie. Na tej podstawie oblicz stężenie kolagenu, który został unieruchomiony w dołkach doświadczalnych w μg/ml.
      3. Przelicz stężenie obliczone w kroku 4.1.2.2 (μg/ml) najpierw na gramy/litr, a następnie, w oparciu o masę cząsteczkową kolagenu, na molowy (M).
      4. Na koniec oblicz masę kolagenu unieruchomionego w każdym dołku, dzieląc stężenie przez objętość kolagenu dodanego do studzienki (100 μl dla kolagenu typu I i 70 μl dla kolagenu typu III).
2. Obliczanie stałej dysocjacji (K_d) (Rysunek 4)
   1. Wyodrębnij odczyty fluorescencji.
      1. Eksportuj odczyty fluorescencji z czytnika płytek do arkusza kalkulacyjnego.
         UWAGA: W testach wiązania ważne jest, aby uwzględnić potencjalne niespecyficzne wiązanie związku z plastyczną powierzchnią płytek.
      2. Obliczyć średnie wartości z potrójnych pomiarów z każdego stężenia związku dla trzech różnych płytek: właściwych odczytów wiązania z powlekanych studzienek (płyta A), niespecyficznego wiązania z niepowlekanych studzienek (płyta B) oraz całkowitego Eu(III)-DO3AAm-CBP w roztworze w niepowlekanych studzienkach (tablica C).
      3. Określić wartości fluorescencji dla związanego związku, odejmując odczyty fluorescencji studzienek niepowlekanych (tabliczka B) od odczytów studzienek powlekanych (tabliczka A).
         Równanie 1: Wyznaczanie fluorescencji wiązanej¹⁷:
         Fluorescencja związana = Specyficzna (studzienki powlekane) - Niespecyficzna (studzienki niepowlekane)
      4. Wygeneruj krzywą kalibracyjną, korzystając z odczytów związku znakowanego Eu(III) w roztworze (tabliczka C). Wykreślić odczyty fluorescencji uzyskane w stosunku do stężenia związku znakowanego Eu(III). Wykonaj dopasowanie regresji liniowej.
   2. Przelicz odczyty fluorescencji na stężenia.
      1. Przeliczyć odczyty fluorescencji związanej (etap 4.2.3) na stężenie, stosując wzorcową krzywą fluorescencji na podstawie danych uzyskanych przy użyciu stężeń związku w roztworze (etap 4.2.1.4).
         UWAGA: Porównując właściwości wiązania jednego związku z różnymi białkami docelowymi, które unieruchamiają się w różnych stężeniach, te ostatnie będą musiały być brane pod uwagę przy obliczaniu ilości związku związanego z celem (tj. związanego związku/białka).
      2. Podzielić stężenie związanego związku przez stężenie białka unieruchomionego w studzience.
         UWAGA: Do tego obliczenia należy użyć stężenia unieruchomionego kolagenu, które zostało obliczone po inkubacji studzienek z PBS przez 1 godzinę (tak zwany eksperyment mimiczny PBS; sekcja 2.1 powyżej). Ma to na celu uwzględnienie potencjalnych strat kolagenu podczas etapu inkubacji i etapu mycia, które nie przyczynią się do końcowego sygnału fluorescencji.
      3. Wykreśl dane za pomocą wykresu punktowego, który zawiera stężenia związku na osi x (μM) i związanego związku/białka na osi y.
   3. Uzyskaj wartości K_d.
      1. Dopasuj dane uzyskane w kroku 4.2.2.3, korzystając z dwóch możliwych modeli kinetycznych wiązania: wiązania jednomiejscowego i wiązania jednomiejscowego ze zboczem wzgórza. Równania dla każdego modelu są pokazane w Rysunek 6.
      2. Wybierz model, który zapewnia jednoznaczne dopasowanie z najwyższą wartością R-kwadrat podczas dopasowywania danych.
      3. Wykluczyć wartości odstające (s) dla każdego zestawu odczytów fluorescencji na stężenie na płytkę.
      4. Oblicz końcową wartość K_d i przedstaw dane jako średnią ± odchylenie standardowe niezależnych eksperymentów.
         UWAGA: Aby uzyskać wiarygodne wyniki, wykonaj trzykrotne pomiary na każdej płytce i co najmniej trzy niezależne eksperymenty z różnymi mikropłytkami.
   4. Oblicz ułamkowe obłożenie (FO).
      UWAGA: Z równania 2 stężenie celu jest nieznane, a zatem, przy użyciu algebry i K_d, z równania 3 powstaje wykonalne równanie do obliczania ułamkowego obłożenia w postaci równania 4.
      Równanie 2: Definicja ułamkowego obłożenia¹⁷:
      
      Równanie 3: Stała dysocjacji, K_d, czyli stężenie, przy którym związek zajmuje 50% celu w stanie równowagi¹⁷:
      
      Równanie 4: Zmieniono układ równania w celu obliczenia równania FO¹⁷:
      
      1. Obliczyć FO, korzystając z niezależnych wartości K_d uzyskanych dla każdej pojedynczej płytki. Wykreślić wyniki, średnią i odchylenia standardowe FO w stosunku do stężenia związku.
      2. Raportuj FO z wartościami z zakresu od 0 do 1 lub jako wartość procentową z wartościami z zakresu od 0% do 100%.

Results

Ocena stabilności i stężenia kolagenu typu I i III unieruchomionego w żelach/filmach
Kwantyfikacja stężenia kolagenu unieruchomionego na studzienkę przeprowadzono przy użyciu trzech różnych warunków: a) w studzienkach bez mycia PBS po unieruchomieniu białek (bez mycia); b) w studzienkach z etapem płukania (dwukrotnie z PBS) po unieruchomieniu w celu usunięcia niepowlekanego białka; c) w studzienkach po inkubacji z PBS przez 1 godzinę (doświadczenie naśladujące PBS). Etap inkubacji naśladujący PBS prz...

Discussion

W pracy przedstawiono powtarzalną metodę unieruchamiania kolagenu typu I i typu III. Demonstruje również protokół pozyskiwania, analizowania i interpretowania danych dotyczących wiązania in vitro Eu(III) TRF w celu scharakteryzowania właściwości wiązania ligandu kandydującego z kolagenem typu I i III. Przedstawione tutaj protokoły unieruchamiania kolagenu typu I i typu III zostały opracowane i zoptymalizowane z uwzględnieniem wcześniej opublikowanych prac dotyczących fibrylogenezy kolagenu typu I i typu III ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Gibco	14200075	Użyj tego, aby zrobić 1x PBS, rozcieńczając w wodzie (1:10)
10x PBS	Gibco	14200075	Użyj tego, aby zrobić 1x PBS przez rozcieńczenie w wodzie (1:10)
2M HCL			Wyprodukowano we własnym zakresie, a szczegóły znajdują się w dokumencie uzupełniającym
2M HCL			Made in house, a szczegóły znajdują się w dokumencie uzupełniającym
2M Wodorotlenek sodu +2M Glicyna			Wyprodukowano we własnym zakresie, a szczegóły znajdują się w dokumencie uzupełniającym
2M Wodorotlenek sodu +2M Glicyna			Wyprodukowano we własnym zakresie, a szczegóły znajdują się w dokumencie uzupełniającym
Cell-star 96 dołk  mikropłytka	Greiner Bio-One	655 160
Cell-star 96 studni  mikropłytka	Greiner Bio-One	655 160
DELFIA roztwór do wzmacniania	Perkin Elmer	1244-104
DELFIA roztwór do wzmacniania	Perkin Elmer	1244-104
Lód
Lód
Czytnik mikropłytek Infinite 200 PRO NanoQuant	TECAN
Infinite 200 PRO NanoQuant	TECAN
Niewiążące (NBS) 96-dołkowe mikropłytki	Corning	3641
Niewiążące (NBS) 96-dołkowe mikropłytki	Elektroda pH Corning	3641
Inlab Routine	METTLER TOLEDO
Elektroda pH Inlab Routine	METTLER TOLEDO
51343050 pH-metr (sevenCompact)	METTLER TOLEDO
pH-metr (sevenCompact)	METTLER TOLEDO
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermofisher	23227
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermofisher	23227
Inkubator do hodowli tkankowych (37 ° C, 5% CO2)Kolagen
bydlęcy typu I, 3 mg/ml	Corning	354231
Ludzki kolagen łożyskowy typu III, 0,99 mg/ml	Advanced Biomatrix	5021