Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie strategii łączenia dwóch ziół w leczeniu uszkodzonych komórek PC12

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64721

⸱

18 listopada 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Chengdu Medical College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia strategię kombinacji dwóch ziół do leczenia uszkodzonych komórek PC12. Protokół stanowi odniesienie do optymalizacji najlepszego trybu aplikacji tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM).

Streszczenie

Ze względu na korzyści płynące z połączenia tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM) w leczeniu niedokrwienia mózgu, badaliśmy różnice w skuteczności i mechanizmie między kombinacją preparatów a kombinacją składników, aby zbadać strategię kombinacji dwóch ziół w leczeniu uszkodzonych komórek PC12. Chlorek kobaltu (CoCl2) w połączeniu z podłożem bezglukozowym zastosowano w celu wywołania uszkodzenia oksydacyjnego komórek PC12. Następnie wybrano optymalną kombinację iniekcji Astragalus mongholicus (Ast) i Erigeron breviscapus (Eri) i połączono je zgodnie z jednolitymi metodami projektowania po przeprowadzeniu badań przesiewowych ich bezpiecznego i skutecznego stężenia na komórkach PC12. Ponadto przesiewana kombinacja składników zawiera 10 μM astragalozydu A, 40 μM scutellariny i 75 μM kwasu chlorogenowego w dwóch ziołach. Następnie zastosowano MTT, aneksynę V-FITC/PI, immunofluorescencję i analizę Western blot w celu oceny skuteczności i mechanizmu kombinacji preparatów i kombinacji składników na uszkodzonych komórkach PC12. Wyniki wykazały, że optymalną kombinacją preparatów dla pro-przeżycia komórek była iniekcja Ast i kapsułka Eri o stężeniu 6:1,8 (μM). Kombinacja składników (10 μM astragalozydu A, 40 μM scutellariny i 75 μM kwasu chlorogenowego) była bardziej skuteczna niż kombinacja preparatów. Obie kombinacje znacznie zmniejszyły szybkość apoptozy, intensywność fluorescencji kaspazy-3 i poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS); tymczasem zwiększyli poziomy ekspresji p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax i Nrf2. Efekty te były bardziej widoczne w kombinacji składników. Podsumowując, obie kombinacje mogą hamować uszkodzenia wywołane przez CoCl2 w połączeniu z pożywką wolną od glukozy na komórkach PC12, sprzyjając w ten sposób przeżyciu komórek. Jednak skuteczność kombinacji składników w porównaniu z kombinacją preparatów może wynikać z silniejszej regulacji szlaku sygnałowego PI3K/Akt/Nrf2 związanego ze stresem oksydacyjnym i apoptozą.

Wprowadzenie

Przewlekłe niedokrwienie mózgu, spowodowane hipoperfuzją mózgu, jest powszechną chorobą u osób w średnim i starszym wieku1. Jako długotrwała utajona choroba niedokrwienna może prowadzić do postępującej lub uporczywej dysfunkcji neurologicznej. Główne mechanizmy patologiczne obejmują apoptozę komórek i uszkodzenia oksydacyjne, prowadzące do postępującej lub utrzymującej się dysfunkcji neurologicznej; jest to patologiczna podstawa choroby Alzheimera, otępienia naczyniowego i innych chorób, która poważnie wpływa na jakość życia pacjentów. Jednak we współczesnej medycynie wciąż brakuje idealnych leków do leczenia przewlekłego niedokrwienia mózgu2. W tym samym czasie, połączenie Astragalus mongholicus (Ast) i Erigeron breviscapus (Eri) jest szeroko stosowane w praktyce klinicznej tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM)4. Strategia skojarzona znacznie poprawiła się w promowaniu odzyskiwania funkcji nerwów po niedokrwieniu mózgu, co jest lepsze niż w przypadku pojedynczego leku; Istnieją jednak duże różnice w proporcjach dawkowania w połączeniu tych dwóch leków4. Skuteczne składniki i mechanizm działania nie są dobrze określone, co jest kluczową kwestią ograniczającą jego zastosowanie kliniczne.

Poprzednie badania wykazały synergiczny efekt kombinacji preparatu polegającego na wstrzyknięciu Ast i wstrzyknięciu Eri w leczeniu niedokrwienia mózgu u szczurów. Może regulować w górę ekspresję białka p-Akt i zmniejszać ekspresję białka promotora śmierci związanego z Bcl-2 (BAD) 5,6, które jest jednym z białek z rodziny B-limphoblastoma 2 (Bcl-2) i ma wpływ na promowanie apoptozy. Nie jest jednak jasne, jakie są materialne podstawy i mechanizm jego synergicznego działania. Ponadto ustalono model uszkodzenia komórek PC12 za pomocą pożywki bezglukozowej połączonej z CoCl2, a optymalna kombinacja składników w Ast i Eri została przebadana i zdefiniowana7.

W tym badaniu, skuteczne dawki Ast i Eri są badane przy użyciu uszkodzonego modelu komórek PC12. Optymalna kombinacja tych dwóch leków jest badana przy użyciu tego modelu w połączeniu z metodą projektowania jednorodnego. Model komórkowy służy do dalszej oceny różnic w skutkach i mechanizmach kombinacji preparatów i kombinacji składników w uszkodzonych komórkach PC12. Strategia ta ma na celu zbadanie efektu ochronnego i mechanizmu regulacyjnego dwóch typów kombinacji na uszkodzonych komórkach PC12 poprzez szlak sygnałowy PI3K/Akt/Nrf2 w celu określenia najlepszego trybu kombinacji. Badanie to stanowi punkt odniesienia dla optymalizacji najlepszego trybu aplikacji TCM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Przygotować kompletną pożywkę, dodając 90 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości cukru, 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1 ml roztworu penicyliny i streptomycyny w sterylnej kolbie hodowlanej o pojemności 125 ml. Wymieszać całe podłoże i przechowywać w temperaturze 4 °C w warunkach zamkniętych.
  2. Przygotować roztwór CoCl2 dodając 0,02 g proszku CoCl2 (dokładnie zważonego) w 10 ml pożywki bezcukrowej DMEM (całkowicie rozpuszczonej) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 8,4 mM. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra bakteryjnego 0,22 μm, zamknąć go i przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.
    UWAGA: CoCl2 jest niestabilny i powinien być przechowywany w hermetycznym pojemniku, chronionym przed światłem; okres ważności roztworu CoCl2 wynosi 7 dni.
  3. Przygotować buforowany roztwór soli Tris-Hcl (TBST).
    1. Dokładnie odważ 8 g chlorku sodu, 0,2 g chlorku potasu i 3 g Tris-base. Dodaj je do zlewki o pojemności 1 l, a następnie dodaj 1 000 ml wody RO, aby rozpuścić mieszaninę.
    2. Dostosuj pH do 7,4, dodaj 1 ml Tween 20 i dokładnie wymieszaj, aby uzyskać roztwór TBST.
      UWAGA: Tween 20 działa jako środek powierzchniowo czynny w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania przeciwciał z antygenami i działa najlepiej w stężeniu 0,1%.
  4. Przygotować roztwór MTT (sól bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2)-2,5-difenylotetrazoliowego), ważąc 0,1 g proszku MTT w 20 ml roztworu PBS w celu otrzymania roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra bakteryjnego 0,22 μm, zamknąć go i przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła, w trybie czuwania.
    UWAGA: Proszek MTT jest niestabilny i łatwo wchłania wilgoć, dlatego należy go przechowywać w zamkniętym i suchym miejscu z dala od światła. Rozwiązanie MTT wygasa po 7 dniach. MTT ma działanie rakotwórcze, dlatego należy unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą.
  5. Przygotować roztwór kapsułki Eri, usuwając otoczkę kapsułki i dokładnie ważąc 0,18 g zawartości w 10 ml pożywki bezcukrowej DMEM, aby przygotować 100 μM roztwór podstawowy (w oparciu o stężenie scutellariny). Przefiltrować roztwór za pomocą filtra bakteryjnego 0,2 μm, zamknąć go i przechowywać w hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Scutellarin jest głównym składnikiem aktywnym Erigeron breviscapus. Stężenie scutellaryny w kapsułkach zostało określone za pomocą HPLC-UV na 2,56 mg/g, tj. 5,54 μmol/g8. Stężenie preparatu oblicza się na podstawie stężenia scutellaryny. Jest to wygodne do oceny aktywności farmakologicznej preparatu i składnika.
  6. Przygotować roztwór do wstrzykiwań Ast, dodając 5 ml roztworu do wstrzykiwań i 5 ml bezcukrowego podłoża DMEM do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 60 μM (w oparciu o stężenie tragankozydu A). Przefiltrować roztwór przez filtr bakteryjny 0,2 μm i przechowywać w hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Objętość wstrzyknięcia wynosi 10 ml każdy, a stężenie tragankozydu A w wstrzyknięciu zostało określone za pomocą HPLC-ELSD na 0,094 mg/ml (tj. 120 μM)9. Preparat powinien być przeprowadzany w komorze bezpieczeństwa biologicznego i przez cały czas obsługiwany w sposób nieprzepuszczający światła. Objętość roztworu do wstrzykiwań i pożywki bezcukrowej należy dokładnie odmierzyć i dobrze wymieszać.
  7. Przygotować roztwór astragalozydu A, dokładnie ważąc 7,85 mg wzorca astragalozydu A i rozpuszczając go całkowicie w 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 5,000 μM. Przefiltruj go za pomocą filtra bakteryjnego 0,22 μm i przechowuj w szczelnie zamkniętym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Proszek Astragaloside A jest nierozpuszczalny w podłożu bezcukrowym. Przygotowując roztwór, należy go rozpuścić w odpowiedniej ilości DMSO, aby utrzymać końcowe eksperymentalne stężenie DMSO poniżej 0,1%, aby zapewnić brak cytotoksyczności.
  8. Przygotować roztwór scutellariny, ważąc dokładnie 11,56 mg wzorca scutellariny i całkowicie rozpuszczając go w 5 ml bezcukrowej pożywki DMEM, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 5 000 μM. Przefiltrować go za pomocą filtra bakteryjnego 0,22 μm i przechowywać szczelnie w temperaturze 4 °C.
  9. Przygotować roztwór kwasu chlorogenowego, ważąc dokładnie 8,86 mg wzorca kwasu chlorogenowego i całkowicie rozpuszczając go w 5 ml bezcukrowej pożywki DMEM, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 5,000 μM. Przefiltruj go za pomocą filtra bakteryjnego 0,22 μm i przechowuj w szczelnie zamkniętym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Kwas chlorogenowy w proszku jest niestabilny i łatwo wchłania wodę. Powinien być szczelnie zamknięty i przechowywany w temperaturze 4 °C z dala od światła; Podczas ważenia należy zminimalizować czas ekspozycji.

2. Test żywotności komórek

  1. Uzyskaj komórki PC12 i hoduj je w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
    UWAGA: W tym badaniu komórki pochodzą z Chińskiej Akademii Nauk. Komórki PC12 są komórkami adherentnymi, które mają ogólną charakterystykę komórek neuroendokrynnych i są szeroko stosowane w neurofizjologii i neurofarmakologii.
  2. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze uzupełnionym 5% CO2 i podkulturować je co 2-3 dni. Użyj komórek w przejściach 4-8 dla wszystkich eksperymentów.
  3. Hodowla komórkowa
    1. Potraktuj komórki PC12 w logarytmicznej fazie wzrostu (70% -80% zbiegu komórek) 1 ml trypsyny (0,25%) i obserwuj komórki pod mikroskopem. Kiedy komórki staną się okrągłe, przerwij trawienie trypsyny, dodając 3 ml kompletnej pożywki.
    2. Przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 840 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić z kompletną pożywką i przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie policz liczbę komórek za pomocą cytometru przepływowego.
      1. Uruchom oprogramowanie do cytometrii przepływowej, wybierz odpowiednią wielokrotność rozcieńczenia roztworu komórkowego w ustawieniach zliczania i kliknij Wykres gęstości po załadowaniu próbki komórek z probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      2. Zakreśl populację komórek w kierunku od osi X i osi Y, kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę danych poniżej rysunku, a następnie wybierz pozycję Liczba X, Y, Liczba i Abs. Dane w obszarze Liczba abs w tabeli danych zawierają wynik zliczania komórek.
    3. Dostosuj stężenie komórek do 1 x 105 komórek/ml, zaszczepić 100 μl/basenik na 96-dołkowych płytkach i hodować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze przez 24 godziny.
  4. Badania przesiewowe bezpiecznych stężeń dwóch leków na prawidłowych komórkach PC12
    1. Hodować komórki zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.2. Odrzucić supernatant i potraktować normalne komórki różnymi końcowymi stężeniami wstrzyknięcia Ast (4, 8, 12, 16, 20 i 24 μM) i kapsułki Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 i 20 μM). Traktuj sześć powtórzonych studzienek z każdej grupy przez 24 godziny
      UWAGA: Leki dodaje się do pożywki w celu osiągnięcia końcowego stężenia leku (wspomnianego w kroku 2.4.1), a następnie do każdej studzienki dodaje się równą objętość pożywki. Podczas zasysania supernatantu końcówkę pipety należy delikatnie przyłożyć do ścianki studzienki, aby uniknąć kontaktu z komórkami na dnie studzienki. Podczas dodawania różnych roztworów należy dodawać je delikatnie i szybko wzdłuż krawędzi studzienek i zwracać uwagę podczas wymiany głowicy pistoletu do pipet, aby nie wpływać na wyniki eksperymentów.
    2. Odrzucić supernatant, dodać 120 μl roztworu MTT (1 mg/ml) do każdego dołka i inkubować komórki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
    3. Po inkubacji ponownie wyrzucić supernatant i dodać 150 μl DMSO do każdego dołka. Potrząsaj płytką przez 10 minut z prędkością 240 razy/min (liczba drgań poziomych na minutę) za pomocą oscylatora wirowego.
    4. Zmierzyć absorbancję każdej próbki przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Obliczyć żywotność komórek (%), która jest absorbancją grupy poddanej działaniu substancji/absorbancją normalnej grupy (kontrolnej) x 100,
      UWAGA: Upewnij się, że rozwiązanie MTT jest w okresie ważności; Jeśli kolor się zmienił (na ciemnozielony), nie można go użyć. Podczas badania absorbancji komórek należy ustawić studzienkę ślepą (pożywka hodowlana i MTT, bez komórek i leków) w celu wyeliminowania interferencji innych odczynników. Do każdej studzienki dodaje się objętość 150 μl DMSO i wstrząsa przez 10 minut, aby lepiej rozpuścić niebiesko-fioletowe kryształy. Absorbancja powinna zostać wykryta tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić dokładność wyników.
  5. Badania przesiewowe efektywnych stężeń dwóch leków na uszkodzonych komórkach PC12
    1. Hodować komórki przez 24 godziny, jak wspomniano w krokach 2.1-2.2, odrzucić supernatant, a następnie potraktować komórki 20 μl/basenik CoCl2 (0,4 mM) w połączeniu z pożywką bezcukrową.
    2. Jednocześnie potraktować komórki 100 μl/studzienkę iniekcji Ast (końcowe stężenia to 2, 6, 8, 10 i 12 μM) lub 100 μl kapsułki Eri (końcowe stężenia to 1, 2, 3, 4 i 5 μM) w temperaturze 37 °C przez kolejne 24 godziny. Dodać 120 μl/studzienkę kompletnej pożywki do grupy kontrolnej.
      UWAGA: CoCl2 wywołuje warunki niedotlenienia w komórkach.
    3. Zmierzyć absorbancję każdej próbki metodą MTT i obliczyć żywotność komórek zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej w krokach 2.4.2 i 2.4.3.
  6. Badania przesiewowe optymalnej kombinacji dwóch leków w oparciu o metodę projektowania jednorodnego
    UWAGA: Po uzyskaniu skutecznego zakresu stężeń kapsułki Astragalus do wstrzykiwań i breviscapus, zastosowano jednolitą metodę projektowania tabeli U7 (74) w celu uzyskania sześciu różnych kombinacji tych dwóch leków. Wtrysk Ast: kapsuła Eri: 1) 2:2,6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1,8 μM, 4) 8:4,2 μM, 5) 10:1 μM i 6) 12:3,4 μM.
    1. Hodować komórki, jak opisano powyżej w kroku 2.3.1, i traktować uszkodzone komórki PC12 sześcioma proporcjonalnymi stężeniami kapsułki Ast injection: Eri, jak wspomniano powyżej.
    2. Poddać je działaniu przez 24 godziny i obliczyć żywotność komórek, jak opisano wcześniej w krokach 2.4.2 i 2.4.3.
  7. Ocena ochronnego działania dwóch optymalnych kombinacji na uszkodzone komórki PC12
    UWAGA: Po uzyskaniu optymalnej kombinacji preparatów (wstrzyknięcie Ast: kapsułka Eri 6:1,8 μM) i optymalnej kombinacji składników7 (10 μM astragalozydu A, 40 μM scutellariny i 75 μM kwasu chlorogenowego), przeprowadza się dalszą ocenę w celu sprawdzenia ich ochronnego działania na uszkodzone komórki PC12.
    1. Hodować komórki, jak opisano powyżej w kroku 2.3.1, i traktować uszkodzone komórki PC12 dwoma rodzajami kombinacji leków, jak omówiono w UWAGA powyżej.
    2. Poddać je działaniu przez 24 godziny i obliczyć żywotność komórek, jak opisano wcześniej w krokach 2.4.2 i 2.4.3.

3. Test ANEKSIN V-FITC/PI dla szybkości apoptozy

  1. Umieścić komórki PC12 na 12-dołkowej płytce o stężeniu 1,3 x 105 komórek/basenik i hodować je w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  2. Pogrupuj komórki: grupa kontrolna, grupa modelowa i dwie kombinacje leków. Dodać 1,2 ml / studzienkę kompletnej pożywki do grupy kontrolnej, dodać 1,2 ml / basenik pożywki zawierającej 0,4 mM CoCl2 do grupy modelowej i dodać 1,2 ml / basenik każdej z dwóch kombinacji zawierających 0,4 mM CoCl2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 24 godziny.
  3. Po leczeniu farmakologicznym potraktuj komórki 250 μl trypsyny / basenik, przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwiruj przy 840 xg przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu wiążącego.
    1. Inkubować komórki w ciemności z 5 μl aneksyny V-FITC i 10 μl jodku propidyny (PI) przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie sprawdzić apoptozę za pomocą cytometrii przepływowej. Ustaw trzy studnie replikacji w każdej grupie.
      UWAGA: Trypsyna użyta w tym teście nie może zawierać EDTA, ponieważ EDTA jest czynnikiem chelatującym jony metali, który konkuruje z aneksyną V w celu wiązania jonów wapnia i wpływa na powinowactwo aneksyny do PI. Kiedy dochodzi do apoptozy, fosfoseryna, pierwotnie znajdująca się po wewnętrznej stronie błony komórkowej, obraca się na zewnątrz na powierzchnię komórki, a aneksyna V-FITC selektywnie wiąże się z fosfoseryną na zewnątrz błony, wykazując zieloną fluorescencję.
    2. Kliknij opcję Automatyczna kompensacja w menu Start, wybierz FITC, PE, PerCP i APC w polu Wybierz kanał, a następnie wybierz opcję Kompensacja na: Wysokość. Kliknij przycisk OK w pozycji statystycznej: Mediana. Korzystając z tej samej metody zliczania komórek, o której mowa w kroku 2.3.2, zbierz próbki komórek, kliknij mapę gęstości i zakreśl efektywną populację komórek.
    3. Z fluorescencją FITC jako parametrem osi X i innymi parametrami fluorescencji jako parametrem osi Y, utwórz mapę gęstości. Kliknij Macierz kompensacji w menu Start i Współczynnik w macierzy przepełnienia. Informacje z mapy zagęszczenia są wyświetlane w celu analizy szybkości apoptozy.

4. Immunofluorescencyjna detekcja generacji kaspazy-3

  1. Umieścić komórki PC12 na szkiełkach nakrywkowych o gęstości 8 x 104 komórki/szkiełko nakrywkowe i umieścić je na 24-dołkowych płytkach w temperaturze 37 °C na 24 godziny. Pogrupować komórki, jak wspomniano powyżej w kroku 3.2; ustawić trzy powtórzone szkiełka nakrywkowe dla każdej grupy.
  2. Po leczeniu farmakologicznym przepłukać szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS (37 °C) przez 5 minut każde, utrwalić je 4% paraformaldehydem przez 15 minut i przepuszczać 0,5% Triton X-100 przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Ponownie przepłucz komórki i zablokuj je 10% kozim surowicą przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować każde szkiełko nakrywkowe z 200 μl pierwszorzędowego przeciwciała kaspazy-3 (kluczowego białka wykonawczego apoptozy) rozcieńczonego w stężeniu 1:250 w 1x TBST, przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć 1x TBST (trzy razy po 3 minuty) i inkubować z 200 μl przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczenie 1:300 w 1x TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: Fluorescencja jest łatwo wygaszona; Tak więc, po inkubacji przeciwciała drugorzędowego, szkiełka należy trzymać z dala od światła. Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.
  5. Dodaj 300 μl DAPI (0,5 μg/ml) do szkiełek nakrywkowych (w celu wykrycia jąder) przez 10 minut i przemyj komórki trzykrotnie 1x TBST przez 5 minut każda.
  6. Obserwuj szkiełka nakrywkowe pod mikroskopem fluorescencyjnym i uchwyć obrazy10. Wykonaj analizę statystyczną intensywności fluorescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania.
    UWAGA: Używane szkiełka podstawowe i nakrywkowe powinny być czyste i sterylne. Podczas barwienia należy zwrócić uwagę na pH, stężenie i temperaturę roztworu barwiącego i unikać gaszenia fluorescencji. Mikroskop fluorescencyjny powinien być włączony co najmniej 15 minut wcześniej, aby podgrzać lampę rtęciową i wyłączony na 30 minut przed ponownym włączeniem. Podczas pozyskiwania obrazów parametry ekspozycji tego samego barwnika w tej samej partii eksperymentów powinny być spójne, aby zapewnić dokładność wyników.

5. Test immunofluorescencyjny poziomu ROS

  1. Hoduj i traktuj komórki zgodnie z opisem w kroku 4.1.
  2. Po leczeniu farmakologicznym przemyć każde szkiełko nakrywkowe trzykrotnie PBS przez 3 minuty i inkubować z 400 μl DCFH-DA (10 μM) w temperaturze 37 °C przez 20 min.
    UWAGA: DCFH-DA jest uniwersalnym wskaźnikiem stresu oksydacyjnego. Ma przepuszczalność błony komórkowej i brak fluorescencji. Po dostaniu się do komórki jest hydrolizowany przez esterazy w celu wytworzenia 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH), a następnie szybko utleniany w celu wytworzenia silnego produktu fluorescencyjnego.
  3. Ponownie przemyć komórki DMEM bez surowicy (dwa razy po 3 minuty) i natychmiast obserwować szkiełko nakrywkowe po dodaniu środka wygaszającego fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym. Oblicz względną intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania.
    UWAGA: Po załadowaniu sondy DCFH-DA należy wyczyścić sondę resztkową, która nie wchodzi do ogniwa, w przeciwnym razie tło stanie się wysokie.

6. Western blot wykrywanie ekspresji białek Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 i Bax11,12

  1. Inokulować komórki PC12 na płytkach 6-dołkowych o stężeniu 1 x 106 komórek/basenik i hodować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Grupować i traktować komórki, jak wspomniano w kroku 4.1, i ustawić trzy dostojniki kontrprób w każdej grupie.
  2. Po podaniu leku przez 24 godziny przemyć komórki trzykrotnie PBS przez 5 minut każde i inkubować na lodzie przez 30 minut w przygotowanym buforze do lizy. Po lizie odwirować komórki przez 20 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C, a następnie zebrać supernatanty.
  3. Wykryj stężenie białka i dostosuj zgodnie z instrukcjami za pomocą testu Bradforda. Rozcieńczyć próbki i poddać denaturacji w temperaturze 100 °C przez 10 min.
    UWAGA: Bufor do lizy składa się z inhibitora fosfatazy, inhibitora proteazy i lizatu RIPA w stosunku objętościowym 1:1:50. W grupie kontrolnej wymagane jest 200 μl / basenik buforu do lizy, a w pozostałych grupach wymagane jest 100 μl / studzienka buforu do lizy. Ogólnie rzecz biorąc, stężenia białek w grupach kontrolnych, modelowych i dwóch typach kombinacji wynoszą odpowiednio 0,45 mg / ml, 0,25 mg / ml i 0,32-0,39 mg / ml; ich stężenia białka po rozcieńczeniu buforem ładującym wynoszą odpowiednio 0,36, 0,2 i 0,256-0,312 mg/ml.
  4. Aby wykryć białka o różnej masie cząsteczkowej, załaduj 25 μg białka na każdym pasie, uruchom 12% elektroforezę SDS-PAGE i przenieś żel do membran PVDF.
    UWAGA: Podczas przygotowywania żelu SDS należy go całkowicie wymieszać bez pęcherzyków lub nierozpuszczalnych cząstek; W przeciwnym razie mogą wystąpić nierówne lub nieregularne pasma. Podczas przenoszenia membran upewnij się, że między membraną PVDF a żelem nie ma pęcherzyków; W przeciwnym razie na pasku pojawią się białe plamy. Ponadto krok ten należy wykonywać w niskich temperaturach, a worek z lodem należy wymieniać co 30 minut.
  5. Zablokować błony 5% mlekiem beztłuszczowym przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej i inkubować z 5 ml odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych (Nrf2 1:1,000, Akt 1:2,000, p-Akt 1:2,000, Bcl-2 1:5,000 i Bax 1:1,000) przez 24 godziny w temperaturze 4 °C. Stosować przeciwciało β-aktyny (1:5,000) jako kontrolę wewnętrzną.
  6. Przemyć błony TBST (trzy razy po 10 minut każda), a następnie inkubować z 5 ml drugorzędowych przeciwciał sprzężonych z HPR (1:5 000) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
    UWAGA: Stosunek rozcieńczenia przeciwciał nie powinien być arbitralnie zmieniany, a membrany powinny być myte TBST wystarczająco ściśle zgodnie z wymaganiami, aby uniknąć zbyt czarnego koloru tła opaski.
  7. Na koniec ponownie umyj membranę TBST i potraktuj ją chemiluminescencyjnym substratem HRP (zgodnie z instrukcjami producenta) w celu wykrycia prążków białkowych. Uchwyć obrazy za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego i określ ilościowo wartości szarości białek za pomocą oprogramowania do obrazowania, z β-aktyną jako porównawczą kontrolą wewnętrzną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Badanie przesiewowe optymalnej kombinacji wstrzyknięcia Ast i kapsułki Eri jest pokazane w Rysunek 1. Wskaźnik przeżycia komórek po wstrzyknięciu Ast i kapsułce Eri na normalnych komórkach PC12 jest pokazany w Rysunek 1A. Żywotność komórek była niższa niż 95% przy wstrzyknięciu Ast w stężeniach większych niż 12 μM (Figura 1A) i kapsułce Eri w stężeniach większych niż 5 μM (Figura 1A), co wskazuje, że maksymalne nietoksyczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

We współczesnej praktyce klinicznej nadal brakuje idealnych leków stosowanych w leczeniu niedokrwienia mózgu2. Pod kierunkiem suplementacji qi i aktywacji metody krążenia krwi, Ast, Eri i inne preparaty były stosowane w połączeniu w praktyce klinicznej TCM i osiągnęły dobre wszechstronne zalety 13,14,15. Duża liczba badań wykazała, że Ast może poprawić przepuszczalność bariery krew-mózg, zwiększyć przepły...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez kluczowe projekty badawczo-rozwojowe Departamentu Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (2020YFS0325).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II serii 1300Thermo Fisher Scientific Instruments Company1374
bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliumGuangzhou saiguo biotech Company1334GR001MTT
ACEA NovoExpress  1.4.0ACEA Biosciences,Inc-Akt
Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc10176-2-AP
Analityczna cytometria przepływowaThermo Fisher Scientific Instruments Company62-2-1810-1027-0
Zestaw do wykrywania apoptozy Annexin V-FITCBeyotime Biotechnology CompanyC1062L
Astragalus iniekcjaHeilongjiang Zhenbao Wyspiarska firma farmaceutycznaA03190612144Ast do wstrzykiwań
Astragaloside AChongqing Gao Ren Biotechnology Company84687-43-4
BaxWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc60267-1-Ig
Zestaw do oznaczania ilościowego białkaBCA Beyotime Biotechnology CompanyP0012
Bcl-2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc26593-1-AP
Inkubatory dwutlenku węglaThermo Fisher Scientific Instruments Company0816-2014
Caspase-3Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc19677-1-AP
Kwas chlorogenowyChongqing Gao Ren Biotechnology Company327-97-9
Sześciowodny chlorek kobaltuMerck Biotechnology, Inc.7791-13-1CoCl2
sulftlenek dimetyluGuangzhou saiguo biotech Company2020112701DMSO
Dwunastowodny wodorofosforan disodowyChengdu Kolon Chemical Company2020090101
DMEM o wysokiej zawartości cukruThermo scientific Hyclone2110050
DMEM podłoże bez cukruBeijing Solarbio firma zajmująca się naukami przyrodniczymi
Płyn świetlny ECLLianshuo Biological CompanyWBKLS0500
Waga elektronicznaHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Szanghaj, ChinyFA1204
Przyrząd do elektroforezyBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1658026
Kapsułka Erigeron breviscapusFirma farmaceutyczna Yunnan BioguZ53021671Kapsułka Eri
Surowica bydlęca płoduInżynierii Biologicznej20210402FBS
Mikroskop fluorescencyjnyOlympms CorporationIX71-F32PH
Obrazownik żelowyBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1708265
Przeciwciało wtórne przeciwko myszom KozaWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001-1
Drugorzędowe przeciwciało przeciw królikomz Wuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001- 2
IBM SPSS Statistics wersja 26.0International Business Machines Corporation, USA-ImageJ
1.8.0National Institutes of Health, USA-oprogramowaniedo obrazowania
Immunol  fluorescencja  zestaw do barwieniaBeyotime Biotechnology CompanyP0196
KClChengdu Kolon Chemical Company2021070901
MarkerThermo Fisher Scientific Instruments Company26616
Czytnik mikropłytekPerkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.
Motic Mikroskop odwróconyNanda Scientific Instruments Co.
NaClChengdu Kolon Chemical Company2014081301
Mleko beztłuszczoweBeyotime Biotechnology CompanyP0216
Nrf2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc16396-1-AP
P-AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66444-1-IG
PC12 komórkiChińska Akademia Nauk
Roztwór penicyliny i streptomycynyThermo scientific Mieszanina
hydroklonu Beyotime Biotechnology CompanyP1045
Diwodorofosforan potasuChengdu Kolon Chemical Company2015082901
Zestaw do oznaczania reaktywnych form tlenuFirmaBiotechnologiczna BeyotimeS0033S Roztwór
do lizy RI-PABeyotime Biotechnology CompanyP0013B
ScutellarinChongqing Gao Ren Biotechnology Company27740-01-8
Bufor do ładowania próbek SDS-PAGE, 5xBeyotime Biotechnology CompanyP0015L
Sterylne końcówki filtra (0,22 i mikro; m)Merck Biotechnology, Inc.
Firma biotechnologiczna Saiguoz siedzibą w Kantonie1115GR500 Tbs
TrypsinThermo naukowy J190013
Tween-20Chengdu Kolon Chemical Company2021051301
oscylator VortexOHAUS International Co., Ltd., Szanghaj, ChinyVXMNAL
β-aktynaWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66009-1-IG
2029548 Instytut HH35L2018296AE2000LEDCBP60430 inhibitorów proteazy fosfatazy SV30010 SLGP033RBhyklon

Bibliografia

  1. Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
  2. Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
  3. Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
  4. Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
  5. Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
  6. Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
  7. Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
  8. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924(2020).
  9. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592(2020).
  10. Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
  11. Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
  12. Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955(2021).
  13. Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
  14. Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
  15. Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
  16. Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
  17. Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
  18. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988(2022).
  19. Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
  20. Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164(2020).
  21. El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619(2019).
  22. Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
  23. Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
  24. Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678(2015).
  25. Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
  26. Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
  27. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
  28. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617(2021).
  29. Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

uszkodzenia oksydacyjneAstragalus mongholicusErigeron breviscapuskombinacja sk adnik wcytometria przep ywowaWestern blottest apoptozyszlak PI3K Akt Nrf2
Badanie strategii łączenia dwóch ziół w leczeniu uszkodzonych komórek PC12
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.