Tutaj prezentujemy uproszczony protokół endogennego znakowania genów dla Drosophila, który wykorzystuje technikę opartą na PCR do bezmarkerowej identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych, ułatwiając rozwój stabilnych linii knock-in.
Artykuł metodologiczny
Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie lokalizacji, dynamiki i regulacji subkomórkowej białek w żywych komórkach uległo głębokiej transformacji dzięki pojawieniu się technik, które pozwalają na znakowanie endogennych genów w celu produkcji fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Metody te umożliwiają naukowcom wizualizację zachowania białek w czasie rzeczywistym, dostarczając cennych informacji na temat ich funkcji i interakcji w środowisku komórkowym. Wiele obecnych badań nad znakowaniem genów wykorzystuje dwuetapowy proces, w którym widoczne markery, takie jak zmiany koloru oczu, są wykorzystywane do identyfikacji organizmów modyfikowanych genetycznie w pierwszym etapie, a widoczny marker jest wycinany w drugim etapie. W tym miejscu przedstawiamy jednoetapowy protokół do wykonywania precyzyjnego i szybkiego endogennego znakowania genów u Drosophila melanogaster, który umożliwia badania przesiewowe w kierunku zmodyfikowanych linii bez widocznego markera oka, oferując znaczną przewagę nad wcześniejszymi metodami. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem udanych zdarzeń znakowania genów, stosujemy technikę opartą na PCR do genotypowania poszczególnych muszek poprzez analizę małego segmentu z ich środkowej nogi. Muchy, które przejdą kryteria przesiewowe, są następnie wykorzystywane do produkcji stabilnych stad. W tym miejscu szczegółowo opisujemy projekt i budowę plazmidów do edycji CRISPR oraz metody badań przesiewowych i potwierdzania linii inżynieryjnych. Łącznie protokół ten znacznie poprawia skuteczność endogennego znakowania genów u Drosophila i umożliwia badania procesów komórkowych in vivo.
Wprowadzenie
Białka fluorescencyjne stały się potężnymi narzędziami do wizualizacji lokalizacji, dynamiki i interakcji białko-białko w komórkach w organizmach żywych1,2. Znakowanie endogennych genów białkami fluorescencyjnymi umożliwia długoterminowe obrazowanie procesów komórkowych na żywo z rozdzielczością subkomórkową. Co więcej, te endogenne techniki znakowania genów mają kilka zalet w porównaniu z metodami nadekspresji i barwienia immunologicznego. Na przykład nadekspresja białek może prowadzić do nieprawidłowego fałdowania białek, niespecyficznych interakcji białko-białko i błędnej lokalizacji3. Do tej pory naukowcom udało się stworzyć ogromne biblioteki endogennych genów połączonych z białkami fluorescencyjnymi dla kilku organizmów modelowych, takich jak pączkujące drożdże, które mogą ulegać wydajnej rekombinacji homologicznej4. W przypadku Drosophila melanogaster opracowano różne narzędzia, takie jak MiMICs5, transpozon-based enhancer traps6 i fosmids7 zostały opracowane do fluorescencyjnego oznaczania genów.
Rozwój narzędzi opartych na CRISPR-Cas9 umożliwił efektywne przeprowadzanie edycji genomu, w tym znakowanie białek endogennych, w szerokim zakresie organizmów modelowych8,9. Cas9 to enzym kierowany przez RNA, który rozszczepia dwuniciowe DNA w bardzo wydajny i specyficzny sposób8, który może być następnie naprawiony przez niehomologiczny szlak łączenia końców (NHEJ) prowadzący do mutacji punktowych lub delecji. Alternatywnie, szlak naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR) umożliwia integrację heterologicznego DNA z chromosomem.
Poprzednie metody znakowania genów w organizmie modelowym, Drosophila melanogaster, oparte na CRISPR, opierały się na dwuetapowym procesie10,11,12. Polega to na użyciu rozpoznawalnego markera koloru oczu, Dsred, do wykrywania udanych zdarzeń HDR. Następnie marker Dsred zostałby wycięty przy użyciu systemu rekombinacji Cre/loxP. Aby usprawnić i przyspieszyć ten proces, przedstawiamy tutaj prostszą i bardziej wydajną metodę. Takie podejście pozwala obejść potrzebę śmiertelnego genotypowania i pozwala na bezpośrednie badanie przesiewowe poszczególnych much. W szczególności stosujemy podejście oparte na PCR, aby wyekstrahować DNA z niewielkiego segmentu środkowej nogi muchy, co pozwala nam na genotypowanie poszczególnych much. Warto zauważyć, że procedura ta nie zagraża witalności, ruchowi ani zdolnościom reprodukcyjnym muchy, od której pobrano próbkę. Tylko odpowiednie osobniki, zidentyfikowane za pomocą tej metody, są dalej rozwijane w stabilne stada.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół generowania fluorescencyjnych muszek oznaczonych białkiem, w których endogenne geny są znakowane za pomocą fluorescencyjnych reporterów. Technika ta wykorzystuje edycję genomu CRISPR-Cas9 do fuzji dowolnego pożądanego znacznika fluoroforowego z N- lub C- końcem endogennego genu. Poniżej opisujemy projektowanie i budowę plazmidów gRNA i plazmidu dawcy, jednoetapową strategię badań przesiewowych w celu wyboru much CRISPR-dodatnich oraz kroki w celu ustalenia stabilnych linii. W szczególności opisujemy strategie znakowania endogennego genu Drosophila zegara rdzeniowego, kropka, za pomocą fluoroforu na C-końcu. Pokrótce opisujemy również eksperymenty kontrolne, które należy przeprowadzić, aby potwierdzić, że oznaczone białko jest funkcjonalne oraz techniki obrazowania na żywo w celu wizualizacji białka Period w żywych neuronach zegarowych w nienaruszonych mózgach Drosophila13. Opisany tutaj protokół ma również szerokie zastosowanie do kandydatów do badań przesiewowych pod kątem delecji i insercji określonych fragmentów DNA poprzez edycję genomu CRISPR-Cas9.
Protokół
1. Projektowanie i budowa odczynników do edycji genów
UWAGA: Aby przeprowadzić endogenne znakowanie, konieczne jest zidentyfikowanie różnych izoform pożądanego genu. W zależności od konkretnych celów eksperymentu, znacznik fluorescencyjny może być włączony wewnętrznie lub na końcach N lub C wybranej izoformy białka. Aby uzyskać optymalną edycję za pośrednictwem CRISPR, ważne jest, aby umieścić dwa sgRNA odpowiednio blisko zamierzonego miejsca wbicia. Następnie, aby umożliwić edycję poprzez rekombinację homologiczną, należy przygotować wektor dawcy obejmujący sekwencje homologiczne do genu docelowego, wraz ze znacznikiem fluorescencyjnym. Poniżej znajduje się przewodnik krok po kroku po tych procesach (Rysunek 1).
- Zaprojektuj sgRNA zgodnie z poniższym opisem.
- Zaprojektuj sgRNA dla Drosophila, korzystając z tych stron internetowych: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ lub http://www.flyrnai.org/crispr2/.
- W przypadku strony internetowej flycrispr wprowadź sekwencję ±100 pz otaczającą żądane miejsce knock-in (terminal N, terminal C lub dowolne interesujące nas locus genomowe). Jeśli używasz nos-Cas9 attP2 jako tła do wstrzyknięcia, wybierz opcję genomu Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). System Nos-Cas9 zapewnia ekspresję Cas9 specyficzną dla linii zarodkowej.
- Aby poprawić wydajność ekspresji sgRNA, wybierz cele CRISPR z opcją 5' G, ponieważ sgRNA, które zaczynają się od guaniny, zwiększą aktywność edycyjną. Następnie kliknij przycisk Znajdź cele CRISPR. Zostanie wyświetlona lista możliwych sekwencji sgRNA.
- Dla każdej sekwencji kliknij przycisk Oceń. Ta akcja sprawdza, czy dla każdej sekwencji nie ma potencjalnych celów wyłączonych na podstawie wcześniej wybranego genomu. Z podanej listy wybierz 2 sgRNA, które mają 0 poza celami. Upewnij się, że jeden sgRNA znajduje się w górę, a drugi w dół w stosunku do miejsca wprowadzenia. Idealnie byłoby, gdyby ich pozycje znajdowały się jak najbliżej miejsca wbicia (<200 pz), ale nie mogą się na siebie nakładać (Rysunek 2).
UWAGA: Czasami może być trudno znaleźć odpowiednie sgRNA dla danego genu docelowego. Odstęp między sgRNA a miejscem knock-in można zwiększyć do ± 200 pz. Użycie sgRNA, które nie inicjuje się G, może nieznacznie zmniejszyć dodatni wskaźnik.
- Wykonaj wybór znacznika fluorescencyjnego zgodnie z poniższym opisem.
- Znaczniki fluorescencyjne oferują różnorodny zakres cech, z których każda ma swoje unikalne zalety i wady1,2. Określając idealny znacznik fluorescencyjny do znakowania określonego białka, należy wziąć pod uwagę kluczowe kwestie opisane w poniższych krokach, które wchodzą w grę.
- Biorąc pod uwagę, że poziomy naturalnej ekspresji białek są zazwyczaj znacznie niższe niż te obserwowane w eksperymentach z nadekspresją1,2, zacznij od znaczników, które są jasne i fotostabilne i pasują do konfiguracji eksperymentalnej. Niektóre znaczniki fluorescencyjne, w szczególności niektóre RFP, takie jak tdTomato i DsRed, mają tendencję do tworzenia multimerów14 i mogą prowadzić do agregacji białek.
- Aby zwiększyć wszechstronność, połącz znaczniki epitopów (np. FLAG lub V5) z markerem fluorescencyjnym za pomocą elastycznego łącznika, który umożliwia analizy biochemiczne, takie jak Western Blot lub koimmunoprecypitacja.
- Aby zaprojektować konsolidator, wykonaj kroki opisane poniżej.
- Aby uzyskać optymalną funkcjonalność, upewnij się, że zarówno endogenne białko będące przedmiotem zainteresowania, jak i znacznik fluorescencyjny składają się oddzielnie do odpowiednich form funkcjonalnych. Aby to osiągnąć, użyj peptydu łącznikowego o długości od 2 do 20 aminokwasów. Na przykład umieść dwie reszty glicyny między ostatnim aminokwasem białka Period a pierwszym aminokwasem białka fluorescencyjnego mNeonGreen.
- Upewnij się, że te sekwencje peptydowe łącznikowe zawierają aminokwasy, takie jak glicyna i seryna, które nadają elastyczność strukturze15. Gwarantuje to, że naturalne zachowanie i lokalizacja endogennego białka pozostają niezmienione.
- Zaprojektuj wektor dawcy zgodnie z poniższym opisem.
UWAGA: Wektor dawcy wprowadza znacznik fluorescencyjny do pożądanej lokalizacji endogennej poprzez proces naprawy kierowanej homologią, który jest inicjowany przez rozszczepienie CRISPR. W związku z tym, oprócz znacznika fluorescencyjnego, wektor dawcy musi posiadać sekwencje, które są homologiczne po obu stronach znacznika.- Rozpocznij projektowanie wektora dawcy od uporządkowania sekwencji DNA peptydu łącznikowego i znacznika fluorescencyjnego i upewnij się, że istnieją sekwencje homologiczne po obu końcach (ramiona homologiczne). Aby uzyskać optymalne wyniki, upewnij się, że ramiona homologii obejmują co najmniej 800 nukleotydów po każdej stronie zamierzonego miejsca wbicia (Rysunek 2).
UWAGA: Ostatnie doniesienia sugerują, że ramiona homologii mogą być krótsze (100-200 pz)16. - Upewnij się, że wszystkie sekwencje PAM w plazmidzie dawcy są zmodyfikowane w taki sposób, aby sekwencja aminokwasowa otrzymanego białka pozostała niezmieniona. Jeśli sekwencja PAM znajduje się w UTR, usuń ją całkowicie.
- Położenie kodonu START i STOP zależy od lokalizacji znacznika. W przypadku znakowania wewnętrznego upewnij się, że znacznik fluorescencyjny znajduje się w ramce z sekwencją kodującą docelowego genu. W przypadku znakowania N-końcami umieść znacznik fluorescencyjny przed endogennym kodonem startowym. W przypadku znakowania C-końca należy umieścić znacznik fluorescencyjny przed naturalnym kodonem stop i upewnić się, że zachowałeś tylko jeden kodon startowy, aby uniknąć potencjalnych problemów z translacją.
- Rozpocznij projektowanie wektora dawcy od uporządkowania sekwencji DNA peptydu łącznikowego i znacznika fluorescencyjnego i upewnij się, że istnieją sekwencje homologiczne po obu końcach (ramiona homologiczne). Aby uzyskać optymalne wyniki, upewnij się, że ramiona homologii obejmują co najmniej 800 nukleotydów po każdej stronie zamierzonego miejsca wbicia (Rysunek 2).
- Zsyntetyzuj sgRNA i plazmidy dawcy, jak opisano poniżej.
- W celu tworzenia plazmidu sgRNA postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi klonowania U6-gRNA, które można znaleźć pod adresem flycrispr.org/protocols/grna/. Zastosuj alternatywne podejście do klonowania oparte na enzymach restrykcyjnych (określane jako strategia C w dostarczonym zasobie), aby wstawić sekwencję gRNA do plazmidu pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).
- Przekształć się w DH5a E. coli (NEB, C2987H) zgodnie ze standardowymi protokołami transformacji dostarczonymi przez producenta. W celu weryfikacji należy przeprowadzić sekwencjonowanie Sangera na powstałych klonach przy użyciu standardowych starterów sekwencjonowania T3 lub T7.
- Aby stworzyć plazmid dawcy, należy pozyskać dwuniciowe DNA z pożądaną sekwencją dawcy od dostawców komercyjnych (np. IDT). Zintegruj go z witryną wielokrotnego klonowania pBlueScriptII SK(-). Zsekwencjonuj plazmid dawcy, aby upewnić się, że sekwencje sgRNA lub PAM są prawidłowo zmodyfikowane i nie ma SNP obecnych w plazmidzie.
UWAGA: Alternatywą dla integracji za pomocą pBlueScriptII jest oddzielne PCR ramion homologicznych i segmentów znaczników fluorescencyjnych i skonsolidowanie ich w sieci szkieletowej przy użyciu technik takich jak Golden Gate Assembly lub Gibson Assembly.
- Użyj następującego schematu iniekcji i krzyżowania.
- Aby pozyskać muchy z edytowaną linią zarodkową, należy jednocześnie wstrzyknąć plazmidy gRNA i plazmid dawcy do odpowiedniego tła Cas9 (np. nos-Cas9 III, BDSC 78782). Jeśli korzystasz z komercyjnych usług iniekcji, postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy, aby wykonać przygotowanie plazmidu.
UWAGA: Zazwyczaj stężenie plazmidu gRNA powinno przekraczać 0,5 μg/μL, a stężenie plazmidu dawcy powinno wynosić powyżej 1,0 μg/μL. Typowy czas od wysłania próbek plazmidu do otrzymania wstrzykniętych zarodków wynosi około 2 tygodnie. Przedstawiono tutaj strategię badań przesiewowych pod kątem zdarzeń edycji genów na chromosomie X z wykorzystaniem szczepu równoważącego FM7/L. W przypadku genów na drugim lub trzecim chromosomie należy zastosować odpowiednie szczepy równoważące. - W przypadku pobierania wstrzykniętych much (G0) należy znieczulić dwutlenkiem węgla i oddzielić samce much i dziewicze samice. Ustanów krzyżówki much, łącząc każdego samca G0 z co najmniej dwiema dziewiczymi samicami FM7/L w indywidualnych wąskich fiolkach z pokarmem CT. Umieść skrzyżowane fiolki w wentylowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 25°C i wilgotności ~60%, aż F1 odleci (FM7/L jest najczęściej stosowanym równoważnikiem chromosomu X). Podobnie sparuj każdą samicę G0 z samcem FM7 / Y.
- Znieczulij i zbierz co najmniej 10 dziewiczych żeńskich potomstwa (F1) zarówno z krzyżówek męskich, jak i żeńskich G0. Z krzyżówek żeńskich G0 zbierz co najmniej 10 samców much F1 (Rysunek 3A). Upewnij się, że każda mucha F1 jest oznaczona szczegółami jej pochodzenia i przechowywana oddzielnie. Przejdź do etapu kontroli przesiewowej.
- Aby pozyskać muchy z edytowaną linią zarodkową, należy jednocześnie wstrzyknąć plazmidy gRNA i plazmid dawcy do odpowiedniego tła Cas9 (np. nos-Cas9 III, BDSC 78782). Jeśli korzystasz z komercyjnych usług iniekcji, postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy, aby wykonać przygotowanie plazmidu.
- Użyj następującego protokołu PCR na jednej nodze.
- Tworzenie starterów: Zaprojektuj parę starterów obejmującą miejsce edycji docelowego genu. Idealnie, temperatury topnienia podkładów powinny być podobne, około 55°C.
- Przygotowanie buforu do lizy: Przygotować 10 μl buforu do lizy dla każdej próbki muchy. Bufor składa się z 10 mM Tris (pH 8,2), 1 mM EDTA (pH 8,0), 25 mM NaCl i 400 μg/ml proteinazy K. Przygotuj bufor do lizy jako mieszankę główną, a następnie rozprowadź 10 μl w każdym dołku 96-dołkowej płytki PCR. Upewnij się, że bufor pozostaje zimny przez cały proces rozwarstwiania nóg (Rysunek 3B).
- Konfiguracja probówki: Przygotuj szklane rurki kapilarne, wypełniając jeden koniec pokarmem z sacharozą i agarem (2% agaru i 4% sacharozy) i umieść je w 96-dołkowej płytce z głęboką studnią, która będzie określana jako hotel muchowy (Rysunek 3C).
- Rozwarstwienie nóg: Umieść podkładkę znieczulającą z dwutlenkiem węgla pod mikroskopem stereoskopowym, znieczul jedną kandydatkę na muchę i odetnij jedną ze środkowych nóg. Umieść nogę w buforze do lizy, zapewniając całkowite zanurzenie. Nie ma potrzeby maceracji nogi, należy bezpośrednio przejść do etapu protokołu lizy (Rysunek 3B). Przytrzymaj skrzydło muchy parą cienkich metalowych kleszczy, przenieś muchę do hotelu muchowego i natychmiast uszczelnij rurkę przędzą.
- Próbki kontrolne: Dwie muchy typu dzikiego mogą być wykorzystane jako kontrole ujemne zgodnie z tą samą procedurą preparacji nóg. Rozcieńczony plazmid dawcy służy jako kontrola pozytywna.
- Opieka po sekcji: Umieść hotel muchowy w wentylowanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 25 °C i wilgotności ~60%. Chociaż muchy mogą przetrwać noc, zaleca się wykonanie kolejnych kroków i krycie w ciągu tego samego dnia.
- Protokół lizy: Umieścić odcięte nogi w roztworze buforowym do lizy w termocyklerze ustawionym na 37 °C na 90 minut, następnie w temperaturze 95 °C na 5 minut, a na koniec w temperaturze 4 °C. Pozwoli to na wyekstrahowanie wystarczającej ilości DNA z pojedynczej nogi każdej muchy (Ryc. 3B).
- Reakcja PCR: Zorganizuj reakcję PCR zgodnie z instrukcją producenta, wykorzystując 1,5 μl lizatu z nóg muchy jako źródło DNA.
- Elektroforeza żelowa: Poddaj produkty PCR elektroforezie w żelu agarozowym. Zinterpretuj wyniki z żelu na podstawie rozmiaru pasma. Zazwyczaj muchy z kontrolą ujemną wykazują niższy prążek, a dodatnie kontrole plazmidowe wykazują wyższy pasek. Upewnij się, że określone rozmiary pasm są zgodne z oryginalnym projektem plazmidu dawcy. Samice much dodatnich będą miały dwa prążki, ponieważ są heterozygotyczne, a samce dodatnie będą prezentować pojedyncze prążki (Rysunek 3B).
UWAGA: Zazwyczaj w ciągu jednego dnia udaje się przebadać 70 much. Upewnij się, że zidentyfikowałeś co najmniej 10 dodatnich much F1 w 4 do 5 różnych krzyżówkach G0, ponieważ niektóre F1 mogą być bezpłodne z powodu mutacji poza celem.
- Przeprowadź następującą konfigurację krzyżową po PCR.
- Na podstawie wyników żelu wybierz dodatnie muszki z hotelu dla much i indywidualnie skrzyżuj je z muchami równoważącymi (FM7 / L do znakowania genów chromosomu X), aby wytworzyć pokolenie F2. Gdy pojawi się pokolenie F2, ustal krzyżówki rodzeństwa, aby stworzyć homozygotyczne stabilne stada (Rysunek 3D).
- Użyj homozygotycznych kolb do sekwencjonowania Sangera w miejscu edycji, aby zapewnić dokładność. Zweryfikowane przez krzyżowanie wsteczne linie muchowe z muchami typu dzikiego w celu usunięcia mutacji tła. Badanie przesiewowe każdej generacji przy użyciu protokołu PCR na jednej nodze.
Wyniki
W naszych eksperymentach zazwyczaj wykazywaliśmy wskaźnik sukcesu na poziomie ~20%-30% w badaniach przesiewowych dla różnych endogennych genów oznaczonych na wszystkich chromosomach (X, II, III). Wydajność tego procesu może się różnić w zależności od kilku czynników, takich jak selekcja gRNA, charakter genu i jakość wstrzyknięcia. Tutaj ilustrujemy wyniki naszej strategii oznaczania endogennego genu okresu za pomocą mNeonGreen fluorophore13. Gen menstruacyjny, umieszczony na chromosomie X D. melanogaster, odgrywa kluczową rolę w zegarze okołodobowym. Drosophila ma dobrze scharakteryzowaną sieć zegarową składającą się z około 150 neuronów zegarowych, które wyrażają białka zegarowe17.
Oznaczyliśmy białko Period zielonym białkiem fluorescencyjnym mNeonGreen na jego C-końcowym końcu, połączonym łącznikiem z podwójną glicyną13. Po wstrzyknięciu plazmidu skrzyżowaliśmy muchy G0 z balanserem FM7/L, a następnie zebraliśmy pokolenie F1. Spośród 126 much F1 przebadanych przy użyciu specjalistycznych starterów PCR (Tabela 1), zidentyfikowaliśmy 47 pozytywnych przypadków, co dało 37,3% wskaźnik sukcesu. Spośród nich wybraliśmy 5 osobników F1, aby założyć dodatkowe krzyżówki w celu uzyskania stabilnych stad. Płeć nie miała wpływu na odsetek pozytywnych wyników podczas tego badania przesiewowego. Po zweryfikowaniu dokładności sekwencji znakowanego genu przeprowadziliśmy testy kontrolne, w tym oceny behawioralne i oceny qPCR, aby zapewnić oscylacje mRNA w celu potwierdzenia funkcjonalności znakowanego białka (PERIOD-mNeonGreen)13.
Aby przeprowadzić eksperymenty z obrazowaniem na żywo, skrzyżowaliśmy te muchy PERIOD-mNeonGreen z Clock856-GAL4; UAS-CD4-tdMucha pomidorowa, gdzie Clock856-GAL4 oznacza wszystkie neurony zegarowe19, a CD4 to białko transbłonowe, które znakuje błony komórkowe. W eksperymentach obrazowania na żywo przeprowadziliśmy sekcję 3-4 dorosłych mózgów za pomocą lodowatego podłoża Drosophila Schneidera. Mózgi zostały zamontowane i zobrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego Airyscan. Rysunek 4 pokazuje reprezentatywne obrazy przedstawiające białko PERIOD w neuronach zegarowych w mózgach Drosophila.
Rysunek 1: Schemat protokołu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9. Protokół przedstawia szereg kroków mających na celu zaprojektowanie i złożenie sgRNA i plazmidów dawcy, a następnie badanie przesiewowe metodą PCR na jednej nodze i produkcję stabilnych linii inżynieryjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Schemat edycji genomu CRISPR/Cas9 w celu wygenerowania muchek period-mNeonGreen. (A) Schemat ilustrujący dodanie znacznika białka fluorescencyjnego do C-końca endogennego genu. (B) Gen okresu endogennego (per) jest znakowany mNeonGreen, jasnym, monomerycznym zielonym białkiem fluorescencyjnym na końcu karboksylowym. Dwa sgRNA znajdują się odpowiednio w ostatnim eksonie i 3'UTR. Wektor donorowy zawiera dwie sekwencje homologii ~1 kb flankujące znacznik mNeonGreen. Kodon stop jest dodawany na końcu znacznika w celu prawidłowego zakończenia tłumaczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Strategia badania przesiewowego muszek z pozytywnym wynikiem CRISPR. (A) Podejście do wstępnego badania krzyżówek genetycznych dla genów przeznaczonych do znakowania CRISPR na chromosomach X i II. G0 oznacza muchy, którym wstrzyknięto początkowo wstrzyknięcie, podczas gdy F1 reprezentuje ich potomstwo w pierwszym pokoleniu, które wymaga badań przesiewowych. (B) Przedstawiono metodę przesiewową PCR na jednym odcinku oraz czas trwania każdego etapu procedury. (C) Pokazane tutaj jest zdjęcie Fly Hotelu. Szklane rurki są wypełnione pokarmem na muchy i uszczelnione na jednym końcu. Pojedyncze muchy są ładowane do pojedynczych rurek. Po przebadaniu DNA wyekstrahowanego ze środkowej diody poszczególnych much, odpowiednie muchy są pobierane z hotelu dla much i ustalane są stabilne linie. (D) Podejście polegające na ustawieniu krzyżówek po kontroli przesiewowej much (pokazanych tutaj na niebiesko), które przeszły test przesiewowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy białka PERIOD-mNeonGreen w neuronach zegarowych. Reprezentatywne zdjęcia z okresu-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdMuchy pomidorowe porwane do cykli Światło-Ciemność. ZT odnosi się do czasu Zeitgeber, a ZT0 odnosi się do czasu włączenia świateł, a ZT12 odnosi się do czasu wyłączenia świateł. Otoczka jądrowa neuronu zegarowego jest oznaczona tdTomato, pokazanym tutaj na czerwono, a białko PERIOD jest oznaczone mNeonGreen i pokazane na zielono. Białko PERIOD jest zorganizowane w dyskretne ogniska jądrowe w późnych godzinach nocnych i wczesnoporannych. Podziałka skali, 1 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
| nazwa | Sekwencja DNA (od 5 'do 3') |
| Elementarz przesiewowy z okresu do przodu | ATACTCGTCCATAGACCACG |
| Rewers podkładu do badań przesiewowych okresowych | ACATTATCCTCGGCTTGCAT |
| per-gRNA1-sense | cttcACCAGACACAGCACGGAT |
| per-gRNA1-antysens | aaacATCCCCGTGCTGTGTCTGGT |
| per-gRNA2-sense | cttcGTCAGCAGCAACTGCGGGTG powiedział: |
| per-gRNA2-antysens | aaacCACCCGCAGTTGCTGCTGAC powiedział: |
| ramiona homologii okresu i wstawka mNeonGreen | GAATTCCAAGCTGCTCATCCTGCCCATTGTCAGCAA GGGCGACCTGACCATTCGGGGTTGAACGATGTGCACA CAAAGGTTTGGATTACCGCCGAGCCAGTGAAGCGC TCCGATGGCCACACCTATCTCAACATCACCGACTAC AAGACGGCCACCAAGATCAAGGGgtgagcatggcctgcat gtctagccaactgaatggtgacctcaaacctcttctcgtagTGGCCACT TTGACCTGTCGAATCTTCAACGAACAAGGAGC GCGCGACAGCACGCTGAAGGTGCTGAACCAGGAGT GGAGCACCCTGGCCCTCGATGTCCAGCCGAAGATC AACGAGGTGCGCCAAGGCCTTCAGTGCCATCGT ACAGAGTGTGGGCCAACATTCCCTACGACGAGTT CTTCGAAAAGGAATGAACGCATATGTATCTAACAAAGT CCGGTCTAACTAGCCACTCTAATTACTGATTAAA CTACCTAATTGCAGCTAAATCCAATCCATCTTCGATTAA AACAACTACTACAAGTGTTGGCGTTGGCTTTTCGATAT TTATTGTACAATAATAACTAAAAAAGATTCGGATATATA AACCTTAGGGCTGAGAAGGGTGGTTCGATGTTCGAAC CCTCTCTAGTTTTCAATTCACTTAATCTGATTAAACAT AGGATAGATATCATCTAAAAGCTGCTTGGCTTGAGAT CTACATTATCCTCGGCTTGCATGGGTTCTGGGCATCCTT CCACGTCAGTTCGTCTGATGCTCTTCTCTCTTTCTCGGA TACTGAATGGTGACATCCCACGGAAGCGTTCGCGTTGAT TCGAAGAActtgaaggaaggaagggagttaggaataggaactggtgg gactggctggtactcggtgcccagaccggaggcaattgctcactcca GGACCCTGCTGCTCCTCGGTGTCTGCTGCTCGGATCATCATC CCAGGGATCGACATTGTGCACTCGGTTGTGTACGTCGGT CAGCAGCAACTGCGGGTGTCATTACTTACAGTTCGTGT CCATACCCATGACATCGGTGAAAGCTTTTTGCCATTCTT TGAAATTCAGCTCTGTTTTCGAGTGCTTCAGTTCGGTTT TTCGAAAGACATACATCGGGGTTGGTTGGATAGTTAG CCGCCATCGGCTTGGCAAAAGTGTACGTTTCGCGCT GTGGAGCGATACCTTTTTCCATTTCCTGTTGTATAGGAC CATTTGAAAGTGGAAATAATCTTATCATTGGGGTAG GTCTTTTTGCTGCGGCACCAGTCAGCGGCAGTGAGC GAATTTGTCATAACTGGGCCATCAGCGGAAACCCG TTCCCTTGACTTGGGCTTCGCCTTTAATATGGCTACCT TCGTAAGTACCGATAGTTCACCGTGAGCGAGGCTC CGTCTTCAAATTGCATTGTTCGATGCACCTGGTAGCCC GAGCCATCTACCATCGCGGCTTGGAAGGGCGACATGC CATCTGGATACGGCAAATACTGATGGAATCCGTAACCG ATGTGTGGAACCAGGATCCAAGGGGAAAATTGGAGAT CGCCTTTAGTCGATTTCAGATTGAGCTCTTCGTAGCC GTCGTTGGGGTTTCCCGTACCCTGTGACCATATC GAAGTCGACTCCATTGATCGAACCAAAGATATGCAG CTCGTGTGTAGCCGGCAACGAAGCCATATTATCTTC TTCACCCTTCGACACACCTCCGCCGTCGCCGTGCTGCT GTGTCTGGTCCTCCTCCGGGTGCTCCATCTTGC TCTCAGATGTGCTCATGCTctgcaaaagaacggaaatggatta cattgaatcgcatcgtggactgtacgtacacCTTCAGCTTTCGG TGCTTGGGGTCCTTTTCGGTGTGTCCGGCGGACTCTC CGATCCGTCCGTGGTCTTGATGAAGGACGAGTAGA AGGAGAAGCTGGAGCCATCCATGTCGTCGCTA TTCCCATTGCTGTCCGTGTATTTctgtggatgagaccatgttc ttcataatgaccaatcaccaatggacctcattcgtatagcatacCTTGTT GTTGGCGGGATTGCTGCTGCTGCAGGGCGGGTGT GAGTTGTAGTCGCCCATCACGGAGGGAATGGGCGA GGAGTCCGGCACCTCCTTCTTGCAGGGATCGGATA CCGCTGCACTGGAGCCCCCCTCCGTCTTGACGGA TGCGCTCTGCGAGGGACGCTGCACCTGGGC AGGAGTGGTGACCGAGTGGAATGCACCCGGCACC TTCTTCGTCATGGACGCCGGCGTGGTctatggacgagta tggagttggagttggagttaagacagttcggtgaggcaccaccaccccactg acttacCGTGTACACCGACTTGTTGTACGCGGATTGGG AGCCCAACGGACGTTCGGGAATCTGGAGAGCGTTG GCCATTCCCGGAAAGGGCATCGGCTGGTACATCAT GGCCGTGGGCGGGCCGCCGGGTGTGTGTAG AAAAGCGAAGGATGCGGGTACATCACGCCGGCCAT GTACTGCAGCGGCATGGCCTGGGCGGGGGGCGGCA GCCGCCTGCTGCGAGGTGGTGGGCATGTCCGTGC CACCCTTGTGCGGATGCTTGTGCATCCGGGGAGAG CGCGTGGGACTGGTGGGCGTCAAGGAGGCGGGGA TGTAGTAGAAGGTCGGGAAGGGGGGGGGGGGGAGGA GAAGCTGCTGGGCCATGGCCGTGTGCGGGGGG TGAACGGGCGGTGTGATGCCCACCGAGAACGGTG GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA powiedział: |
Tabela 1: Lista sekwencji sgRNA do oznaczania endogennego genu okresu na końcu C oraz starterów używanych do przeprowadzania badań przesiewowych PCR na jednej nodze.
Dyskusja
Wyniki pokazują uproszczoną, prostą, jednoetapową strategię znakowania endogennych genów u Drosophila, opartą na CRISPR. W protokole używamy dwóch gRNA, aby skuteczniej indukować pękanie podwójnej nici DNA i rekombinację homologiczną. GRNA i plazmid dawcy są wstrzykiwane do zarodków muszek owocowych, które wyrażają enzym Cas9 w swojej linii zarodkowej. Zarodki te są następnie hodowane w standardowych warunkach aż do osiągnięcia dorosłości, kiedy to są krzyżowane z muchami równoważącymi w celu uzyskania potomstwa pierwszego pokolenia (F1). Genotypowanie PCR przeprowadza się na środkowej nodze każdej próbki F1 w celu przeprowadzenia badań przesiewowych na obecność genetycznie zmodyfikowanych much. Metoda ta zapewnia znaczną przewagę nad obecnymi metodami badań przesiewowych, które wykorzystują dwa etapy badań przesiewowych, z których pierwszy polega na użyciu widocznego markera, takiego jak kolor oczu, w celu zidentyfikowania odpowiedniego genotypu, a drugi etap polega na usunięciu markera koloru oczu10. W tym miejscu przedstawiamy metodę wykorzystującą PCR na DNA wyekstrahowanym z małego segmentu środkowej nogi pojedynczej muchy, co pozwala na nieśmiertelne genotypowanie poszczególnych much, oferując bardziej wydajną i opłacalną alternatywę dla istniejących metod. Metoda ta umożliwia badania przesiewowe zwierząt kandydujących pojedynczo lub partiami, aż do wyizolowania odpowiedniego genotypu. Liczba zwierząt poddawanych badaniom przesiewowym przed wyizolowaniem odpowiednich stad różni się w zależności od eksperymentu, w zależności od wielu czynników, w tym skuteczności wybranych sgRNA, skuteczności wstrzyknięcia, insercji poza celem, które mogą wpływać na żywotność. Alternatywnie, DNA z pojedynczych skrzydeł pojedynczych much może być również wykorzystane do celów genotypowania18.
Możliwe jest, że dodanie znacznika do N- lub C-końca genu może niekorzystnie wpłynąć na funkcję genu, co może potencjalnie wpłynąć na żywotność muszek. Jeśli dostępne są informacje o strukturze białka, można je wykorzystać do określenia, czy znakowanie N- lub C-końcowych może lepiej zachować funkcję i lokalizację natywnego białka. Zawsze zaleca się przeprowadzanie eksperymentów kontrolnych, w tym testowanie, czy znakowane białko wykazuje podobny wzorzec lokalizacji jak białko typu dzikiego za pomocą metod barwienia przeciwciał. Ta sama strategia badań przesiewowych może być stosowana do badań przesiewowych innych rodzajów insercji lub delecji genetycznych opartych na CRISPR. Podsumowując, jednoetapowa strategia badań przesiewowych znacznie ułatwia generowanie much edytowanych przez CRISPR i otwiera wiele możliwości badania subkomórkowej lokalizacji i dynamiki endogennych genów w ich naturalnym kontekście.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy George'owi Watase i Josie Clowney za dyskusje podczas początkowych etapów rozwoju protokołu. Prace były wspierane przez fundusze z NIH (grant nr R35GM133737 dla S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (dla S. Y.) i McKnight Scholar Award (dla S. Y.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA pH 8,0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alfa Kompetentny E. coli ( Wysoka wydajność) | NEB | C2987H | |
| 96-dołkowa płytka głębinowa | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sacharoza | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Kwas solny | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinaza K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Chlorek | soduLigaza DNA Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
Bibliografia
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068(2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539(2019).
- Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
- Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118(2021).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
- Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077(2022).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
- Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
- Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie