Ten protokół opisuje izolację makrofagów śródmiąższowych płuc (IM) i ich adoptywny transfer po stymulacji pęcherzyków płucnych przez IL-33 w modelu mysim, co może ułatwić badanie in vivo idiopatycznego zwłóknienia płuc (IPF).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 do modeli mysich indukowanych bleomycyną w celu zbadania ich wpływu na idiopatyczne zwłóknienie płuc in vivo
* These authors contributed equally
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Reakcja zapalna spowodowana wczesnym uszkodzeniem płuc jest jedną z ważnych przyczyn rozwoju idiopatycznego zwłóknienia płuc (IPF), któremu towarzyszy aktywacja komórek zapalnych, takich jak makrofagi i neutrofile, a także uwolnienie czynników zapalnych, w tym TNF-α, IL-1β i IL-6. Wiadomo, że wczesne zapalenie wywołane przez aktywowane makrofagi śródmiąższowe płuc (IM) w odpowiedzi na stymulację IL-33 odgrywa istotną rolę w patologicznym procesie IPF. Protokół ten opisuje adoptywny transfer IM stymulowanych przez IL-33 do płuc myszy w celu zbadania rozwoju IPF. Obejmuje izolację i hodowlę pierwotnych IM z płuc myszy gospodarza, a następnie adoptywny transfer stymulowanych IM do pęcherzyków płucnych myszy biorców IPF wywołanych bleomycyną (BLM) (które zostały wcześniej pozbawione makrofagów pęcherzykowych przez leczenie liposomami klodronianu) oraz patologiczną ocenę tych myszy. Reprezentatywne wyniki pokazują, że adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 pogarsza zwłóknienie płuc u myszy, co sugeruje, że ustanowienie eksperymentu adoptywnego transferu makrofagów jest dobrym technicznym środkiem do badania patologii IPF.
Wprowadzenie
Idiopatyczne zwłóknienie płuc (IPF) jest rozlaną chorobą zapalną płuc spowodowaną wieloma czynnikami1. W mikrośrodowisku cytokin odpowiedzi immunologicznej Th1 i Th2 makrofagi mogą być spolaryzowane na klasycznie aktywowane makrofagi (M1) i alternatywnie aktywowane makrofagi (M2). Lipopolisacharydy (LPS) lub cytokina IFN-γ indukują makrofagi M1 do polaryzacji i produkcji cytokin prozapalnych, w tym iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α i IL-12. W przeciwieństwie do tego, cytokiny typu II IL-4 i IL-13 napędzają polaryzację makrofagów M2, które mogą wytwarzać różne czynniki promujące wzrost fibroblastów, takie jak TGF-β i PDGF, które sprzyjają zwłóknieniu płuc 2. Patologicznemu procesowi IPF towarzyszy aktywacja i infiltracja makrofagów. IPF pośredniczy w naprawie urazów, stanach zapalnych i zwłóknieniach poprzez uwalnianie cytokin3. Ponieważ dostępne są tylko ograniczone opcje terapeutyczne, badanie molekularnych mechanizmów patologicznych IPF ma ogromne znaczenie dla opracowania nowych strategii zapobiegania i leczenia IPF. Poprzednie badania przeprowadzone przez naszą grupę i innych badaczy4,5 potwierdziły zwiększone uwalnianie IL-33 u pacjentów z IPF oraz w modelach mysich z IPF indukowanym przez bleomycynę (BLM). IL-33 jest uwalniana przez komórki nabłonka i śródbłonka podczas zwłóknienia i bierze udział w aktywacji makrofagów, co skutkuje nieprawidłową proliferacją fibroblastów, infiltracją leukocytów i ostateczną utratą funkcji płuc5. Obecny protokół opisuje adoptywny transfer makrofagów śródmiąższowych (IM) stymulowanych przez IL-33 do pęcherzyków płucnych jako sposób na badanie rozwoju IPF w modelach mysich. W tym przypadku IM wyizolowano z tkanki płucnej myszy gospodarza, wyhodowano in vitro, stymulowano IL-33 przez 24 godziny, a następnie adoptywnie przeniesiono do pęcherzyków płucnych myszy biorców przez wstrzyknięcie tchawicy. Stwierdzono, że bezpośrednie zbieranie stymulowanych makrofagów myszy i ich adoptywny transfer do pęcherzyków płucnych biorcy pogarsza stopień zwłóknienia płuc i może wyraźniej zilustrować wpływ czynników stymulujących na zwłóknienie w porównaniu z poprzednimi badaniami6. Technika opisana w tym artykule może umożliwić naukowcom zbadanie funkcji makrofagów stymulowanych przez potencjalne cytokiny w rozwoju IPF.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Jiangnan (JN No. 20211130m1720615[501]).
UWAGA: W sumie w tym badaniu wykorzystano 10 samców myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni i wadze 20-25 g. Trzy grupy eksperymentalne w badaniu obejmowały po trzy myszy biorców, a do izolacji IM wykorzystano jedną mysz gospodarza.
1. Zubożenie mysich makrofagów płucnych
- Wyjmij fiolkę z liposomami klodronianu (patrz tabela materiałów) z lodówki 30 minut wcześniej, podgrzej ją do temperatury pokojowej i kilkakrotnie odwróć, aby zapewnić równomierne wymieszanie.
UWAGA: Liposomy klodronianu otaczają hydrofilowe cząsteczki dichlorometylenobisfosfonianu. Kiedy te liposomy są konsumowane przez makrofagi, klodronian jest stopniowo uwalniany przez działanie fosfatazy lizosomowej, a jego akumulacja w konsekwencji wyzwala apoptozę komórek i wyczerpanie makrofagów7. - Znieczulij myszy 3% izofluranem. Sprawdź głębokość znieczulenia, szczypiąc jedną stopę, aby sprawdzić przytomność. Nałóż maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.
- Odessać 60 μl liposomów klodronianu za pomocą pipety ze sterylną końcówką ssącą. Podawać lek kroplami do jamy nosowej znieczulonej myszy, tak aby podczas wdychania myszy lek był wdychany do tchawicy. Po każdej kropli upewnij się, że mysz całkowicie wdycha lek i oddycha równomiernie. Podawaj liposomy zawierające sam PBS jako kontrolę8 (Rysunek 2).
- Umieść myszy na stole o stałej temperaturze 38 °C w celu ponownego rozgrzania, aby przyspieszyć ich regenerację. Monitoruj myszy, aż się obudzą. Gdy myszy dobrze się zregenerują i osiągną pozycję leżącą mostka, przenieś je do klatki.
- Do eksperymentu transferowego należy użyć myszy ze zubożonymi makrofagami pęcherzykowymi 2 dni po leczeniu liposomami klodronianowymi jako myszy biorcze.
UWAGA: W tym badaniu wyczerpanie makrofagów pęcherzykowych zostało potwierdzone poprzez sprawdzenie ekspresji markerów makrofagów, jak opisano wcześniej8,9 po podaniu liposomów klodronianu przez inhalację (patrz rysunek uzupełniający 1).
2. Izolacja i kultura komunikatorów
- Znieczulić mysz gospodarza wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (120 mg/kg) i ksylazyny (16 mg/kg). Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez utratę odruchu szczypania palca u nogi. Nałóż maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu. Następnie zdezynfekuj skórę znieczulonej myszy 75% alkoholem i jodem. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę i odsłonić tkankę krążeniowo-oddechową
- Odessać 10 ml 1x PBS do strzykawki z igłą 20 G i włożyć końcówkę igły do prawego przedsionka myszy (Rysunek 3A). Przetnij żyłę główną dolną myszy nożyczkami chirurgicznymi, a następnie ręcznie perfunduj mysz PBS ze stałą prędkością (10-20 ml / min), aż tkanka płucna zmieni kolor na biały. Wyciąć tkankę płucną i przenieść ją do lodowatego PBS w naczyniu hodowlanym (Ryc. 3B).
- Pokrój tkankę płucną na fragmenty o wymiarach około 2 mm x 2 mm x 2 mm. Następnie dodaj 15 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 1% kolagenazy A do tkanki płucnej w celu wyizolowania makrofagów. Inkubować z prędkością 100 obr./min przez 30 minut na stole wytrząsającym o temperaturze 37 °C.
- Zawiesinę tkanki płucnej należy odessać przez strzykawkę o pojemności 10 ml co najmniej 20 razy, aby była jak najdrobniejsza. Przefiltrować tę zawiesinę przez sitko o wielkości 40 μm. Odwirować filtrat o sile 400 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
- Poddać lizie czerwone krwinki w osadku, dodając 3 ml buforu do lizy RBC (patrz tabela materiałów) na lodzie przez 2-3 minuty.
- Po odwirowaniu przy 150 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 ml DMEM (zawierającym 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Wysiewać komórki na 10 cm przylegających do siebie szalkach do hodowli komórkowych w proporcjach 2 x 107 komórek/szalkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Dzięki temu IMs płuc mogą przylegać do dish5. Po 1 godzinie odessać supernatant i pływające komórki i dodać 10 ml świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej (DMEM zawierającej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować dłużej niż 8 godzin lub przez noc.
- Określić czystość otrzymanych IM za pomocą cytometrii przepływowej z barwieniem dla markerów F4/80 i CD11c, jak opisano wcześniej5 (patrz rysunek uzupełniający 1).
3. Adoptywne przenoszenie IM do pęcherzyków płucnych
- Zastąpić pożywkę hodowlaną z płytki zawierającej izolowane IM płuc (etap 2.7) kompletną pożywką hodowlaną zawierającą 10 ng/ml IL-33 w celu stymulacji IM. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Użyj 1x PBS zamiast IL-33 jako kontrola.
- Oddziel IM płucne, lecząc je 1 ml 0,25% trypsyny przez 5 minut. Następnie wygasić trawienie, dodając 3 ml świeżej kompletnej pożywki hodowlanej i zebrać makrofagi płucne, odwirowując zawiesinę komórkową w temperaturze 150 x g i 4 °C przez 5 minut. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić komórki w PBS do końcowego stężenia 5 x 105 komórek/50 μl.
- Znieczulić myszy biorcę 3% gazem izofluranowym. Poczekaj, aż mysz straci przytomność (jak w kroku 1.2), a następnie przymocuj kończyny znieczulonej myszy do pionowej płytki za pomocą taśmy medycznej. Delikatnie odciągnij język myszy na bok za pomocą bawełnianego wacika.
- Włącz lampę intubacyjną i poświeć nią gardło myszy, aby widać było tchawicę. Sprawdź, czy tchawica znajduje się blisko podstawy języka, przełyk znajduje się blisko tyłu szyi, ale otwór przełyku nie jest widoczny podczas operacji.
- Użyj lampy do intubacji (22 G), aby pomóc w intubacji myszy. Wprowadzić zastawioną kaniulę igłową do tchawicy za pomocą drutu doprowadzającego (o średnicy 0,4 mm). Usuń drut doprowadzający i wepchnij kaniulę do tchawicy myszy, aby zakończyć intubację.
- Po zaobserwowaniu, że kaniula dostaje się do tchawicy, wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórek (zawierającej 5 x 105 IM) myszy biorcy przez tchawicę.
- Umieść myszy na podkładce do stałego ogrzewania w temperaturze 38°C w celu ponownego rozgrzania, aby przyspieszyć regenerację. Monitoruj myszy, aż się obudzą. Po tym, jak dobrze się zregenerują i osiągną leżący mostek, przenieś je do klatki.
- Po 24 godzinach podać bleomycynę (BLM) przez tchawicę (zgodnie z procedurą opisaną w krokach 3.3-3.5) w dawce 1,4 j./kg masy ciała w celu wywołania IPF. Podaj równą objętość soli fizjologicznej grupie kontrolnej.
- Po 21 dniach określ stopień nasilenia zwłóknienia płuc dla różnych grup myszy, które zostały adoptywnie przeniesione z PBS lub zawiesiną IM stymulowaną IL-33, oceniając ekspresję markerów zwłóknienia i wyniki Ashcrofta10.
- Ekstrahować całkowity RNA z tkanki płucnej za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Analizę ilościową przeprowadzono za pomocą czytnika mikropłytek. Jeśli stosunek OD260/OD280 wynosi 1,8-2,0, czystość RNA jest wysoka. Wszystkie próbki przechowywano w temperaturze -80 ° C. - Wykonaj ilościowy fluorescencyjny PCR, aby ocenić ekspresję aktyny α mięśni gładkich (SMA) i fibronektyny przy użyciu określonych starterów.
UWAGA: Starterami stosowanymi do α-SMA były forward 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' i reverse 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', a starterami stosowanymi do fibronektyny były forward 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' i reverse 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGGG-3'.
- Ekstrahować całkowity RNA z tkanki płucnej za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów).
- Wykonaj immunohistochemię zgodnie z poniższym opisem.
- Odwodnić lewe płuco, zanurzyć je i pokroić krajalnicą do parafiny na grubość 4 μm.
- Ułożyć skrawki chusteczek na szkiełkach i piec je w piekarniku w temperaturze 65-70 ° C przez 30 min do 1 h. Odwoskować szkiełka z malejącą zawartością alkoholu (tj. 100%, 95%, 90%, 80% i 70% alkoholu) przez 5 min.
- Wybarwić szkiełka w roztworze barwnika hematoksyneliny (analitycznie czystym) przez 5 min. Następnie umyj szkiełka wodą z kranu. Namocz szkiełka w 1% alkoholu kwasu solnego przez 3 s, zmyj pływający kolor i moczyć w płynącej wodzie przez 5 minut. Sekcje zmienią kolor na niebieski.
- Zanurz w roztworze eozyny na 10 s do 1 minuty (określ czas barwienia w zależności od koloru), umyj wodą z kranu i umieść odpowiednio w 70%, 80%, 95%, 100% i 100% alkoholu na 5 minut każdy. Następnie umieść szkiełka w roztworach ksylenu I i ksylenu II na 3 minuty. Po wyschnięciu obserwuj i rób zdjęcia pod mikroskopem pionowym z neutralną samoprzylepną folią uszczelniającą.
- Wykonaj punktację Ashcrofta na sekcjach, aby wskazać stopień zwłóknienia płuc10. Przeprowadzić analizę statystyczną danych przy użyciu testu t na dwóch niezależnych próbach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokół zastosowany w tej pracy został podsumowany na schemacie w rysunku 1. W celu usunięcia makrofagów płucnych u dorosłych myszy C57BL/6 wykorzystano inhalację liposomów z klodronianem przez nos (rysunek 2), co pozwoliło na stworzenie odpowiedniego modelu myszy biorcy. Makrofagi płucne (IM) wyizolowano z innej, nieleczonej myszy (dawcy) (rysunek 3A,B) i hodowano in vitro. Wyizolowane makrofagi stymulowa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie to zapewnia skuteczną metodę zubożania, izolowania, hodowli i transferu makrofagów, co może pomóc w badaniu mechanizmów zwłóknienia płuc u myszy. Istnieje wiele metod zubożenia makrofagów myszy, takich jak podawanie tchawicy, wstrzykiwanie do żyły ogonowej i wdychanie do nosa11. W tym badaniu zoptymalizowano metodę inhalacji donosowej, która jest prosta w obsłudze i może skutecznie zubożyć makrofagi płucne 8,9. Po stymulacji IM IL-...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy uznają Specjalny Temat Zarządzania Laboratorium Uniwersytetu Jiangnan: Budowa Cyfrowej Biblioteki Warstw na Podstawie Próbek Patologicznych (JDSYS202223) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81800065).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life technologies Biotechnologia, USA | 1508012 | |
| Igła do inflatingu tętniczego | B Braun Melsingen AG, Niemcy | 21G15G8393 | |
| BD Źródło C6 Plus | Becton Dickinson, USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Inkubator dwutlenku węgla | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R& D Systems, USA | 1124F | |
| CD11c | R & D Systems,USA | N418 | |
| Naczynie do hodowli komórkowych | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Liposomy klodronianowe | Liposomy klodronianu, Holandia | CI-150-150 | |
| Kolagenaza A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R& D Systems, USA | 521204 | |
| Filtr siatkowy Falcon Cell Becton | , Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Technologie życia, USA | 1047571 | |
| Hematoksylina Eozyna | Nanjing Jiancheng Technology, Chiny | 06-570 | |
| System wykrywania PCR LightCycler 480 | Roche, USA | ||
| Mysi czynnik rekombinowany IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Mikroskop | Nikon Nikon Corporation, Japonia | 941185 | |
| Penicylina, streptomycyna | Technologie życia, USA | 877113 | |
| Fosforan bufor (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology, Chiny | 1535882 | |
| Bufor do lizy RBC | Beyotime Biotechnology Company, Chiny | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company, Chiny | R401-01-AA | Odczynnik do ekstrakcji całkowitego RNA |
| RWD Inhalacyjna maszyna anestezjologiczna | Shenzhen Rayward Life Technology, Chiny | R500 | |
| Półautomatyczna parafina krajalnica | Leica, Niemcy | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japonia | 410800 | |
| Trypsyna 0.25% | Life Technologies, Stany | Zjednoczone 1627172 |
Bibliografia
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897(2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846(2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
