Method Article

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

DOI:

10.3791/64744

⸱

March 3rd, 2023

 ,  ,  ,  , 
1National Physical Laboratory, 2SWISSCI LTD

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie relacji struktura-funkcja makromolekuł, takich jak białka, na poziomie molekularnym jest kluczowe dla biomedycyny i odkrywania nowoczesnych leków. Do tej pory krystalografia rentgenowska pozostaje najskuteczniejszą metodą rozwiązywania trójwymiarowych struktur białkowych w rozdzielczości atomowej. Dzięki niedawnym postępom w krystalografii szeregowej, zarówno przy użyciu rentgenowskich laserów na swobodnych elektronach (XFEL), jak i synchrotronowych źródeł światła, krystalografia białek osiągnęła kolejną granicę, gdzie możliwość pozyskiwania danych rozdzielczych w czasie zapewnia ważne mechanistyczne wglądy w zachowanie cząsteczek biologicznych w temperaturze pokojowej. Protokół ten opisuje prosty przepływ pracy o wysokiej przepustowości (HTP) do badań przesiewowych warunków krystalizacji przy użyciu 96-dołkowej płytki dializowej. Płytki te są zgodne ze standardem Towarzystwa Badań Biomolekularnych (SBS) i można je łatwo skonfigurować za pomocą dowolnego standardowego laboratorium krystalizacji. Po określeniu optymalnych warunków za pomocą dializatora można wytworzyć duże ilości kryształów (setki mikrokryształów). Aby potwierdzić solidność i wszechstronność tego podejścia, skrystalizowano cztery różne białka, w tym dwa białka błonowe.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniego stulecia, krystalografia rentgenowska odegrała kluczową rolę w wyjaśnieniu i zrozumieniu paradygmatu struktura-funkcja makrocząsteczek biologicznych. Do tej pory jest to jedna z najbardziej skutecznych metod wyjaśniania struktur rozdzielczości atomowej wielu unikalnie różnych białek, które mają kluczowe znaczenie dla podstawowego zrozumienia biochemii komórki, medycyny i wczesnego odkrywania leków1,2. Jednak krystalizacja białek pozostaje wąskim gardłem w badaniu wielu celów białkowych, w szczególności białek błonowych i dużych kompleksów białkowych3. W związku z tym krystalizacja białek jest prawie zawsze uważana za sztukę ze względu na pracochłonne metody prób i błędów4,5,6.

Środek strącający jest zwykle dodawany do roztworu białka o wysokim stężeniu, aby utworzyć dobrze uporządkowany, regularny i powtarzający się układ siatkowy cząsteczek białka, znanych jako kryształy. W sprzyjających warunkach, takich jak temperatura, pH, stężenie i środek strącający, ostatecznie tworzy się przesycony roztwór, po którym następuje zarodkowanie i wzrost kryształów7,8. Chociaż poczyniono wiele postępów w zakresie prób krystalizacji, głównie dzięki rozwojowi wysokowydajnych systemów robotycznych i dostępności gotowych ekranów z "rzadką matrycą", ogólne podejścia do krystalizacji białek w dużej mierze pozostały niezmienione na przestrzeni lat. Typowe eksperymentalne techniki krystalizacji białek obejmują dyfuzję parową (kropla wisząca i kropla siedząca)9, mikrobatch (pod olejem)10,11, dyfuzja swobodnego interfejsu (urządzenia mikroprzepływowe)12 oraz dializa (przy użyciu przycisków i innych technik)13,14,15. Istnieją jednak również inne, bardziej wyspecjalizowane konfiguracje, takie jak podejścia mezofazowe do krystalizacji białek błonowych16,17. Podczas gdy większość rentgenowskich struktur białkowych zdeponowanych w Banku Danych o Białkach została do tej pory rozwiązana poprzez krystalizację metodami dyfuzji parowej6,18, inne podejścia, takie jak krystalizacja przez dializę, wydają się być niedostatecznie wykorzystywane, prawdopodobnie ze względu na praktyczne aspekty związane z ich eksperymentalną konfiguracją.

Krystalizacja przez dializę polega po prostu na powolnej dyfuzji substancji rozpuszczonych (strącaczy, jonów, dodatków i) przez półprzepuszczalną membranę, która jednocześnie zapobiega krążeniu cząsteczek białka. W ten sposób roztwór białkowy jest powoli doprowadzany do równowagi, a środek strącający osiąga stężenie niezbędne do krystalizacji. Kinetyka systemu zależy od temperatury, stężenia środka strącającego i odcięcia masy cząsteczkowej membrany celulozowej (MWCO)19. Do tej pory najpopularniejszą metodą krystalizacji za pomocą dializy było użycie przycisków do mikrodializy wykonanych z przezroczystych arkuszy akrylowych. Są one zwykle zanurzane w zbiornikach (głównie za pomocą wiszących płytek kroplowych do dyfuzji pary) zawierających roztwory strącające krystalizację. Jednak ta metoda o niższej przepustowości wymaga również specyficznego montażu w celu uszczelnienia roztworu białkowego w membranie dializacyjnej umieszczonej nad komorą guzikową, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Co więcej, pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną dializacyjną a roztworem białka są częstym problemem, który upośledza wzrost kryształów. Kolejnym ograniczeniem metody są wymagania dotyczące próbek, przy czym konieczne są znacznie wyższe stężenia i objętości w porównaniu z metodami dyfuzji parowej, aby pomieścić przyciski dializy. Dlatego krystalizacja przy użyciu przycisków do mikrodializy jest postrzegana jako nieatrakcyjna metoda, szczególnie w przypadku trudnych celów, takich jak białka błonowe, których wydajność oczyszczania jest frustrująco niska. Ostatnio opracowano urządzenia mikroprzepływowe ułatwiające krystalizację białek przez dializę15. Chipy te zostały również zaprojektowane tak, aby miały wysoką przezroczystość promieniowania rentgenowskiego przy niskim tle, co pozwala na wykorzystanie chipów do zbierania danych in situ w temperaturze pokojowej, eliminując w ten sposób niedogodności związane ze zbieraniem i kriochłodzeniem kryształów. Pomimo tych postępów podejście to jest nadal bardzo wydajne i kosztowne.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie krystalizacji przez dializę za pomocą przycisków dializy. (A) Schematyczne przedstawienie przycisku dializy krystalizacyjnej. (B) Roztwór białka dodaje się do komory guzikowej do mikrodializy. (C) Membrana dializy jest przytrzymywana do przycisku mikrodializy za pomocą gumowego pierścienia (O-ringu) nakładanego za pomocą aplikatora. (D) Przycisk do dializy jest gotowy do zanurzenia w zbiorniku zawierającym roztwór krystalizacyjny (roztwór do dializy), jak pokazano w (E). Fiolka zawierająca zanurzony przycisk do dializy musi być szczelnie zamknięta, aby uniknąć parowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tutaj przedstawiono prosty protokół do badania warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Te jednorazowe płytki są przeznaczone do użytku podobnie jak płytki krystalizacyjne dyfuzji parowej (pipeta, a następnie uszczelnienie), jak pokazano na Rysunek 2. Płytki mogą pomieścić do 3,2 μl białka i 350 μl roztworu do dializy. Każda studnia posiada oddzielną membranę z regenerowanej celulozy, która zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu między studzienkami. Konfiguracja trwa około 10 minut i nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu poza tym, który można znaleźć we wszystkich standardowych laboratoriach krystalizacji. Cztery różne białka, w tym dwa białka błonowe, wykorzystano do zademonstrowania i walidacji tego podejścia jako skutecznej metody krystalografii białek o wysokiej przepustowości (HTP).

figure-introduction-2
Rysunek 2: Proces krystalizacji przy użyciu płytki do mikrodializy. (A) Usunięcie czerwonej warstwy kleju "folia ochronna". (B) Dozowanie kropelek białka do każdej z studzienek kroplowych. (C) Studzienki pokryte są "folią pokrywającą" UV. (D) Płytkę odwraca się w celu dodania roztworów dializacyjnych (lub sita krystalizacyjnego). (E) Płytka jest szczelnie zamknięta i poddana inkubacji. (F,G) Badanie mikroskopowe kropli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Użycie tej krystalizacji za pomocą protokołu dializy zostało zademonstrowane przy użyciu rurki dializacyjnej o pojemności 0,5 ml (Rysunek 3) do produkcji mikrokryształów na dużą skalę (setki do tysięcy), odpowiednie dla najnowocześniejszych metod zbierania danych, takich jak krystalografia szeregowa w obu obiektach XFEL20,21,22,23,24 i synchrotrons25,26,27, a także dla MicroED28,29,30 zbliża się.

figure-introduction-3
Rysunek 3: Krystalizacja mikrodializy na dużą skalę przy użyciu rurki dializatora. (A) Schematyczne przedstawienie rurki dializatora o pojemności 0,5 ml. (B) Widok z boku zlewki zawierającej roztwór krystalizacyjny i pływającego stojaka na probówki z rurką do dializatora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki białka

  1. Przygotować (metodami rekombinacyjnymi lub w inny sposób) i oczyścić białko (białka) będące przedmiotem zainteresowania w odpowiednim buforze (tj. takim, który jest podatny na stabilność białka i krystalizację), który został przefiltrowany za pomocą filtra 0,22 μm (patrz tabela materiałów). Oceń jakość białka (pod względem czystości, polidyspersyjności i stabilności) przed krystalizacją31.
    UWAGA: Proszę zapoznać się z sekcją dotyczącą reprezentatywnych wyników, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat białek i użytych w niniejszym badaniu.
  2. Zagęścić próbkę do 10-50 mg.mL-1 lub więcej (w zależności od docelowego białka) przy użyciu odpowiedniego koncentratora MWCO (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Zagęszczoną próbkę można natychmiast wykorzystać do krystalizacji lub przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C.
  3. Jeżeli białko zostało zamrożone, odwirować próbkę przez 10 minut w wirówce stołowej (≥16 000 × g, w temperaturze pokojowej lub 4 °C) w celu osadzenia i usunięcia wszelkich niepożądanych materiałów (np. osadów).
  4. Porcję białka przelać do czystych probówek PCR o pojemności 200 μl. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, jeśli białko jest niestabilne w temperaturze pokojowej.

2. Ustawianie płytki do mikrodializy

UWAGA: Dostępna na rynku płytka do mikrodializy (patrz Tabela materiałów) składa się z dwóch stron ('strona białkowa' i 'strona buforowa') z membraną z regenerowanej celulozy (dostępnej w różnych MWCO), jak pokazano na Rysunek 2.

  1. Stroną z białkiem skierowaną do góry oderwij i usuń samoprzylepną taśmę maskującą (Rysunek 2A) z podkładki dystansowej kleju o grubości 200 μm. Zwróć uwagę na położenie studni A1.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj maksymalnie 3,2 μl białka (krok 1.4) do każdego dołka (Rysunek 2B).
    UWAGA: Białko można również załadować za pomocą pipety dozującej wielokrotnie. Użycie pipety jednokanałowej jest możliwe, ale zwiększy to prawdopodobieństwo częściowego odwodnienia kropli występującego z powodu wydłużonego czasu ładowania.
  3. Umieść folię ochronną UV o grubości 200 μm (patrz Tabela materiałów) na płytce 96-dołkowej i sprawdź jej integralność (Rysunek 2C). Upewnij się, że folia ochronna jest skierowana do góry.
  4. Użyj łopatki uszczelniającej (patrz Tabela materiałów), dociśnij folię ochronną UV, aby aktywować i uszczelnić klej dociskowy.
  5. Odwróć tabliczkę i zwróć uwagę na położenie studzienki A1. Upewnij się, że płytka jest zorientowana buforem do góry i że pozycje studzienek są lustrzane (Rysunek 2D).
  6. Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj maksymalnie 350 μl roztworu dializacyjnego do każdej ze studzienek (Rysunek 2D).
    UWAGA: Na tym etapie można użyć dostępnych na rynku ekranów krystalizacji (rzadkie ekrany matrycowe) lub laboratoryjnie dostosowanych do potrzeb ekranów (sita siatkowe) (patrz Tabela materiałów).
  7. Ostrożnie uszczelnij studnie za pomocą 'folii pokrywy zbiornika' (patrz Tabela Materiałów) (Rysunek 2E).
  8. Umieścić płytkę (buforem skierowanym do góry) w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (20 °C) w celu uzyskania wzrostu kryształów.
    UWAGA: W przypadku białek wybranych do niniejszego badania, kryształy zaczęły pojawiać się między 1 a 8 godzinami w temperaturze 20 °C.
  9. Aby sprawdzić, czy pod mikroskopem nie ma kryształów, odwróć płytkę, aby podnieść stronę z białkiem do góry i usuń folię ochronną z folii ochronnej UV 200 μm (krok 2.3), jak pokazano na Rysunek 2F,G.

3. Krystalizacja na dużą skalę przy użyciu sond dializatora

UWAGA: Po zbadaniu warunków krystalizacji za pomocą płytki do mikrodializy, krystalizacja białka na dużą skalę (do krystalografii seryjnej lub innych celów) może być przeprowadzona za pomocą rurki dializatora, jak pokazano na Rysunek 3. Podobnie jak płytki do mikrodializy, urządzenia te są dostępne z membranami dializacyjnymi MWCO o mocy 3, 5, 10 i 30 kDa.

  1. Przygotuj zoptymalizowane warunki krystalizacji do wzrostu mikrokryształów w dużych pojemnikach (przyjmując warunki zoptymalizowane przy użyciu płytki do mikrodializy). Upewnij się, że bufor został wcześniej przefiltrowany za pomocą filtra 0,2 μm.
  2. Odpipetuj białko do rurki dializatora (maksymalna objętość 0,5 ml) i uszczelnij koniec za pomocą dołączonej czerwonej plastikowej nakrętki (Rysunek 3A).
  3. Umieść rurkę dializatora o pojemności 500 μl w pojemniku o odpowiedniej wielkości (w zależności od całkowitej objętości roztworu do dializy) zawierającym pływający stojak (patrz tabela materiałów), jak pokazano w Rysunek 3B.
    UWAGA: Pływający stojak dostarczony z zestawem dializatora mieści jednocześnie do 18 rurek dializatora.
  4. Umieścić pojemnik nieruchomo w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (20 °C) w celu wzrostu kryształów.
  5. Aby sprawdzić, czy nie ma kryształów, odpipetować 1-2 μl roztworu na szkiełko podstawowe. Przykryj drugą szklaną pokrywą, szkiełkiem podstawowym na górze (aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu) i view pod mikroskopem (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Kryształy mogą ulec uszkodzeniu, jeśli zostaną umieszczone między dwoma szkiełkami pokrywy podczas inspekcji. Kryształy można również oglądać bezpośrednio, umieszczając rurkę dializatora pod stereoskopowym mikroskopem o dużym powiększeniu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cztery białka zostały skrystalizowane za pomocą płytki do mikrodializy (z membranami MWCO o mocy 10 kDa), w tym dwa białka błonowe. Lizozym białka jaja kurzego z liofilizowanego proszku (patrz Tabela materiałów) przygotowano w temperaturze 50 mg.mL-1 w 20 mM NaOAc (pH 4,5), a liofilizowaną taumatynę (patrz Tabela materiałów) rozpuszczono w wodzie do końcowego stężenia 25 mg.mL-1. Dwa białka błonowe użyte w tym badaniu to wielolekowa pompa wypływowa E. coli AcrB i transporter laktozy E. coli LacY. AcrB wyrażano przy użyciu komórek C43 (DE3) i oczyszczano za pomocą chromatografii powinowactwa Ni-NTA i chromatografii wykluczania wielkości w 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (w/v) n-dodecylo-β-D-maltozyd (DDM) i 5% (v/v) glicerol32. Następnie białko zagęszczono za pomocą koncentratora odśrodkowego MWCO o stężeniu 100 kDa do końcowego stężenia 6 mg.mL-1. LacY ulegał również ekspresji w komórkach C43 (DE3), oczyszczony chromatografią powinowactwa do sefarozy, a następnie chromatografią wykluczającą wielkość w 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (w/v) DDM i zagęszczony za pomocą koncentratora MWCO 100 kDa do 10 mg.mL-1 4,33.

Dla białek lizozymu i taumatyny, 96-dołkowa płytka do mikrodializy została wypełniona siatką krystalizacji przygotowaną wewnętrznie jako roztwór do dializy, podczas gdy dla białka błonowego AcrB, siatka została przygotowana wewnętrznie z wcześniej opublikowanych warunków krystalizacji34. W przypadku LacY początkowe warunki trafienia zostały znalezione na ekranie komercyjnym (patrz tabela materiałów) i następnie zoptymalizowane za pomocą ekranu siatkowego wykonanego we własnym zakresie. Stosunek kropli krystalizacji dla lizozymu, taumatyny i AcrB wynosił 1:100, przy 2 μl białka na 200 μl środka strącającego (roztwór do dializy). Krople krystalizacji LacY były również w stosunku 1:100, z 1 μl białka na 100 μl roztworu dializacyjnego, ze względu na mniejszą ilość dostępnego białka.

Kryształy ze wszystkich czterech białek, w tym białek błonowych, zaczęły pojawiać się między 1-8 godzinami w temperaturze 20 °C po ustawieniu na płytce do mikrodializy. W tym przypadku nie było konieczne uzupełnianie roztworu dializacyjnego detergentem do krystalizacji białek błonowych, co zwykle odbywa się podczas standardowego procesu dializy, aby zapobiec agregacji białek błonowych, ponieważ oczekiwano, że micele detergentu będą większe niż MWCO membran do dializy35.

Po udanej krystalizacji białek na płytce do mikrodializy (Rysunek 4), zauważono warunki krystalizacji, a krystalizacja na dużą skalę za pomocą dializy została przeprowadzona przy użyciu rurki dializatora z tymi samymi membranami dializacyjnymi MWCO o mocy 10 kDa. Tysiące mikrokryształów dla każdego z pojedynczych białek wyrosło wewnątrz dializatora, jak pokazano na Rysunek 5. W celu krystalizacji taumatyny 250 μl białka załadowano do dializatora i dializowano z 50 ml (stosunek 1:200). W przypadku AcrB 250 μl białka dializowano w porównaniu z 25 ml roztworu do dializy (1:100). Krystalizację LacY przeprowadzono również w tym samym stosunku ze 100 μl białka na 10 ml roztworu dializacyjnego.

figure-results-1
Rysunek 4: Kryształy są hodowane przez dializę za pomocą płytki do mikrodializy. Protokół demonstruje możliwość zastosowania układu z rozpuszczalnymi białkami: (A) Lizozym dializowano z 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl i 25% (v/v) glicerolem. (B) Taumatynę dializowano z 0,1 M Bis-tris propanem (pH 6,6), 1 M winianem K / Na i 18% (v/v) glikolem etylenowym. Uzyskano również kryształy dla białek błonowych: (C) AcrB poddano dializie przeciwko 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl i 20% (v/v) PEG-400. (D) LacY poddano dializie przeciwko 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl i 32% (v/v) PEG-300. Obrazy zostały wykonane za pomocą stereoskopowego mikroskopu o dużym powiększeniu z polaryzatorem krzyżowym. Podziałka liniowa: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy kryształów białka błonowego wyhodowanych przez dializę za pomocą rurki dializatora. (A) Obraz przedstawiający probówkę pełną mikrokryształów (oznaczony czarną strzałką). (B) Obraz mikroskopowy 2 μl z zawiesiny kryształów taumatyny wyhodowanych przez dializę przy użyciu probówki dializatora o pojemności 0,5 ml, dializowanych z 0,1 M Bis-tris propanem (pH 6,6), winianem 1,4 M K/Na i 18% (v/v) glikolem etylenowym. (C) Obrazy ciemnego pola (po lewej) i jasnego pola (po prawej) mikrokryształów AcrB wyhodowanych przez dializę w stosunku do 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl i 20% (v/v) PEG-400. (D) Obrazy w ciemnym polu (po lewej) i w jasnym polu (po prawej) mikrokryształów LacY wyhodowanych przez dializę w stosunku do 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl i 32% (v/v) PEG-300. Obserwuje się pewne osady. Podziałka liniowa: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie krystalizacja przez dializę jest najbardziej niewykorzystaną metodą krystalizacji, a mianowicie ze względu na niską przepustowość i żmudny charakter istniejących metod, takich jak mikrodializa za pomocą guzików. W tym przypadku prosty, ale solidny protokół podąża za przepływem pracy HTP do wzrostu kryształów białka poprzez dializę za pomocą dostępnej na rynku płytki do mikrodializy i rurki dializatora. W zależności od białka docelowego, płytka do mikrodializy i rurka dializatora używane w procedurze są dostarczane z wyborem membrany dializacyjnej o MWCO 3, 5, 10 lub 30 kDa. Protokół można łatwo skonfigurować w dowolnym standardowym zakładzie krystalizacji i ma tę wielką zaletę, że można go stosować zarówno do białek rozpuszczalnych, jak i błonowych. Jednak kompleksy białko-białko i białko-kwas nukleinowy nie były testowane podczas tego protokołu.

Podobnie jak w przypadku każdej metody krystalizacji za pomocą dializy, stosunek objętości między próbką białka a roztworem do dializy ma kluczowe znaczenie. W tym protokole zalecany jest stosunek 1:100 między próbką a roztworem do dializy, ale ponieważ płytka do mikrodializy pozwala na maksymalną pojemność 350 μl roztworu do dializy, proporcje te można zbadać w celu uzyskania trafień kryształów. W prezentowanym protokole wykorzystuje się objętość 1-2 μL białka przy ustawianiu płytek krystalizacyjnych. Ma to na celu zapewnienie dokładnego ustawiania kropli za pomocą ręcznej pipety wielokanałowej. Dzięki zastosowaniu pipet elektronicznych (pipet wielokanałowych lub wielokrotnych dozowników) lub robotów dozujących ciecze HTP, można dokładnie uzyskać krople o mniejszych objętościach, zmniejszając w ten sposób ilość wymaganego białka. Ponadto, ze względu na stosunkowo niewielkie objętości buforu dializacyjnego wymaganego przez płytkę do mikrodializy (w przeciwieństwie do innych konwencjonalnych metod dializy), możliwe jest (bez nadmiernego wykorzystania zasobów) badanie dużych przestrzeni chemicznych, nie tylko przy użyciu dostępnych na rynku ekranów krystalizacji, ale także ekranów optymalizacyjnych (zaprojektowanych wokół początkowego warunku osiągnięcia krystalizacji).

Krytycznym krokiem w przedstawionej procedurze HTP jest terminowe podanie małych objętości białka (0,50-3,2 μl na warunek) na płytkę dializacyjną w celu ograniczenia odwodnienia i utraty próbki. Można to łatwo złagodzić, stosując pipetę wielokanałową, pipetę do wielokrotnego dozowania lub zrobotyzowany system krystalizacji. Długi czas inkubacji, wynoszący ponad 2 tygodnie, płytek w temperaturze 20 °C może prowadzić do odwodnienia kropelek białka lub uszkodzenia niedawno utworzonych kryształów. Przechowywanie płytek dializacyjnych w komorze nawilżania lub zamykanej torbie może złagodzić ten efekt. Ponadto zaleca się stosowanie sterylnych materiałów i technik, aby uniknąć rozwoju bakterii.

Jak wspomniano we wprowadzeniu, ostatnio, wraz ze zwiększoną potrzebą zrozumienia dynamiki strukturalnej białek dla mechanizmów chorobowych, interakcji wiązania białko-ligand i interakcji białko-białko, dziedzina krystalografii rentgenowskiej białek została zrewolucjonizowana poprzez rozwój nowych i istniejących technik krystalizacji, nowoczesnych podejść do dostarczania próbek kryształów, nowych generacji źródeł promieniowania rentgenowskiego oraz nowych wyrafinowanych metod pozyskiwania i przetwarzania danych36,37,38. W związku z tym pojawienie się seryjnej mikrokrystalografii w temperaturze pokojowej, wykonywanej przy użyciu XFEL lub synchrotronowych źródeł światła, stało się niezwykłym narzędziem w biologii strukturalnej, szczególnie w dziedzinie białek błonowych39. Jednak do wygenerowania wystarczającej ilości danych dla solidnego rozwiązania strukturalnego potrzebne są tysiące mikrokryształów, co nie jest łatwym zadaniem (przynajmniej przy użyciu konwencjonalnych metod krystalizacji). Opisana tutaj metoda krystalizacji dializ umożliwia wytworzenie dużej liczby mikrokryształów. Po określeniu warunków krystalizacji do produkcji mikrokryształów (1-10 μm) za pomocą płytki do mikrodializy, za pomocą dializatora o pojemności 0,5 ml można wytworzyć duże ilości mikrokryształów o dużej gęstości (rysunek 5). Kryształy te idealnie nadają się do zbierania danych za pomocą stałych celów lub systemów dostarczania próbek strumieniem cieczy27, Lokal mieszkalny 40. Kryształy uzyskane tą metodą mogą być również odpowiednie do zastosowań MicroED. Jednak mogą one wymagać zmielenia do odpowiedniego rozmiaru i grubości dla tego konkretnego zastosowania, ponieważ elektrony oddziałują z kryształami znacznie silniej niż fotony promieniowania rentgenowskiego41.

Podsumowując, opisane tutaj podejście do krystalizacji przez dializę uzupełnia rozwijające się strategie krystalizacji białek w celu określenia struktury i rozszerza zakres wysiłków, które można zastosować do określenia nowych celów białkowych, które wcześniej nie były skuteczne przy użyciu innych konwencjonalnych metod.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Współautorzy, Pascelle Draper i Paul Reardon, są zatrudnieni przez SWISSCI.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potwierdzamy finansowanie z brytyjskiego Departamentu Biznesu, Energii i Strategii Przemysłowej (BEIS). Dziękujemy Alexowi R. Jonesowi i Mike'owi Shawowi z National Physical Laboratory za ich opinie na temat manuskryptu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki 0,2 mlThermo ScientificAB0620Do porcjowania roztworów białkowych.
0,2 &mikro; m filtr strzykawkowySartorius17823----------KFiltry z octanu celulozy bez środków powierzchniowo czynnych. Do filtrowania roztworów dializacyjnych.
0,22 &mikro; m Filtry membranoweMilliporeGSTF04700Filtry membranowe do filtrowania dużych ilości
12-kanałowy, zmienny 0,5 – 10 µ L Research plus pipetaEppendorf3125000028Do dozowania kropli białkowych na Diaplate.
12-kanałowy, zmienny 30 – 300 µ L Pipeta Eppendorf Research plus Eppendorf3125000060Do dozowania roztworów dializacyjnych do zbiorników Diaplate.
Strzykawka 20 mlFisherbrand15889152Do stosowania z filtrami strzykawkowymi.
96-dołkowe płytki głębinowe 2,2 mlThermo ScientificAB0788Polipropylenowe płytki do przechowywania głębokich; do przygotowania sit przy użyciu Hamilton Microlab STARlet.
Wirówka 5425Eppendorf5405000565Z wirnikiem FA-24x2 o maksymalnej sile g 21 300 x g.
Diakondializator SWISSCIW72010Rurki dializatora z membraną z regenerowanej celulozy o granicy masy cząsteczkowej 10 kDa. Idealny do roztworów białkowych o pojemności do 0,5 ml.
Diaplate 96-dołkowa płytkaSWISSCIW82010Płytka do mikrodializy. Diaplate składa się z dwóch stron, pomiędzy którymi znajduje się membrana z regenerowanej celulozy o wartości granicznej masy cząsteczkowej 10 kDa.
Probówka wirówkowa Falcon 50 mL High Clarity PPCorning352070Do przechowywania roztworów dializacyjnych.
Stojak pływającySWISSCIn/aWchodzi w skład zestawu Diacon
Inkubator stojący bez wibracjiMolecular DimensionsMD5-01Inkubator o pojemności 400 l z kontrolowaną temperaturą ustawioną na 20 stopni C.
Mikroskop stereoskopowy Leica M205 CLeicaPlanapo 1,0x, zakres zoomu 7,8x i ndash; 160x z kamerą DMC 4500
Lizozym z białka jaja kurzegoSigma Aldrich62971Liofilizowane białko
Memgold2Wymiary molekularneMD1-64Ekran z rzadką matrycą
Microlab STARletHamiltonn/aSystem obsługi cieczy.
Folia pokrywy zbiornikaSWISSCIn/aZawarta w zestawie Diaplate
Filtr butelkowy wielokrotnego użytkuThermo ScientificDS0320-5045Do montażu dużych ilości, do stosowania z 0,22 i mikro; m Filtry membranowe
Łopatka uszczelniającaSWISSCIn/aZawarte w zestawie Diaplate
Thaumatin od Thaumatococcus danielliiSigma AldrichT7638Liofilizowana
folia osłonowa UVSWISSCIn/aZawarta w zestawie Diaplate
Obiektyw białkowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The nobel science: One hundred years of crystallography. Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).">Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. The nobel science: One hundred years of crystallography. Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).
  2. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), (2020).">Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), (2020).
  3. Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).">Kwan, T. O. C., Axford, D., Moraes, I. Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).
  4. The fine art of integral membrane protein crystallisation. Methods. 147, 150-162 (2018).">Birch, J., et al. The fine art of integral membrane protein crystallisation. Methods. 147, 150-162 (2018).
  5. Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology. Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).">Gorrec, F., Löwe, J. Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology. Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).
  6. Choosing the method of crystallization to obtain optimal results. Crystals. 9 (2), 106(2019).">Govada, L., Chayen, N. E. Choosing the method of crystallization to obtain optimal results. Crystals. 9 (2), 106(2019).
  7. Turning protein crystallisation from an art into science. Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).">Chayen, N. E. Turning protein crystallisation from an art into science. Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).
  8. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).">McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  9. Protein crystallography: methods and protocols. Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).">Gulbis, J. Protein crystallography: methods and protocols. Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).
  10. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).">D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  11. Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).">Shaw Stewart,, D, P., Kolek, S. A., Briggs, R. A., Chayen, N. E., Baldock, P. F. Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
  12. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).">Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).
  13. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).">Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).
  14. Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).">Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova-Spano, M. Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).
  15. Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).">Jaho, S., et al. Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  16. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. Journal of Visualized Experiments. 49, 2501(2011).">Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. Journal of Visualized Experiments. 49, 2501(2011).
  17. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).">Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).
  18. Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).">Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).
  19. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).">Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).
  20. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).">Neutze, R., Wouts, R., Vander Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  21. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).">Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).
  22. Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology. Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).">Mizohata, E., Nakane, T., Fukuda, Y., Nango, E., Iwata, S. Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology. Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).
  23. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).">Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  24. XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity. Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).">Johansson, L. C., et al. XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity. Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).
  25. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).">Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).
  26. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature communications. 8 (1), 542(2017).">Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature communications. 8 (1), 542(2017).
  27. Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).">Axford, D., et al. Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).
  28. The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED). Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).">Nannenga, B. L., Gonen, T. The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED). Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).
  29. Beyond protein structure determination with MicroED. Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).">Nguyen, C., Gonen, T. Beyond protein structure determination with MicroED. Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).
  30. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).">Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).
  31. Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605(2019).">Kwan, T. O. C., et al. Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605(2019).
  32. crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).">Pos, K. M., Purification Diederichs, K. crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).
  33. Structural determination of wild-type lactose permease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).">Guan, L., Mirza, O., Verner, G., Iwata, S., Kaback, H. R. Structural determination of wild-type lactose permease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).
  34. In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study. Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).">Kwan, T. O. C., Reis, R., Moraes, I. In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study. Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).
  35. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).">Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).
  36. A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 7 (2), 024701(2020).">Wickstrand, C., et al. A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 7 (2), 024701(2020).
  37. Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs. Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).">Orville, A. M. Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs. Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).
  38. Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).">Schulz, E. C., Yorke, B. A., Pearson, A. R., Mehrabi, P. Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).
  39. Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers. Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).">Neutze, R., Brändén, G., Schertler, G. F. Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers. Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).
  40. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).">Wierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).
  41. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).">Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein CrystallizationMicrodialysis CrystallizationHigh Throughput Screening96 Well PlateDialysis PlateCrystal GrowthSerial CrystallographyMembrane ProteinsX Ray CrystallographyMicrocrystal Formation

Related Articles