Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64744

⸱

3 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1National Physical Laboratory, 2SWISSCI LTD

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Streszczenie

Zrozumienie relacji struktura-funkcja makromolekuł, takich jak białka, na poziomie molekularnym jest kluczowe dla biomedycyny i odkrywania nowoczesnych leków. Do tej pory krystalografia rentgenowska pozostaje najskuteczniejszą metodą rozwiązywania trójwymiarowych struktur białkowych w rozdzielczości atomowej. Dzięki niedawnym postępom w krystalografii szeregowej, zarówno przy użyciu rentgenowskich laserów na swobodnych elektronach (XFEL), jak i synchrotronowych źródeł światła, krystalografia białek osiągnęła kolejną granicę, gdzie możliwość pozyskiwania danych rozdzielczych w czasie zapewnia ważne mechanistyczne wglądy w zachowanie cząsteczek biologicznych w temperaturze pokojowej. Protokół ten opisuje prosty przepływ pracy o wysokiej przepustowości (HTP) do badań przesiewowych warunków krystalizacji przy użyciu 96-dołkowej płytki dializowej. Płytki te są zgodne ze standardem Towarzystwa Badań Biomolekularnych (SBS) i można je łatwo skonfigurować za pomocą dowolnego standardowego laboratorium krystalizacji. Po określeniu optymalnych warunków za pomocą dializatora można wytworzyć duże ilości kryształów (setki mikrokryształów). Aby potwierdzić solidność i wszechstronność tego podejścia, skrystalizowano cztery różne białka, w tym dwa białka błonowe.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniego stulecia krystalografia rentgenowska odgrywała kluczową rolę w wyjaśnianiu i rozumieniu paradygmatu struktura-funkcja makromolekuł biologicznych. Do dziś pozostaje jedną z najskuteczniejszych metod określania struktur o rozdzielczości atomowej wielu unikalnych białek, które są niezbędne dla fundamentalnego zrozumienia biochemii komórki, medycyny oraz wczesnego etapu projektowania leków1,2. Jednakże krystalizacja białek wciąż stanowi wąskie gardło w badaniu wielu celów białkowych, szczególnie białek błonowych i dużych kompleksów białkowych3. W konsekwencji krystalizacja białek jest niemal zawsze uważana za sztukę ze względu na stosowane, pracochłonne podejścia oparte na metodzie prób i błędów4,5,6.

Do roztworu białka w wysokim stężeniu zazwyczaj dodaje się czynnik wytrącający, aby utworzyć uporządkowaną, regularną i powtarzalną strukturę sieciową cząsteczek białka, zwaną kryształami. W sprzyjających warunkach, takich jak temperatura, pH, stężenie i rodzaj czynnika wytrącającego, ostatecznie tworzy się roztwór nasycony, po czym następuje nukleacja i wzrost kryształów7,8. Mimo wielu postępów w konfiguracjach prób krystalizacji, wynikających głównie z rozwoju robotycznych systemów wysokoprzepustowych oraz dostępności gotowych ekranów typu „sparse matrix”, ogólne podejścia do krystalizacji białek pozostały przez lata w dużej mierze niezmienione. Do powszechnych eksperymentalnych technik krystalizacji białek należą dyfuzja par (kropla wisząca i kropla siedząca)9, mikrobatch (pod warstwą oleju)10,11, dyfuzja swobodnego interfejsu (urządzenia mikroprzepływowe)12 oraz dializa (z wykorzystaniem guzików i innych technik)13,14,15. Istnieją jednak również inne, bardziej wyspecjalizowane układy, takie jak podejścia mezofazowe do krystalizacji białek błonowych16,17. Choć większość struktur białkowych uzyskanych metodą rentgenograficzną i zdeponowanych w Protein Data Bank została rozwiązana poprzez krystalizację metodami dyfuzji par6,18, inne podejścia, takie jak krystalizacja poprzez dializę, wydają się być niewystarczająco wykorzystywane, prawdopodobnie ze względu na praktyczne aspekty związane z ich konfiguracją eksperymentalną.

Krystalizacja poprzez dializę opiera się na powolnej dyfuzji substancji rozpuszczonych (precypitantów, jonów, dodatków i buforów) przez membranę półprzepuszczalną, która jednocześnie zapobiega przenikaniu cząsteczek białka. W ten sposób roztwór białka powoli osiąga stan równowagi, a precypitant uzyskuje stężenie niezbędne do krystalizacji. Kinetyka układu zależy od temperatury, stężenia precipitanta oraz progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) membrany celulozowej19. Do tej pory najpopularniejszym układem do krystalizacji metodą dializy było wykorzystanie guzików do mikrodializy wykonanych z przezroczystych arkuszy akrylowych. Są one zazwyczaj zanurzane w rezerwuarach (najczęściej z wykorzystaniem płytek do metody kropli wiszącej z dyfuzją par) zawierających roztwory precipitanta krystalizacyjnego. Jednak ta metoda o niskiej przepustowości wymaga również specyficznego montażu w celu uszczelnienia roztworu białka wewnątrz membrany dializacyjnej umieszczonej nad komorą guzika, jak pokazano na Rysunku 1. Ponadto częstym problemem utrudniającym wzrost kryształów są pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną dializacyjną a roztworem białka. Kolejnym ograniczeniem tej metody są wymagania dotyczące próbek, gdyż w porównaniu z metodami dyfuzji par konieczne są znacznie wyższe stężenia i objętości, aby wypełnić guziki do dializy. W związku z tym krystalizacja z użyciem guzików do mikrodializy była postrzegana jako metoda nieatrakcyjna, zwłaszcza w przypadku trudnych obiektów, takich jak białka błonowe, których wydajność oczyszczania jest frustrująco niska. Niedawno opracowano urządzenia mikroprzepływowe ułatwiające krystalizację białek poprzez dializę15. Układy te zostały zaprojektowane tak, aby charakteryzowały się wysoką przejrzystością dla promieni rentgenowskich i niskim tłem, co pozwala na ich wykorzystanie do zbierania danych in situ w temperaturze pokojowej, eliminując tym samym niedogodności związane z wyławianiem i kriochłodzeniem kryształów. Pomimo tych postępów, podejście to wciąż charakteryzuje się bardzo niską przepustowością i jest kosztowne.

Krystalizacja białek metodą mikrodializy; schemat, proces: roztwór białka, membrana dializacyjna, kryształy.
Rysunek 1Schematyczne przedstawienie krystalizacji metodą dializy z użyciem przycisków dializacyjnych. (A) Schematyczny rysunek przycisku do dializy krystalizacyjnej. (BRoztwór białka dodaje się do komory przycisku mikrodializy.CMembrana dializacyjna jest przymocowana do przycisku mikrodializacyjnego za pomocą zastosowanego pierścienia gumowego (o-ringu) poprzez aplikator. (DPrzycisk do dializy jest gotowy do zanurzenia w zbiorniku zawierającym roztwór krystalizacyjny (roztwór do dializy), jak pokazano na (EFiolka zawierająca zanurzony przycisk dializacyjny musi zostać szczelnie zamknięta, aby zapobiec parowaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W niniejszym materiale przedstawiono prosty protokół przesiewania warunków krystalizacji białek oraz wzrostu kryształów z wykorzystaniem 96-dołkowej wysokoprzepustowej płytki do dializy. Jednorazowe płytki te są zaprojektowane do użytkowania w sposób zbliżony do płytek do krystalizacji metodą dyfuzji pary (pipetowanie, a następnie uszczelnienie), co pokazano na Rysunku 2. Płytki mogą pomieścić do 3,2 µL białka i 350 µL roztworu do dializy. Każdy dołek posiada osobną membranę z celulozy regenerowanej, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej między dołkami. Przygotowanie układu zajmuje około 10 min i nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu poza tym, który znajduje się w każdym standardowym laboratorium krystalograficznym. Do zademonstrowania i walidacji tego podejścia jako skutecznej metody wysokoprzepustowej (HTP) krystalografii białek wykorzystano cztery różne białka, w tym dwa białka błonowe.

Układ mikrodializy z krystalizacją przedstawiony na schemacie oraz obrazy mikroskopowe do badania białek.
Rysunek 2: Schemat procesu krystalizacji z wykorzystaniem płytki do mikrodializy. (A) Usunięcie czerwonej adhezyjnej „folii ochronnej”. (B) Nanoszenie kropel białka do poszczególnych dołków na krople. (C) Dołki zostają przykryte UV „folią ochronną”. (D) Płytka zostaje odwrócona w celu dodania roztworów dializy (lub ekranu krystalizacji). (E) Płytka zostaje uszczelniona i poddana inkubacji. (F,G) Inspekcja mikroskopowa kropel. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Zastosowanie protokołu krystalizacji poprzez dializę zademonstrowano przy użyciu rurki dializacyjnej o pojemności 0,5 mL (Rysunek 3) w celu wielkoskalowej (od setek do tysięcy) produkcji mikrokryształów, odpowiednich dla najnowocześniejszych metod zbierania danych, takich jak krystalografia seryjna zarówno w ośrodkach XFEL20,21,22,23,24, jak i w synchrotronach25,26,27, a także dla metod MicroED28,29,30.

Schemat przygotowania do krystalizacji białek; dializa, krystalizacja.
Rysunek 3: Wielkoskalowa krystalizacja mikrodializacyjna z użyciem rurki dializatora. (A) Schematyczne przedstawienie rurki dializatora o pojemności 0,5 mL. (B) Widok z boku zlewki zawierającej roztwór krystalizacyjny i pływającego statywu na rurki, w którym znajduje się rurka dializatora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przygotowanie próbki białka

  1. Przygotować (metodami rekombinacyjnymi lub w inny sposób) i oczyścić białko (białka) będące przedmiotem zainteresowania w odpowiednim buforze (tj. takim, który jest podatny na stabilność białka i krystalizację), który został przefiltrowany za pomocą filtra 0,22 μm (patrz tabela materiałów). Oceń jakość białka (pod względem czystości, polidyspersyjności i stabilności) przed krystalizacją31.
    UWAGA: Proszę zapoznać się z sekcją dotyczącą reprezentatywnych wyników, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat białek i użytych w niniejszym badaniu.
  2. Zagęścić próbkę do 10-50 mg.mL-1 lub więcej (w zależności od docelowego białka) przy użyciu odpowiedniego koncentratora MWCO (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Zagęszczoną próbkę można natychmiast wykorzystać do krystalizacji lub przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C.
  3. Jeżeli białko zostało zamrożone, odwirować próbkę przez 10 minut w wirówce stołowej (≥16 000 × g, w temperaturze pokojowej lub 4 °C) w celu osadzenia i usunięcia wszelkich niepożądanych materiałów (np. osadów).
  4. Porcję białka przelać do czystych probówek PCR o pojemności 200 μl. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, jeśli białko jest niestabilne w temperaturze pokojowej.

2. Ustawianie płytki do mikrodializy

UWAGA: Dostępna na rynku płytka do mikrodializy (patrz Tabela materiałów) składa się z dwóch stron ('strona białkowa' i 'strona buforowa') z membraną z regenerowanej celulozy (dostępnej w różnych MWCO), jak pokazano na Rysunek 2.

  1. Stroną z białkiem skierowaną do góry oderwij i usuń samoprzylepną taśmę maskującą (Rysunek 2A) z podkładki dystansowej kleju o grubości 200 μm. Zwróć uwagę na położenie studni A1.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj maksymalnie 3,2 μl białka (krok 1.4) do każdego dołka (Rysunek 2B).
    UWAGA: Białko można również załadować za pomocą pipety dozującej wielokrotnie. Użycie pipety jednokanałowej jest możliwe, ale zwiększy to prawdopodobieństwo częściowego odwodnienia kropli występującego z powodu wydłużonego czasu ładowania.
  3. Umieść folię ochronną UV o grubości 200 μm (patrz Tabela materiałów) na płytce 96-dołkowej i sprawdź jej integralność (Rysunek 2C). Upewnij się, że folia ochronna jest skierowana do góry.
  4. Użyj łopatki uszczelniającej (patrz Tabela materiałów), dociśnij folię ochronną UV, aby aktywować i uszczelnić klej dociskowy.
  5. Odwróć tabliczkę i zwróć uwagę na położenie studzienki A1. Upewnij się, że płytka jest zorientowana buforem do góry i że pozycje studzienek są lustrzane (Rysunek 2D).
  6. Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj maksymalnie 350 μl roztworu dializacyjnego do każdej ze studzienek (Rysunek 2D).
    UWAGA: Na tym etapie można użyć dostępnych na rynku ekranów krystalizacji (rzadkie ekrany matrycowe) lub laboratoryjnie dostosowanych do potrzeb ekranów (sita siatkowe) (patrz Tabela materiałów).
  7. Ostrożnie uszczelnij studnie za pomocą 'folii pokrywy zbiornika' (patrz Tabela Materiałów) (Rysunek 2E).
  8. Umieścić płytkę (buforem skierowanym do góry) w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (20 °C) w celu uzyskania wzrostu kryształów.
    UWAGA: W przypadku białek wybranych do niniejszego badania, kryształy zaczęły pojawiać się między 1 a 8 godzinami w temperaturze 20 °C.
  9. Aby sprawdzić, czy pod mikroskopem nie ma kryształów, odwróć płytkę, aby podnieść stronę z białkiem do góry i usuń folię ochronną z folii ochronnej UV 200 μm (krok 2.3), jak pokazano na Rysunek 2F,G.

3. Krystalizacja na dużą skalę przy użyciu sond dializatora

UWAGA: Po zbadaniu warunków krystalizacji za pomocą płytki do mikrodializy, krystalizacja białka na dużą skalę (do krystalografii seryjnej lub innych celów) może być przeprowadzona za pomocą rurki dializatora, jak pokazano na Rysunek 3. Podobnie jak płytki do mikrodializy, urządzenia te są dostępne z membranami dializacyjnymi MWCO o mocy 3, 5, 10 i 30 kDa.

  1. Przygotuj zoptymalizowane warunki krystalizacji do wzrostu mikrokryształów w dużych pojemnikach (przyjmując warunki zoptymalizowane przy użyciu płytki do mikrodializy). Upewnij się, że bufor został wcześniej przefiltrowany za pomocą filtra 0,2 μm.
  2. Odpipetuj białko do rurki dializatora (maksymalna objętość 0,5 ml) i uszczelnij koniec za pomocą dołączonej czerwonej plastikowej nakrętki (Rysunek 3A).
  3. Umieść rurkę dializatora o pojemności 500 μl w pojemniku o odpowiedniej wielkości (w zależności od całkowitej objętości roztworu do dializy) zawierającym pływający stojak (patrz tabela materiałów), jak pokazano w Rysunek 3B.
    UWAGA: Pływający stojak dostarczony z zestawem dializatora mieści jednocześnie do 18 rurek dializatora.
  4. Umieścić pojemnik nieruchomo w odpowiednim inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (20 °C) w celu wzrostu kryształów.
  5. Aby sprawdzić, czy nie ma kryształów, odpipetować 1-2 μl roztworu na szkiełko podstawowe. Przykryj drugą szklaną pokrywą, szkiełkiem podstawowym na górze (aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu) i view pod mikroskopem (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Kryształy mogą ulec uszkodzeniu, jeśli zostaną umieszczone między dwoma szkiełkami pokrywy podczas inspekcji. Kryształy można również oglądać bezpośrednio, umieszczając rurkę dializatora pod stereoskopowym mikroskopem o dużym powiększeniu.

Wyniki

Krystalizacji czterech białek, w tym dwóch białek błonowych, dokonano przy użyciu płytki do mikrodializy (z membranami o MWCO 10 kDa). Lizozym z białka jaja kurzego z proszku liofilizowanego (patrz Tabela materiałów) przygotowano w stężeniu 50 mg.mL-1 w 20 mM NaOAc (pH 4,5), a liofilizowaną taumatynę (patrz Tabela materiałów) rozpuszczono w wodzie do końcowego stężenia 25 mg.mL-1. Dwiema białkami błonowymi wykorzystanymi w niniejszym badaniu były pompa efleksu leków wielolekowych AcrB z E. coli oraz transporter laktozy LacY z E. coli. Białko AcrB wyekspresowano przy użyciu komórek C43 (DE3) i oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa Ni-NTA oraz chromatografii żelowej w 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltozydzie (DDM) i 5% (v/v) glicerolu32. Następnie białko skoncentrowano przy użyciu wirówkowego koncentratora o MWCO 100 kDa do końcowego stężenia 6 mg.mL-1. Białko LacY również wyekspresowano w komórkach C43 (DE3), oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa Ni-sepharose, a następnie chromatografii żelowej w 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (w/v) DDM i skoncentrowano za pomocą koncentratora o MWCO 100 kDa do stężenia 10 mg.mL-1 4,33.

W przypadku białek lizozymu i taumatyny 96-dołkowa płytka do mikrodializy została wypełniona przygotowanym w laboratorium ekranem krystalizacji w układzie siatki (grid screen) jako roztworem do dializy, natomiast dla białka błonowego AcrB przygotowano w laboratorium ekran w układzie siatki na podstawie wcześniej opublikowanego warunku krystalizacji34. W przypadku LacY wstępne warunki prowadzące do sukcesu (hit conditions) znaleziono za pomocą komercyjnego ekranu (patrz Tabela materiałów), a następnie zoptymalizowano je za pomocą ekranu w układzie siatki przygotowanego w laboratorium. Stosunek objętości kropli krystalizacyjnych dla lizozymu, taumatyny i AcrB wynosił 1:100, przy zastosowaniu 2 µL białka i 200 µL precypitantu (roztworu do dializy). Krople krystalizacyjne LacY również przygotowano w stosunku 1:100, z zastosowaniem 1 µL białka i 100 µL roztworu do dializy, ze względu na mniejszą ilość dostępnego białka.

Kryształy wszystkich czterech białek, w tym białek błonowych, zaczęły pojawiać się w czasie od 1 do 8 h w temperaturze 20 °C po przygotowaniu płytki do mikrodializy. W tym przypadku nie było konieczności uzupełniania roztworu dializacyjnego o detergent w celu krystalizacji białek błonowych, co jest zazwyczaj praktykowane podczas standardowego procesu dializy w celu zapobiegania agregacji białek błonowych, ponieważ przewidywano, że micele detergentu będą większe niż MWCO membran dializacyjnych35.

Po pomyślnej krystalizacji białek na płytce do mikrodializy (Rysunek 4), odnotowano warunki krystalizacji i przeprowadzono krystalizację na większą skalę metodą dializy, wykorzystując tubę dializacyjną z tymi samymi membranami dializacyjnymi o MWCO 10 kDa. Wewnątrz dializatora urosły tysiące mikrokryształów dla każdego z poszczególnych białek, co przedstawiono na Rysunku 5. W przypadku krystalizacji taumatyny do dializatora wprowadzono 250 µL białka i przeprowadzono dializę przeciwko 50 mL roztworu (stosunek 1:200). Dla AcrB 250 µL białka poddano dializie przeciwko 25 mL roztworu dializacyjnego (1:100). Krystalizację LacY przygotowano również w tym samym stosunku, stosując 100 µL białka na 10 mL roztworu dializacyjnego.

Obrazy z mikroskopii krystalizacji białek przedstawiające wzrost kryształów w różnych warunkach, skala wskazana.
Rysunek 4: Kryształy są hodowane metodą dializy z wykorzystaniem płytki do mikrodializy. Protokół wykazuje przydatność układu dla białek rozpuszczalnych: (A) Lizozym był dializowany przeciwko 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl i 25% (v/v) glicerolu. (B) Taumatyna była dializowana przeciwko 0,1 M Bis-tris propaniu (pH 6,6), 1 M tatranowi K/Na i 18% (v/v) glikolu etylowego. Kryształy uzyskano również dla białek błonowych: (C) AcrB był dializowany przeciwko 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl i 20% (v/v) PEG-400. (D) LacY był dializowany przeciwko 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl i 32% (v/v) PEG-300. Obrazy zarejestrowano za pomocą stereomikroskopu o dużym powiększeniu z polaryzatorem krzyżowym. Paski skali: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces równowagi statycznej z układem spektroskopowym; obrazy mikroskopowe przedstawiające formacje kryształów.
Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy kryształów białek błonowych otrzymanych metodą dializy z wykorzystaniem rurki dializacyjnej. (A) Obraz przedstawiający rurkę wypełnioną mikrokryształami (wskazane czarną strzałką). (B) Obraz mikroskopowy 2 µL zawiesiny kryształów taumatyny otrzymanych przez dializę przy użyciu rurki dializacyjnej 0,5 mL, dializowanej przeciwko 0,1 M Bis-Tris propane (pH 6,6), 1,4 M tartranu K/Na i 18% (v/v) glikolu etylenowego. (C) Obrazy w ciemnym polu (lewo) i jasnym polu (prawo) mikrokryształów AcrB otrzymanych przez dializę przeciwko 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl i 20% (v/v) PEG-400. (D) Obrazy w ciemnym polu (lewo) i jasnym polu (prawo) mikrokryształów LacY otrzymanych przez dializę przeciwko 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl i 32% (v/v) PEG-300. Obserwuje się niektóre osady. Paski skali: (B,D) = 200 µm; (C) = 500 µm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Obecnie krystalizacja przez dializę jest najbardziej niewykorzystaną metodą krystalizacji, a mianowicie ze względu na niską przepustowość i żmudny charakter istniejących metod, takich jak mikrodializa za pomocą guzików. W tym przypadku prosty, ale solidny protokół podąża za przepływem pracy HTP do wzrostu kryształów białka poprzez dializę za pomocą dostępnej na rynku płytki do mikrodializy i rurki dializatora. W zależności od białka docelowego, płytka do mikrodializy i rurka dializatora używane w procedurze są dostarczane z wyborem membrany dializacyjnej o MWCO 3, 5, 10 lub 30 kDa. Protokół można łatwo skonfigurować w dowolnym standardowym zakładzie krystalizacji i ma tę wielką zaletę, że można go stosować zarówno do białek rozpuszczalnych, jak i błonowych. Jednak kompleksy białko-białko i białko-kwas nukleinowy nie były testowane podczas tego protokołu.

Podobnie jak w przypadku każdej metody krystalizacji za pomocą dializy, stosunek objętości między próbką białka a roztworem do dializy ma kluczowe znaczenie. W tym protokole zalecany jest stosunek 1:100 między próbką a roztworem do dializy, ale ponieważ płytka do mikrodializy pozwala na maksymalną pojemność 350 μl roztworu do dializy, proporcje te można zbadać w celu uzyskania trafień kryształów. W prezentowanym protokole wykorzystuje się objętość 1-2 μL białka przy ustawianiu płytek krystalizacyjnych. Ma to na celu zapewnienie dokładnego ustawiania kropli za pomocą ręcznej pipety wielokanałowej. Dzięki zastosowaniu pipet elektronicznych (pipet wielokanałowych lub wielokrotnych dozowników) lub robotów dozujących ciecze HTP, można dokładnie uzyskać krople o mniejszych objętościach, zmniejszając w ten sposób ilość wymaganego białka. Ponadto, ze względu na stosunkowo niewielkie objętości buforu dializacyjnego wymaganego przez płytkę do mikrodializy (w przeciwieństwie do innych konwencjonalnych metod dializy), możliwe jest (bez nadmiernego wykorzystania zasobów) badanie dużych przestrzeni chemicznych, nie tylko przy użyciu dostępnych na rynku ekranów krystalizacji, ale także ekranów optymalizacyjnych (zaprojektowanych wokół początkowego warunku osiągnięcia krystalizacji).

Krytycznym krokiem w przedstawionej procedurze HTP jest terminowe podanie małych objętości białka (0,50-3,2 μl na warunek) na płytkę dializacyjną w celu ograniczenia odwodnienia i utraty próbki. Można to łatwo złagodzić, stosując pipetę wielokanałową, pipetę do wielokrotnego dozowania lub zrobotyzowany system krystalizacji. Długi czas inkubacji, wynoszący ponad 2 tygodnie, płytek w temperaturze 20 °C może prowadzić do odwodnienia kropelek białka lub uszkodzenia niedawno utworzonych kryształów. Przechowywanie płytek dializacyjnych w komorze nawilżania lub zamykanej torbie może złagodzić ten efekt. Ponadto zaleca się stosowanie sterylnych materiałów i technik, aby uniknąć rozwoju bakterii.

Jak wspomniano we wprowadzeniu, ostatnio, wraz ze zwiększoną potrzebą zrozumienia dynamiki strukturalnej białek dla mechanizmów chorobowych, interakcji wiązania białko-ligand i interakcji białko-białko, dziedzina krystalografii rentgenowskiej białek została zrewolucjonizowana poprzez rozwój nowych i istniejących technik krystalizacji, nowoczesnych podejść do dostarczania próbek kryształów, nowych generacji źródeł promieniowania rentgenowskiego oraz nowych wyrafinowanych metod pozyskiwania i przetwarzania danych36,37,38. W związku z tym pojawienie się seryjnej mikrokrystalografii w temperaturze pokojowej, wykonywanej przy użyciu XFEL lub synchrotronowych źródeł światła, stało się niezwykłym narzędziem w biologii strukturalnej, szczególnie w dziedzinie białek błonowych39. Jednak do wygenerowania wystarczającej ilości danych dla solidnego rozwiązania strukturalnego potrzebne są tysiące mikrokryształów, co nie jest łatwym zadaniem (przynajmniej przy użyciu konwencjonalnych metod krystalizacji). Opisana tutaj metoda krystalizacji dializ umożliwia wytworzenie dużej liczby mikrokryształów. Po określeniu warunków krystalizacji do produkcji mikrokryształów (1-10 μm) za pomocą płytki do mikrodializy, za pomocą dializatora o pojemności 0,5 ml można wytworzyć duże ilości mikrokryształów o dużej gęstości (rysunek 5). Kryształy te idealnie nadają się do zbierania danych za pomocą stałych celów lub systemów dostarczania próbek strumieniem cieczy27, Lokal mieszkalny 40. Kryształy uzyskane tą metodą mogą być również odpowiednie do zastosowań MicroED. Jednak mogą one wymagać zmielenia do odpowiedniego rozmiaru i grubości dla tego konkretnego zastosowania, ponieważ elektrony oddziałują z kryształami znacznie silniej niż fotony promieniowania rentgenowskiego41.

Podsumowując, opisane tutaj podejście do krystalizacji przez dializę uzupełnia rozwijające się strategie krystalizacji białek w celu określenia struktury i rozszerza zakres wysiłków, które można zastosować do określenia nowych celów białkowych, które wcześniej nie były skuteczne przy użyciu innych konwencjonalnych metod.

Oświadczenia

Współautorzy, Pascelle Draper i Paul Reardon, są zatrudnieni przez SWISSCI.

Podziękowania

Potwierdzamy finansowanie z brytyjskiego Departamentu Biznesu, Energii i Strategii Przemysłowej (BEIS). Dziękujemy Alexowi R. Jonesowi i Mike'owi Shawowi z National Physical Laboratory za ich opinie na temat manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 0,2 mlThermo ScientificAB0620Do porcjowania roztworów białkowych.
0,2 &mikro; m filtr strzykawkowySartorius17823----------KFiltry z octanu celulozy bez środków powierzchniowo czynnych. Do filtrowania roztworów dializacyjnych.
0,22 &mikro; m Filtry membranoweMilliporeGSTF04700Filtry membranowe do filtrowania dużych ilości
12-kanałowy, zmienny 0,5 – 10 µ L Research plus pipetaEppendorf3125000028Do dozowania kropli białkowych na Diaplate.
12-kanałowy, zmienny 30 – 300 µ L Pipeta Eppendorf Research plus Eppendorf3125000060Do dozowania roztworów dializacyjnych do zbiorników Diaplate.
Strzykawka 20 mlFisherbrand15889152Do stosowania z filtrami strzykawkowymi.
96-dołkowe płytki głębinowe 2,2 mlThermo ScientificAB0788Polipropylenowe płytki do przechowywania głębokich; do przygotowania sit przy użyciu Hamilton Microlab STARlet.
Wirówka 5425Eppendorf5405000565Z wirnikiem FA-24x2 o maksymalnej sile g 21 300 x g.
Diakondializator SWISSCIW72010Rurki dializatora z membraną z regenerowanej celulozy o granicy masy cząsteczkowej 10 kDa. Idealny do roztworów białkowych o pojemności do 0,5 ml.
Diaplate 96-dołkowa płytkaSWISSCIW82010Płytka do mikrodializy. Diaplate składa się z dwóch stron, pomiędzy którymi znajduje się membrana z regenerowanej celulozy o wartości granicznej masy cząsteczkowej 10 kDa.
Probówka wirówkowa Falcon 50 mL High Clarity PPCorning352070Do przechowywania roztworów dializacyjnych.
Stojak pływającySWISSCIn/aWchodzi w skład zestawu Diacon
Inkubator stojący bez wibracjiMolecular DimensionsMD5-01Inkubator o pojemności 400 l z kontrolowaną temperaturą ustawioną na 20 stopni C.
Mikroskop stereoskopowy Leica M205 CLeicaPlanapo 1,0x, zakres zoomu 7,8x i ndash; 160x z kamerą DMC 4500
Lizozym z białka jaja kurzegoSigma Aldrich62971Liofilizowane białko
Memgold2Wymiary molekularneMD1-64Ekran z rzadką matrycą
Microlab STARletHamiltonn/aSystem obsługi cieczy.
Folia pokrywy zbiornikaSWISSCIn/aZawarta w zestawie Diaplate
Filtr butelkowy wielokrotnego użytkuThermo ScientificDS0320-5045Do montażu dużych ilości, do stosowania z 0,22 i mikro; m Filtry membranowe
Łopatka uszczelniającaSWISSCIn/aZawarte w zestawie Diaplate
Thaumatin od Thaumatococcus danielliiSigma AldrichT7638Liofilizowana
folia osłonowa UVSWISSCIn/aZawarta w zestawie Diaplate
Obiektyw białkowa

Bibliografia

  1. Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. The nobel science: One hundred years of crystallography. Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).
  2. Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), (2020).
  3. Kwan, T. O. C., Axford, D., Moraes, I. Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).
  4. Birch, J., et al. The fine art of integral membrane protein crystallisation. Methods. 147, 150-162 (2018).
  5. Gorrec, F., Löwe, J. Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology. Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).
  6. Govada, L., Chayen, N. E. Choosing the method of crystallization to obtain optimal results. Crystals. 9 (2), 106(2019).
  7. Chayen, N. E. Turning protein crystallisation from an art into science. Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).
  8. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  9. Gulbis, J. Protein crystallography: methods and protocols. Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).
  10. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  11. Shaw Stewart,, D, P., Kolek, S. A., Briggs, R. A., Chayen, N. E., Baldock, P. F. Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
  12. Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).
  13. Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).
  14. Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova-Spano, M. Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).
  15. Jaho, S., et al. Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  16. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. Journal of Visualized Experiments. 49, 2501(2011).
  17. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).
  18. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).
  19. Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).
  20. Neutze, R., Wouts, R., Vander Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  21. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).
  22. Mizohata, E., Nakane, T., Fukuda, Y., Nango, E., Iwata, S. Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology. Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).
  23. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  24. Johansson, L. C., et al. XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity. Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).
  25. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).
  26. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature communications. 8 (1), 542(2017).
  27. Axford, D., et al. Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).
  28. Nannenga, B. L., Gonen, T. The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED). Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).
  29. Nguyen, C., Gonen, T. Beyond protein structure determination with MicroED. Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).
  30. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).
  31. Kwan, T. O. C., et al. Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605(2019).
  32. Pos, K. M., Purification Diederichs, K. crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).
  33. Guan, L., Mirza, O., Verner, G., Iwata, S., Kaback, H. R. Structural determination of wild-type lactose permease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).
  34. Kwan, T. O. C., Reis, R., Moraes, I. In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study. Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).
  35. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).
  36. Wickstrand, C., et al. A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 7 (2), 024701(2020).
  37. Orville, A. M. Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs. Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).
  38. Schulz, E. C., Yorke, B. A., Pearson, A. R., Mehrabi, P. Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).
  39. Neutze, R., Brändén, G., Schertler, G. F. Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers. Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).
  40. Wierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).
  41. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krystalizacja metod mikrodializywysokoprzepustowe przesiewaniep ytka 96 do kowap ytka dializacyjnawzrost kryszta wkrystalografia seryjnabia ka b onowekrystalografia rentgenowskatworzenie mikrokryszta w
Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.