In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia eksperyment migracji in vitro odpowiedni do analizy funkcjonalnej cząsteczek biorących udział w migracji in vivo komórek grzebienia nerwowego do bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej.

Streszczenie

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to wysoce migrujące komórki, które pochodzą z grzbietowej części cewy nerwowej. Emigracja NCC z cewy nerwowej jest procesem niezbędnym do produkcji NCC i ich późniejszej migracji w kierunku miejsc docelowych. Droga migracyjna NCC, w tym otaczające tkanki cewy nerwowej, obejmuje macierz zewnątrzkomórkową bogatą w hialuronian (HA). Aby modelować migrację NCC do tych bogatych w HA otaczających tkanek z cewy nerwowej, w tym badaniu ustalono mieszany test migracji substratów składający się z HA (średnia masa cząsteczkowa: 1,200-1,400 kDa) i kolagenu typu I (Col1). Ten test migracji pokazuje, że komórki linii komórkowej NCC, O9-1, są silnie migrujące na mieszanym podłożu i że powłoka HA ulega degradacji w miejscu ogniskowych zrostów w trakcie migracji. Ten model in vitro może być przydatny do dalszego badania mechanistycznych podstaw związanych z migracją NCC. Protokół ten ma również zastosowanie do oceny różnych substratów jako rusztowań do badania migracji NCC.

Wprowadzenie

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to multipotencjalna populacja komórek, która jest obecna w rozwijających się zarodkach i pochodzą z granicy płytki nerwowej podczas neurulacji. Przyczyniają się do tworzenia różnych tkanek, w tym obwodowego układu nerwowego, układu sercowo-naczyniowego, tkanek twarzoczaszki i szkieletu¹. Po indukcji i specyfikacji NCC na granicy płytki nerwowej, NCC emigrują z nabłonka nerwowego i migrują w kierunku miejsc tkankowych pochodzących z NCC¹.

Hialuronan (HA) to niesiarczanowy glikozaminoglikan rozprowadzany w różnych tkankach jako składnik macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Znaczenie kwasu hialuronowego w rozwoju zarodka wykazano w systemach modelowych poprzez ablację genów odpowiedzialnych za metabolizm kwasu hialuronowego. Na przykład stwierdzono, że mutacje w genach syntazy hialuronianu (Has1 i Has2) u Xenopus prowadzą do wad migracji NCC i wad rozwojowych twarzoczaszki². Ponadto donoszono, że proteoglikany wiążące HA, aggrekan i versican, wywierają hamujący wpływ na migrację NCC³. U myszy ablacja Has2 prowadzi do poważnych defektów w tworzeniu poduszki wsierdziowej, co skutkuje śmiertelnością w połowie ciąży (E9.5-10)^4,5,6.

Niedawno wykazano, że białko transbłonowe 2 (Tmem2), hialuronidaza powierzchniowa komórki, odgrywa kluczową rolę w promowaniu adhezji i migracji komórek rakowych za pośrednictwem integryn poprzez usuwanie HA związanego z macierzą w miejscach adhezji^7,8. Niedawno Inubushi i in.⁹ wykazali, że niedobór Tmem2 prowadzi do poważnych wad twarzoczaszki z powodu nieprawidłowości w emigracji/migracji NCC i przeżyciu. W poprzednim badaniu⁹, wyrażenie Tmem2 było analizowane podczas tworzenia i migracji NCC. Ekspresję Tmem2 zaobserwowano w miejscu delaminacji NCC oraz u emigrujących Sox9-dodatnich NCC (Rysunek 1). Dodatkowo, wykorzystując mysie komórki grzebienia czubienia O9-1 zubożone w Tmem2, badanie wykazało, że ekspresja Tmem2 in vitro była niezbędna do tworzenia przez komórki O9-1 zrostów ogniskowych i ich migracji do substratów zawierających HA (Rysunek 2 i Rysunek 3) < klasa sup = "xref">9.

Te wyniki zdecydowanie wskazują, że Tmem2 jest również ważny dla adhezji i migracji NCC przez ECM bogaty w HA. Jednak molekularny mechanizm adhezji i migracji NCC w ECM bogatym w HA jest nadal niejasny. W związku z tym konieczne jest ustanowienie systemu eksperymentalnego hodowli in vitro, aby w pełni zbadać adhezję i migrację NCC w obrębie ECM bogatego w HA.

Spośród licznych podejść stosowanych do testowania migracji komórek, test oparty na zamykaniu ran komórkowych jest prostą metodą często używaną w dziedzinie fizjologii i onkologii¹⁰. Podejście to jest użyteczne ze względu na jego znaczenie dla fenotypu in vivo i jest skuteczne w określaniu ról leków i chemoatraktantów podczas migracji komórek¹¹. Możliwe jest oszacowanie zdolności migracyjnej zarówno całych mas komórek, jak i pojedynczych komórek, mierząc odległości między komórkami w czasie¹¹. W tym manuskrypcie wprowadzono zmodyfikowany test oparty na zamykaniu ran in vitro w celu modelowania migracji NCC do tkanek bogatych w kwas hialuronowy otaczających cewę nerwową. Procedura ta ma również zastosowanie do badania różnych składników ECM (tj. kolagenów, fibronektyny i lamininy) w celu analizy roli rusztowania ECM w migracji NCC.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Wyższej Szkoły Stomatologii Uniwersytetu w Osace.

1. Hodowla komórek grzebienia nerwowego czaszki myszy

UWAGA: Linia komórkowa grzebienia nerwowego użyta w tym badaniu składa się z komórek O9-1, pierwotnie pochodzących z Wnt1-Cre; Komórki wykazujące ekspresję R26R-GFP wyizolowane z mysich zarodków E8.5¹² (patrz dyskusja). Opisana tutaj metoda hodowli komórek O9-1 jest zgodna z wcześniej ustalonym protokołem¹³.

1. Przygotuj płytę pokrytą matrycą membrany podstawnej.
   1. Rozmrozić matrycę błony podstawnej (patrz tabela materiałów) na lodzie. Rozcieńczyć matrycę w stosunku 1:50 w schłodzonym 1x PBS i trzymać na lodzie.
   2. Pokryć 10-centymetrową płytkę hodowlaną 10 ml rozcieńczonego roztworu macierzy błony podstawnej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i odessać matrycę przed użyciem.
   3. Umyj płytkę 3x 2 ml PBS.
2. Hodowla komórek O9-1 na płytce pokrytej matrycą błony podstawnej.
   1. Ogrzać kompletną pożywkę z embrionalnych komórek macierzystych (ES) (patrz tabela materiałów) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   2. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórek O9-1 (patrz tabela materiałów) i policzyć liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów). Dostosuj stężenie komórek do 1,1 × 10⁶/ml za pomocą kompletnej pożywki komórkowej ES.
   3. Dodać 8 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki komórkowej ES do pokrytej matrycą płytki hodowlanej o średnicy 10 cm i wysiewać komórki O9-1 w proporcji 1,1 x 10⁶ komórek/płytkę. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 .}
   4. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę świeżą, kompletną pożywką z komórek ES (wstępnie podgrzaną do temperatury 37 °C). Następnie wymieniaj na świeże podłoże co 2-3 dni.
      UWAGA: Gdy komórki są w około 80% zlewające się (3-4 dni po posiewie, można je zdysocjować za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i dalej pasażować lub zamrozić do późniejszego wykorzystania. Reprezentatywne obrazy komórek O9-1 są pokazane w Rysunek 1.
   5. Umyj płytkę hodowlaną 2 ml 1x PBS przed trypsynizacją. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdzić, czy komórki zostały całkowicie oderwane; W razie potrzeby delikatnie postukaj kilka razy w bok talerza.
   6. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki z komórek ES do płytki hodowlanej i przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 5 minut.
   7. Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego. Następnie dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki z kompletnymi komórkami ES do probówki i dokładnie zawiesić komórki przez pipetowanie. Zasiaj komórki na nowej płytce hodowlanej o pożądanej gęstości komórek.
   8. Alternatywnie, należy przygotować zamrożony wywar komórkowy, dodając 1 ml pożywki do zamrażania komórek zawierającej 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) do probówki w miejsce kompletnej pożywki z komórek ES i dokładnie zawieszając komórki. Przenieść zawiesinę komórek do probówek kriogenicznych i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie dania z HA/Col1

UWAGA: Oryginalna metoda powlekania HA/Col1 na naczyniach ze szklanym dnem została zaproponowana przez Irie et al.⁷.

1. Ostrożnie dodać 50 μl nierozcieńczonego trietoksysilanu do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 3,5 cm (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i chronić przed światłem.
   UWAGA: Inkubacja z trietoksysilanem nie powinna przekraczać 5 minut. Może to wpłynąć na wydajność powlekania i wytworzyć niepożądane produkty.
2. Umyj naczynie szybko 3x 2 ml wody destylowanej. Dodać 50 μl 0,25% aldehydu glutarowego, rozcieńczonego 100x w PBS, na miskę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
3. Umyj szybko 4x 2 ml PBS. Następnie obtocz naczynia w 300 μl kolagenu typu I w 0,2 N kwasie octowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
4. Umyj szybko 3x 2 ml PBS. Dodać 300 μl 200 μg/ml hialuronianu sodu-H2 znakowanego fluoresceinaminą (FAHA-H2) (rozcieńczonego w PBS) do każdego naczynia i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Umyć ponownie 3x z 2 ml PBS. Po zassaniu PBS należy suszyć płytkę na powietrzu przez 5 minut na czystej ławce.
   UWAGA: FAHA-H2 jest hialuronianem sodu znakowanym fluoresceinaminą o średniej masie cząsteczkowej w zakresie 1,200-1,600 KDa. Kwas hialuronowy o odpowiedniej masie cząsteczkowej może być stosowany zgodnie z projektem badawczym.

3. Test migracji na szalce pokrytej HA/Col1

UWAGA: Test oparty na zamykaniu ran przy użyciu zdefiniowanych 500 μm bezkomórkowych luk w substratach Col1/HA został przeprowadzony przy użyciu 2-dołkowych wkładek do hodowli (patrz Tabela Materiałów). Komórki O9-1 wyrażają Tmem2, który jest wymagany do adhezji i degradacji HA w przestrzeni zewnątrzkomórkowej⁹ (Rysunek 2 i Rysunek 3).

1. Po wysuszeniu powlekanego naczynia ze szklanym dnem przymocuj 2-dołkowe wkładki hodowlane do naczyń i napełnij wkładki zewnętrznie 1 ml PBS.
2. Wysiewaj komórki O9-1 do studzienek w proporcjach 1 x 10⁴ komórki w 100 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na wkładkę. Hodować komórki przez 2 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 .}
3. Ostrożnie wyjmij wkładki z powlekanych naczyń ze szklanym dnem za pomocą pęsety. Delikatnie umyj powlekane naczynia ze szklanym dnem 2 ml 1x PBS, aby usunąć komórki i resztki komórek. Dodaj 2 ml świeżego DMEM zawierającego 2% FBS do naczyń hodowlanych.
4. Rejestruj obrazy z kontrastem fazowym teraz jako punkt początkowy za pomocą uniwersalnego mikroskopu fluorescencyjnego w trybie monochromatycznym z ustawieniami wysokiej rozdzielczości (wzmocnienie przy 6 dB, bez binningu). W tym badaniu do obrazowania użyto soczewek obiektywowych o powiększeniach od 4x do 20x (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Uchwyć obrazy kontrastu fazowego z odpowiednimi paskami skali i zapisz je w formacie TIFF.
5. Hodować komórki przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Rejestruj obrazy z kontrastem fazowym po 24 godzinach i 48 godzinach w hodowli za pomocą uniwersalnego mikroskopu fluorescencyjnego.
6. Utrwalić komórki po 48 godzinach za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj naczynia 3x po 5 minut z 1 ml świeżego PBS.
7. Umieścić szkiełko nakrywkowe z podłożem montażowym (patrz tabela materiałów) w celu dalszej obserwacji morfologicznej.
   UWAGA: Naczynia można natychmiast zobrazować lub przechowywać do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.
8. Opcjonalnie: Znakuj immunologicznie komórki pod kątem interesujących ich białek.
   UWAGA: Protokół wykrywania kompleksu adhezji ogniskowej (FA) za pomocą mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-winkuliny (patrz tabela materiałów) jest opisany tutaj jako przykład.
   1. Inkubować szalki (od kroku 3.6) z 0,5 ml buforu blokującego (5% normalnej surowicy koziej w PBS) przez 60 min.
      UWAGA: Należy wybrać odpowiedni bufor blokujący dla przeciwciała pierwszorzędowego. Typowym buforem blokującym byłoby 5% normalnej surowicy tego samego gatunku, co zastosowane przeciwciało drugorzędowe.
   2. Przygotować rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe w buforze do rozcieńczania przeciwciał (1% normalna surowica kozia w PBS). Inkubować szalki z 0,5 ml rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Należy wybrać odpowiedni bufor do rozcieńczania przeciwciał. Zazwyczaj przeciwciało stosuje się w rozcieńczeniu 1:50-1:200.
   3. Płukać 3x przez 5 minut każdy po 2 ml PBS. Przygotować rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysim pochodzącemu z kóz w buforze do rozcieńczania przeciwciał (1% normalna surowica kozia w PBS). Inkubować szalki z 0,5 ml rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego przez 1-3 godziny w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Zazwyczaj przeciwciało drugorzędowe stosuje się w rozcieńczeniu 1:500-1:1,000. DAPI może być używany do barwienia jąder.
   4. Płukać 3x 2 ml PBS przez 5 minut za każdym razem. Umieścić szkiełko nakrywkowe z 50 μl podłoża montażowego.
      UWAGA: Naczynia można obrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego typu "wszystko w jednym" z filtrem GFP (wzbudzenie: 470/40, emisja: 525/50) i filtrem TexasRed (wzbudzenie: 560/40, emisja: 630/75) w trybie monochromatycznym z ustawieniami wysokiej rozdzielczości (wzmocnienie na poziomie 6 dB, bez binningu). Do obrazowania w tym badaniu użyto soczewek obiektywowych o powiększeniach od 4x do 20x.
      UWAGA: Szkiełko można przechowywać do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.

4. Analiza danych

1. Otwórz oprogramowanie ImageJ 1.51s. W oknie ImageJ wybierz Plik > Otwórz z paska menu, aby otworzyć zapisany plik obrazu.
2. Aby ustawić skalę pomiaru, narysuj linię o tej samej odległości co podziałka liniowa. Przejdź do pozycji Analizuj > Ustaw skalę i wpisz znaną odległość oraz jednostki linii w odpowiednich polach w oknie Ustaw skalę.
3. Narysuj linię prostą między odstępami między komórkami i naciśnij Analizuj > Zmierz, aby przenieść wartości do okna danych. Zmierz co najmniej pięć różnych pozycji w każdej próbce i uśrednij odległości, aby uzyskać reprezentatywne dane próbki. Analizy statystyczne należy wykonywać przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów).

Wyniki

Przeprowadzono analizę migracji na mieszanych podłożach składających się z Col1 i wysokocząsteczkowego HA (średnia masa cząsteczkowa: 1 200-1 400 kDa) zgodnie z opisanym tutaj protokołem. Stwierdzono, że komórki O9-1 znajdujące się na brzegu przerwy łatwo migrują do obszaru przerwy bogatego w HA (Rysunek 4). Immunobarwienie na marker FA, winculinę¹⁴, potwierdziło, że komórki O9-1 tworzą adhezje ogniskowe (FA) w miejscach degradacji HA (Rysunek 5

Dyskusja

Różne komponenty ECM regulują emigrację/migrację NCC. Na przykład HA pozytywnie reguluje migrację NCC ^2,15. Co ciekawe, badanie oparte na genetycznych mysich modelach Tmem2, hialuronidazy powierzchniowej komórki, wyjaśniło wymóg degradacji HA w migracji NCC⁹. Kolageny są również obfite w ECM otaczającym cewę nerwową¹⁶. Wykazano, że Decorin, mały proteoglikan bogaty w leucynę, reguluje migrację NCC podczas rozwoju ne...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynie do hodowli komórkowych 10cm	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. Nie. BSS-1005-B
2-dołkowe wkładki hodowlane	ibidi	Cat. Nr 80209
Alexa 555 kozi anty-mysi IgG	Invitrogen Cat	. A21422	przeciwciał wtórnych przeciw mysim przeciwciałom anty-mysim pochodzącym z kozy
	Bio-Rad	Cat. Nie. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Kat. 11910	Medium do zamrażania komórek
kolagen typu I	Sigma	Cat. Nr 08-115
Kompletny ES Cell Medium	Millipore	Cat. Nie. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Kat. 10184322
Dulbecco" s Zmodyfikowany Orzeł Średni	Gibco	Kat. 11971025
Surowica bydlęca płodu	Gibco	Kat. 10270106
mikroskop fluorescencyjny	Keyence	Cat. Nie. BZ-X700
Fluoresent z oznaczeniem HA	PG Research	FAHA-H2
Szklane naczynie dolne	Iwaki	Kat. 11-0602
aldehyd glulowy	Sigma	Kat. Nr G5882
Matrigel	Fisher	Kat. Nie. CB-40234
Monoklonalne przeciwciało antywinkulinowe przeciwko macierzy	Sigma	Cat. Nie. V9264
nośnik montażowy	Dako	S3023
Normalna surowica kozia	Fisher	Cat. 50062Z
Komórki O9-1	Millipore	Cat. Nie. SCC049
Paraformaldehyd	Sigma	Kat. 158127
trietoksysilan	Sigma	Cat. Nr 390143
trypsyna-EDTA	Millipore	Cat. Nie. SM-2003-C

Automatyczny licznik komórek , podstawnej