Artykuł metodologiczny

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

DOI:

10.3791/64750

⸱

20 października 2023

 ,  , 
1Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay, 2Inserm U1280, 3Imagerie-Gif, Light Microscopy Facility, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miejsca kontaktu z błoną (MCS) to obszary o bliskiej bliskości błony, które umożliwiają i regulują dynamiczną wymianę różnych biomolekuł (tj. wapnia i lipidów) między zestawionymi organellami bez angażowania fuzji błonowej. MCS są niezbędne dla homeostazy komórkowej, a ich funkcje są zapewnione przez rezydentne składniki, które często występują jako multimeryczne kompleksy białkowe. MCS często obejmują retikulum endoplazmatyczne (ER), główne miejsce syntezy lipidów i magazynowania wapnia w komórkach, i są szczególnie ważne dla organelli, takich jak mitochondria, które są wykluczone z klasycznych szlaków transportu pęcherzykowego. W ostatnich latach MCS między ER a mitochondriami były szeroko badane, ponieważ ich funkcje silnie wpływają na metabolizm komórkowy/bioenergetykę. W tych miejscach kontaktu zaczęto identyfikować kilka białek, w tym pęta błonowe, kanały wapniowe i białka przenoszące lipidy, co zwiększa zapotrzebowanie na nowe metodologie i podejścia techniczne do badania tych składników MCS. W tym miejscu opisujemy protokół składający się z połączonych podejść technicznych, które obejmują test ligacji zbliżeniowej (PLA), barwienie mitochondriów i segmentację obrazowania 3D, która umożliwia wykrycie białek, które są fizycznie blisko siebie (>40 nm) i które znajdują się na tej samej błonie w MCS ER-mitochondriów. Na przykład użyliśmy dwóch zakotwiczonych w ER białek transferu lipidów, ORP5 i ORP8, które, jak wykazano wcześniej, oddziałują i lokalizują się w MCS mitochondriów ER-mitochondriów i błony plazmatycznej ER. Łącząc PLA ORP5-ORP8 z analizą oprogramowania do obrazowania komórek, możliwe było oszacowanie odległości kompleksu ORP5-ORP8 od powierzchni mitochondriów i określenie, że około 50% interakcji ORP5-ORP8 PLA zachodzi w subdomenach ER w bliskiej odległości od mitochondriów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja między organellami jest cechą charakterystyczną komórek eukariotycznych. Jednym ze sposobów, w jaki organelle komunikują się, jest tworzenie miejsc kontaktu z błoną (MCS), które są bliskimi opozycjami błonowymi między dwiema organellami, które są utrzymywane przez białka strukturalne i funkcjonalne, takie jak pęta, białka przenoszące lipidy i kanały wapniowe1. MCS mogą powstawać między podobnymi lub różnymi organellami i pośredniczą w wymianie składników komórkowych, co jest ważne dla utrzymania homeostazy komórkowej. Do tej pory zidentyfikowano kilka MCS, w tym mitochondria retikulum endoplazmatycznego (ER), błonę plazmatyczną ER (PM) i kontakty z kroplami lipidów (LD) ER1. Wśród nich te utworzone między ER a mitochondriami (MERCS) są jednymi z najlepiej przebadanych, ponieważ biorą udział w regulacji kilku funkcji komórkowych, w tym homeostazy lipidów i wapnia2. Ponieważ mitochondria są w dużej mierze wykluczone z klasycznych szlaków transportu pęcherzykowego, polegają na MERCS i ich składnikach molekularnych w celu importu kluczowych lipidów lub prekursorów lipidów z ER. Niepęcherzykowy transport tych lipidów przez MERCS zapewnia utrzymanie prawidłowego składu lipidów mitochondrialnych, a także ich integralności funkcjonalnej i strukturalnej3.

Biorąc pod uwagę kluczowe znaczenie MCS w różnych funkcjach komórkowych, zainteresowanie głębszym zrozumieniem ich molekularnych składników znacznie wzrosło w ostatnich latach. W celu pogłębienia wiedzy na temat MCS zastosowano kilka rodzajów podejść opartych na obrazowaniu. Wśród nich test ligacji zbliżeniowej oparty na sondzie fluorescencji (PLA) jest szeroko stosowany jako wskaźnik obfitości MCS poprzez wykrywanie interakcji białko-białko między organellami (w zakresie wykrywania 40 nm) na poziomach endogennych4. Na przykład MERCS zostały zwizualizowane i określone ilościowo za pomocą PLA między kilkoma parami białek mitochondria-ER, w tym VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 i PTPIP51-VAPB5,6,7,8. Chociaż technologia ta została wykorzystana do wykrywania i ilościowego określania interakcji białko-białko między organellami, które są obecne w klasie MCS5,7,9,10,11, większość badań nie łączyła PLA z barwieniem organelli. W związku z tym nie opracowano jeszcze metody ilościowej, która pozwala na pomiar bliskości między oddziaływaniami PLA a powiązanymi organellami. Tak więc, do tej pory, w przypadku białek ER, ich interakcja w obrębie subdomen błonowych w kontakcie z innymi organellami nie została odróżniona od ich interakcji w obrębie szeroko rozpowszechnionej sieci ER.

Tutaj opisujemy protokół do wykrywania interakcji PLA między białkami rezydującymi w błonie tych samych organelli i do analizy ich bliskości do błony organelli partnerskiej w MCS. Protokół ten został opracowany w oparciu o dwie przesłanki: 1) wcześniejsze badania wykazały, że w warunkach nadekspresji białka przenoszące lipidy ER ORP5 i ORP8 kolokalizują się i oddziałują w mitochondriach ER-mitochondriów i ER-PM MCSs12,13,14,15 i że ORP5 lokalizuje się w kontaktach ER-LD16,17; 2) istniejące technologie, w tym PLA, mikroskopia konfokalna, znakowanie organelli i analiza obrazowania 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Barwienie mitochondrialne i test ligacji zbliżeniowej (PLA)

  1. Płytka 0,5 x 105-2 x 105 komórek HeLa, utrzymywanych w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% aminokwasów endogennych w temperaturze 37 °C z 5% CO2, w szkiełkach nakrywkowych o średnicy 13 mm w płytkach 1,5 w 24 dołkach w rozcieńczeniu umożliwiającym zbieżność komórek w 75%-90% w dniu zabiegu.
    UWAGA: Warto zauważyć, że komórki HeLa można poddać dodatkowym zabiegom, takim jak leczenie siRNA i/lub transfekcja plazmidu DNA, przed barwieniem mitochondriów i PLA.
  2. Barwienie mitochondriów
    1. Umyć komórki raz w pożywce niezawierającej surowicy, wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C. Inkubować komórki z podgrzaną pożywką bez surowicy przez 10 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. Przygotować 1 μM czerwonego markera mitochondrialnego we wstępnie podgrzanym podłożu bez surowicy.
    3. Inkubować komórki z 500 μl mitochondrialnego roztworu markerowego przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Podczas leczenia markerami mitochondrialnymi i następujących po nim etapów protokołu, utrzymuj komórki na szkiełkach nakrywkowych chronione przed światłem w jak największym stopniu.
    4. Po inkubacji umyj komórki 1x we wstępnie podgrzanej pożywce wolnej od surowicy i 2x w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, ponieważ długie etapy mycia przed utrwaleniem mogą wpłynąć na morfologię mitochondriów.
    5. Usuń 1x PBS z szkiełek nakrywkowych i utrwal komórki, inkubując je w świeżo przygotowanym 4% PFA (w 1x PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej (w ciemności) pod kapturem chemicznym. Myć 3x przez 2 minuty w 500 μL 1x PBS (przy użyciu jednorazowych pipet lub systemu próżniowego podłączonego do pompy).
    6. Usunąć 1x PBS i inkubować szkiełka nakrywkowe z 500 μL 50mM NH4Cl przez 15 minut w temperaturze pokojowej (w ciemności). Myć 1x przez 2 minuty w 500 μL 1x PSB za pomocą systemu próżniowego.
    7. Przemyć 3x przez 2 minuty w 500 μL buforu blokującego 1 (BB1, 1%BSA, 0,1% saponiny w 1x PBS) dla ORP5-ORP8 PLA lub buforu blokującego 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% normalna surowica kozia, 0,1 saponiny w 1x PBS) dla ORP8-PTPIP51 PLA.
    8. Przenieść szkiełka nakrywkowe z płytki 24-dołkowej do komory wilgotnościowej. Po przeniesieniu szkiełek nakrywkowych do komory dodać 100 μl BB (BB1 lub BB2, w zależności od użytych par przeciwciał), aby uniknąć wysuszenia.
      UWAGA: Komorę wilgotnościową chronioną przed światłem można łatwo i szybko uzyskać, owijając szalkę Petriego (plastikową lub szklaną) folią aluminiową i dodając kilka kawałków mokrego ręcznika papierowego na obrzeżach szalki Petriego.
  3. Test ligacji zbliżeniowej (PLA)
    UWAGA: Protokół PLA jest zgodny z instrukcjami producenta z niewielkimi modyfikacjami.
    1. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
      1. Przygotować roztwór roboczy przeciwciała pierwotnego. Rozcieńczyć króliczy anty-ORP5 (1:150) plus mysi anty-ORP8 (1:200) w BB1, mysi anty-ORP8 (1:200) plus króliczy anty-PTPIP51 (1:200) w BB2 i króliczy anty-ORP5 (1:150) plus mysi anty-PTPIP51 (1:200) w BB1. Przygotować (co najmniej) 40 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na szkiełko nakrywkowe (np. 0,27 μl króliczego anty-ORP5, 0,2 μl mysiego anty-ORP8, 39,53 μl BB1).
      2. Usunąć kulkę z poprzedniego płukania (krok 1.2.8) za pomocą systemu próżniowego i dodać 40 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.
    2. Szkiełka nakrywkowe myć 3x przez 5 minut w 100 μl odpowiedniego BB za pomocą systemu próżniowego.
    3. Inkubacja sondy PLA
      1. Przygotuj roztwór roboczy sond PLA. Rozcieńczyć sondy PLA rabbit PLUS (1:5) i mysie MINUS (1:5) w BB i wymieszać. Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy przygotować (co najmniej) 40 μl roztworu sondy PLA (np. 8 μl sondy króliczej PLUS PLA, 8 μl mysiej sondy MINUS PLA, 24 μl BB). Przed użyciem pozostaw roztwór sondy PLA na 20 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Usunąć kulkę z szkiełek nakrywkowych (z kroku 1.3.2) za pomocą systemu próżniowego i dodać 40 μl roztworu sondy PLA do szkiełek nakrywkowych. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.
    4. Myć szkiełka nakrywkowe 2x przez 5 min w 100 μL 1x buforu do płukania A w temperaturze pokojowej.
    5. Ligacji
      1. Rozcieńczyć 5x bufor ligacyjny do proporcji 1:5 w ultraczystej wodzie i wymieszać. Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy przygotować (co najmniej) 40 μl roztworu do ligacji (8 μl 5x buforu ligacyjnego, 31 μl ultraczystej wody).
      2. Dodać ligazę (1 U/μL, dostarczaną w zestawie PLA) do 1x buforu ligacyjnego przygotowanego w poprzednim kroku w rozcieńczeniu 1:40 i wymieszać.
      3. Usunąć 1x bufor płuczący A z szkiełek nakrywkowych (z kroku 1.3.4) za pomocą systemu próżniowego, dodać 40 μl roztworu ligazy do szkiełek nakrywkowych i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.
    6. Szkiełka nakrywkowe myć 2x przez 2 minuty w 100 μl 1x buforu do płukania A w temperaturze pokojowej za pomocą systemu próżniowego.
    7. polimeryzacja
      1. Rozcieńczyć 5-krotny bufor wzmacniający 1:5 w ultraczystej wodzie i wymieszać. Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy przygotować (co najmniej) 40 μl roztworu do amplifikacji (8 μl 5-krotnego buforu do amplifikacji, 31,5 μl ultraczystej wody).
      2. Dodać polimerazę (10 U/μL, dostarczaną w zestawie PLA) do 1x buforu polimeryzacyjnego przygotowanego w poprzednim kroku w rozcieńczeniu 1:80 i wymieszać.
      3. Usunąć 1x bufor płuczący A z szkiełek nakrywkowych (z kroku 1.3.6) za pomocą systemu próżniowego, dodać 40 μl roztworu polimerazy do szkiełek nakrywkowych i inkubować przez 1 godzinę 40 minut w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.
    8. Usunąć roztwór polimerazy ze szkiełek nakrywkowych i przemyć 2x przez 10 min w 100 μL 1x bufora do płukania B w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.
    9. Szkiełka nakrywkowe myć 1x przez 1 minutę w 100 μL 0,001x buforu B do mycia w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.
    10. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych do mikroskopii za pomocą podłoża montażowego z DAPI (stężenie między 1,6-0,4 μg/ml). Uszczelnij lakierem do paznokci.

2. Akwizycja obrazu

  1. Obserwuj wyniki PLA i uzyskuj obrazy za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej z obiektywem z 63-krotnym zanurzeniem w oleju za pomocą dołączonego oprogramowania.
  2. Ustaw wzbudzenie fluorescencji za pomocą diody laserowej 405 nm lub lasera światła białego i zbierz okna widmowe za pomocą detektorów GaAsP PMT lub hybrydowych. W każdej płaszczyźnie ogniskowej (obejmującej 300 nm) należy zebrać sygnały fluorescencyjne dla PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) i mitochondriów (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).

3. Przetwarzanie obrazu i ocena plam PLA związanych z mitochondriami

  1. Przetwarzaj obrazy konfokalne za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, które generuje mapy odległości między komponentami komórkowymi. Wykonaj poniższe czynności, aby wygenerować rekonstrukcje 3D plamek PLA i sieci mitochondrialnej oraz uzyskać dostęp do odległości między nimi za pomocą oprogramowania do obrazowania komórek (Rysunek 1).
  2. Instalacja rozszerzenia mapy odległości 3D
    1. Zainstaluj zarówno pakiet oprogramowania do analizy komórek z opcją XT, jak i oprogramowanie MATLAB lub tylko środowisko uruchomieniowe kompilatora MATLAB (MRC), które można bezpłatnie pobrać ze strony internetowej.
    2. Skonfiguruj oprogramowanie do analizy komórek, aby uruchamiało program MATLAB po uruchomieniu programu XTension w następujący sposób: z opcji Imaris (Mac OS X) lub menu Edycja (Windows) wybierz Preferencje, przejdź do panelu Narzędzia niestandardowe, a następnie ustaw ścieżkę:
      C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB.exe dla systemu Windows lub/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab dla systemu Mac OS X.
  3. Zaimportuj obrazy do oprogramowania
    1. Konwertuj obrazy stosu konfokalnego na plik . IMS, bezpośrednio w sekcji Arena lub za pomocą samodzielnego konwertera plików, który umożliwia konwersję wsadową.
    2. Po zaimportowaniu sprawdź, czy obrazy pozostają prawidłowo skalibrowane. Kliknij Edytuj > Właściwości obrazu > Geometria obrazu i sprawdź, czy rozmiar woksela odpowiada w X i Y rozmiarowi piksela oczekiwanemu dla rzeczywistego obrazu (patrz kalibracja obrazu w oprogramowaniu do akwizycji) i czy rozmiar woksela w Z odpowiada krokowi zastosowanemu przez mikroskop do wygenerowania stosu Z. Jeśli wartości nie są poprawne, zmodyfikuj je, aby zapewnić prawidłowe oszacowanie odległości w poniższych krokach.
    3. Dostosuj kontrast różnych kanałów w menu Regulacja wyświetlania, klikając Edytuj > Pokaż regulację wyświetlania. Dostosuj każdy kanał niezależnie, aby zoptymalizować wyświetlanie każdego koloru. Ten krok nie ma bezpośredniego wpływu na wartości obrazu, ale jest niezbędny do ustawienia precyzyjnych progów lub wykrycia słabych obiektów.
    4. Ogranicz analizę do pojedynczej komórki, przycinając obraz za pomocą opcji Edytuj > Przytnij 3D. Aby przeanalizować inną komórkę w tym samym polu widzenia, otwórz ponownie ten sam obraz i przytnij go w inny sposób.
  4. Detekcja punktowa ORP5-ORP8
    1. Wykryj sygnały PLA generowane w miejscu interakcji ORP5 i ORP8, klikając opcję Dodaj nowe miejsca, która tworzy nowy zestaw obiektów i otwiera kreatora wykrywania punktów.
    2. Wybierz kanał, na którym ma być wykonana detekcja punktowa.
    3. Dostosuj szacowaną średnicę XY (zakres musi zostać dostosowany, jeśli rozmiar obiektu jest inny), aby pomóc algorytmowi wykrywania plamek w znalezieniu interesujących obiektów. Zwróć uwagę, że jeśli wybrana wartość jest zbyt wysoka, pobliskie obiekty zostaną połączone. Jeśli wartość jest zbyt mała, jeden sygnał może zostać uznany za wiele obiektów lub mogą zostać wykryte nieprawidłowe sygnały.
    4. Kliknij Odejmowanie tła, aby usunąć tło obrazu przed wykryciem punktu, aby zwiększyć lokalny kontrast wokół interesujących obiektów.
    5. Dostosuj próg wykrywania punktowego, zachowując jakość (intensywność w środku obiektu) jako parametr progowy i automatyczny próg oprogramowania, lub nieznacznie zmodyfikuj tę wartość, aby wykryć wszystkie obiekty. Po zakończeniu wykrywania plamek zapisz parametry wykrywania i użyj ich ponownie do przetwarzania innych obrazów.
  5. Wykrywanie sieci mitochondrialnej
    1. Wykryj sieć mitochondrialną, aby wygenerować renderowanie powierzchni, klikając pozycję Dodaj nowe powierzchnie, aby utworzyć nowy obiekt, a następnie otwórz kreatora wykrywania powierzchni.
    2. Wybierz kanał, na którym ma zostać wykonane tworzenie powierzchni.
    3. Zastosuj filtr Gaussa, aby uzyskać gładszą powierzchnię, klikając pole wyboru Wygładzanie i ustawiając próg wskazujący najmniejsze szczegóły widoczne na powierzchni.
    4. Wykonaj odejmowanie tła, aby wzmocnić lokalne kontrasty i pomóc w kroku progowym.
    5. Dostosuj próg, aby wykryć sieć mitochondrialną na podstawie intensywności sygnału. Jeśli prawidłowe ustawienie progu jest trudne, zaleca się powrót do poprzedniego kroku, aby dostosować stopień gładkości i odejmowania tła.
    6. W razie potrzeby nałóż filtr na powierzchnię, aby usunąć drobne pozostałości wynikające z progu. W tym celu wybierz filtr Liczba wokseli w oknie klasyfikowania powierzchni i pobaw się górnymi i dolnymi progami, aby zachować tylko interesujące obiekty. Po zakończeniu tworzenia powierzchni zapisz parametry tworzenia i użyj ich ponownie do przetwarzania innych obrazów.
  6. Generowanie mapy odległości 3D wokół mitochondriów
    1. Wygeneruj mapę odległości poza powierzchnią mitochondriów, która została wcześniej utworzona w następujący sposób. Wybierz powierzchnię mitochondriów w polu drzewa sceny. Kliknij funkcję przetwarzania obrazu > powierzchni > transformacji odległości. Spowoduje to wywołanie programu Matlab XTension, który poprosi użytkownika o wybranie, czy mapa ma być obliczana na zewnątrz, czy wewnątrz powierzchni obiektu.
    2. Wybierz opcję Obiekt na powierzchni zewnętrznej, aby zmierzyć odległość między plamkami PLA a powierzchnią mitochondriów. Po wygenerowaniu mapa odległości pojawia się jako nowy kanał w panelu regulacji wyświetlania. W tym kanale każdy piksel ma wartość odpowiadającą odległości do najbliższych mitochondriów.
  7. Ekstrakcja odległości obiektów od najbliższych mitochondrów
    1. Aby zmierzyć odległość od każdego punktu do najbliższych mitochondrów oraz zidentyfikować i zwizualizować najbliższe, wybierz wcześniej wygenerowane miejsca w polu drzewa sceny.
    2. W statystykach i dzienniku szczegółowym wybierz Określone wartości (aby uzyskać jeden pomiar dla każdego miejsca). Wybierz Center Intensity Ch=X (gdzie X odpowiada numerowi kanału mapy odległości). Spowoduje to zmierzenie wartości każdego środka punktu, która odpowiada jego odległości do najbliższego mitochondrium na mapie odległości.
    3. Wyeksportuj dane jako plik .csv, klikając ikonę dyskietki w lewym dolnym rogu okna.
    4. Aby wyodrębnić subpopulację plam na podstawie ich odległości do mitochondriów, wybierz miejsca w drzewie sceny i kliknij kartę Filtry.
    5. W tym oknie dodaj nowy filtr oparty ponownie na środku intensywności Ch=X i wyodrębnij miejsca oddalone od mitochondriów o mniej niż 380 nm, ustawiając dolny próg na 0 μm, a górny próg na 0,380 μm.
      UWAGA: Próg 380 nm oszacowano na podstawie reakcji PLA, w tym związku między przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi (30 nm) oraz połową pełnej szerokości w połowie maksimum (FWHM) sygnałów amplifikacji PLA (350 nm).
    6. Aby skupić się na zaznaczonych miejscach i na przykład nadać im wyraźny kolor, wykonaj krok duplikacji, naciskając przycisk Duplikuj zaznaczenie do nowych miejsc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego powyżej protokołu, wykryliśmy miejsca interakcji dwóch białek transferu lipidów zakotwiczonych w ER, ORP5 i ORP8, i oceniliśmy ich występowanie w subdomenach błony ER w kontakcie z innymi organellami, w szczególności z mitochondriami. W tym celu sieć mitochondrialną w komórkach HeLa wybarwiono czerwonym markerem mitochondrialnym, a zielone plamki ORP5-ORP8 PLA wykryto po utrwaleniu przy użyciu pierwotnych przeciwciał anty-ORP5 i anty-ORP8, których swoistość została wcześniej przetestowana za pomoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został opracowany w celu identyfikacji i ilościowego określenia interakcji między białkami organelli PLA w MCS, w szczególności w MERCS. Nowatorstwo protokołu polega na tym, że łączy on PLA z znakowaniem wielu organelli, mikroskopią konfokalną i analizą obrazu 3D w celu zlokalizowania i ilościowego określenia interakcji PLA między dwoma białkami znajdującymi się w tej samej błonie, w tym przypadku w błonie ER w bliskiej odległości od błony mitochondriów (MAM) lub jednocześnie z MAM i LD. Protokół ten może by...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), Program ATIP-Avenir, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) oraz Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences ANR-22-CE11-0024-01/MADE to FG) oraz AFM Telethon (Projekt AFM 23778).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (1X DPBS)Gibco14190-094
Chlorek amonu (NH4Cl)VWR21236.291
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7906
Szkiełka nakrywkowe okrągłe szklane 13mm nr 1,5Agar ScientificL46R13-15
CMXRos czerwony MitoTrackerInvitrogenM7512czerwony marker mitochondrialny
Konfokalny mikroskop odwrócony SP8-XLeicaDMI 6000
Corning Costar Płytki 24-dołkowe z powłoką TC OdczynnikidoCLS3526
Duolink Zielony SigmaDUO92002
Duolink Medium montażowe In Situ z DAPI SigmaDUO82040
Duolink In Situ PLA Sonda Anty-Mysia MINUS SigmaDUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigmaDUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescencja SigmaDUO82049
Gibco Opti-MEM I Zredukowana pożywka w surowicy, suplement GlutaMAX Gibco51985026pożywka wolna od surowicy
Oprogramowanie Imaris v 9.3Oprogramowanie do obrazowania komórekBitplaneN/A
Inkubator UINCU-line IL10VWR390-0384
Szkiełko mikroskopowe StarFrost (3" x 1") Mysz Knittel Glass
anty-ORP8 Santa Cruz134409
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP6148
królik anty-ORP5 SigmaHAP038712
SaponinSigma84510
Ultra czysta woda destylowana, wolna od DNaz/RNazInvitrogen10977-035
wykrywania in situ Merck

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287(2019).
  2. Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
  3. Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
  4. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  5. Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
  6. Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443(2021).
  7. Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
  8. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899(2016).
  9. Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074(2021).
  10. Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
  11. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
  12. Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  13. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  14. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757(2017).
  15. Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364(2022).
  16. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162(2020).
  17. Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107(2022).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test ligacji w pobli umiejsca kontaktu b onkwantyfikacja oddzia ywa bia kowychbarwienie organellisegmentacja obrazowania 3Db ony zwi zane z mitochondriamiobrazowanie konfokalneoddzia ywanie ORP5 ORP8komunikacja wewn trzkom rkowa

Powiązane artykuły