Protokół przedstawiony tutaj pokazuje syntezę silnego kleju hydrożelowego żelu o-nitrozobenzaldehydu (żelatyna-NB). Żelatyna-NB ma szybką i wydajną zdolność adhezji tkanek, co może tworzyć silną barierę fizyczną chroniącą powierzchnie ran, dlatego oczekuje się, że znajdzie zastosowanie w dziedzinie biotechnologii naprawy urazów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Synteza mocnego kleju hydrożelowego, żelatyny O-nitrozobenzaldehydu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Materiały adhezyjne stały się popularnymi biomateriałami w dziedzinie inżynierii biomedycznej i tkankowej. W naszej poprzedniej pracy zaprezentowaliśmy nowy materiał - żelatynowy o-nitrozobenzaldehyd (żelatyna-NB) - który jest stosowany głównie do regeneracji tkanek i został zwalidowany w modelach zwierzęcych uszkodzenia rogówki i nieswoistego zapalenia jelit. Jest to nowy hydrożel powstały w wyniku modyfikacji biologicznej żelatyny za pomocą o-nitrozobenzaldehydu (NB). Żelatyna-NB została zsyntetyzowana przez aktywację grupy karboksylowej NB-COOH i reakcję z żelatyną przez chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodimidu (EDC) i N-hydroksysukcynimid (NHS). Otrzymany związek poddano oczyszczeniu w celu wytworzenia produktu końcowego, który może być stabilnie przechowywany przez co najmniej 18 miesięcy. NB ma silną adhezję do -NH2 na tkance, która może tworzyć wiele wiązań C = N, zwiększając w ten sposób adhezję żelatyny-NB do granicy faz tkankowych. Proces przygotowania składa się z etapów syntezy grupy NB-COOH, modyfikacji grupy, syntezy żelatyny-NB i oczyszczania związku. Celem jest szczegółowe opisanie specyficznego procesu syntezy żelatyny-NB oraz zademonstrowanie zastosowania żelatyny-NB do naprawy uszkodzeń. Ponadto protokół został przedstawiony w celu dalszego wzmocnienia i rozszerzenia charakteru materiału opracowanego przez społeczność naukową w celu uzyskania bardziej odpowiednich scenariuszy.
Wprowadzenie
Hydrożel to rodzaj trójwymiarowego polimeru powstałego w wyniku pęcznienia wody. W szczególności hydrożel pochodzący z macierzy zewnątrzkomórkowej jest szeroko stosowany w dziedzinie biosyntezy i medycyny regeneracyjnej ze względu na jego doskonałą biokompatybilność i skuteczność terapeutyczną1. Hydrożele zostały zgłoszone do leczenia wrzodów żołądka, zapalenia nerwów, zawału mięśnia sercowego2,3,4 i innych chorób. Ponadto udowodniono, że żelatyna-NB może sprzyjać wynikom zapalenia nieswoistego zapalenia jelit (IBD)5. Tradycyjne hydrożele obejmują gumę gellan, żelatynę, kwas hialuronowy, glikol polietylenowy (PEG), warstwowe, hydrofobowe/hydrofilowe, alginianowe/poliakrylamidowe, podwójną sieć i hydrożele poliamfoteryczne6, z których wszystkie mają dobrą zgodność tkankową i właściwości mechaniczne. Jednak te tradycyjne hydrożele są podatne na wilgoć i powietrze w środowisku. Jeśli będą wystawione na działanie powietrza przez długi czas, stracą wodę i wyschną; Jeśli są zanurzone w wodzie przez długi czas, wchłoną wodę i rozszerzą się7, zmniejszając w ten sposób swoją elastyczność i funkcję mechaniczną. Ponadto utrzymanie adhezji tkankowej konwencjonalnych hydrożeli jest dużym wyzwaniem8.
Na podstawie tego, zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy nanoskalowy hydrożel żelatynowy-NB, który jest nowym hydrożelem powstałym przez modyfikację biologicznej żelatyny za pomocą NB (Rysunek 1). NB ma silną zdolność adhezji do -NH2 na tkance, która może tworzyć dużą liczbę wiązań C = N, zwiększając w ten sposób przyczepność granicy faz hydrożel-tkanka. Ta silna adhezja może sprawić, że hydrożel mocno przylega do powierzchni tkanki, tworząc w ten sposób powłokę molekularną na poziomie nano. W poprzednich badaniach zespołu potwierdzono, że ten rodzaj zmodyfikowanej powłoki hydrożelowej poprawił przyczepność tkanek9; Może stabilnie przylegać do narządów i tkanek rogówki i jelit oraz pełnić rolę przeciwzapalną, izolacyjną i wspomagającą regenerację. Celem jest szczegółowe przedstawienie tutaj specyficznego procesu syntezy żelatyny-NB, tak aby żelatyna-NB mogła być stosowana w większej liczbie scenariuszy naprawy uszkodzeń. Co więcej, zachęcamy innych badaczy do dalszego wzmacniania i rozszerzania charakteru tego materiału, aby pasował do większej liczby scenariuszy zastosowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Myszy C57BL/6 zostały zakupione w Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital. Króliki nowozelandzkie zostały zakupione na Uniwersytecie Zhejiang. Zwierzęta były utrzymywane w naturalnych warunkach cyklu światło-ciemność i otrzymywały im swobodnie pożywienie i wodę pitną. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone etycznie przez instytucjonalne wytyczne Komitetu Etyki Uniwersytetu Zhejiang (ZJU20200156) oraz Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Zhejiang University School of Medicine Sir Run Run Shaw Hospital, które były zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (SRRSH202107106).
1. Synteza NB-COOH
- Przygotować 4-hydroksy-3-(metoksy-D3) benzaldehyd (8,90 g, 58,5 mM, ekwiwalenty 1,06 [równanie]), węglan potasu (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) i 4-bromomaślan metylu (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) w oparciu o protokół zaproponowany w poprzednim badaniu10. Rozpuścić związki w 40 ml N, N-dimetyloformamidu (DMF) i mieszać w temperaturze otoczenia przez 16 godzin.
- Dodać 200 ml wody o temperaturze 0 °C do mieszaniny i wytrącić mieszaninę w celu uzyskania surowego produktu.
- Kilkakrotnie rozpuścić surowy produkt w DMF, a następnie wytrącać przez pięć cykli. Wytrącić surowy produkt i suszyć go w temperaturze 80 °C przez 2 godziny w celu uzyskania wczesnego produktu.
2. Modyfikacja i przetwarzanie chemiczne
- Przeprowadzić podstawienie ipso estru metylowego kwasu metylowego 4-(4-formylo-2-metoksyfenoksymetoksyfenylo)butanowego, jak opisano poniżej.
- Dodać powoli 9,4 g 4-(4-formylo-2-metoksyfenoksy)butanianu metylu (37,3 mM, 1 eg.) do wstępnie schłodzonego (-2 °C) roztworu 70% kwasu azotowego (140 ml) i mieszać w temperaturze -2 °C przez 3 godziny
UWAGA: W zależności od temperatury reakcji nitrowania nastąpi podstawienie ipso ugrupowania formylowego. - Przefiltruj mieszaninę (~9,0 g) z 200 ml wody o temperaturze 0 °C, a następnie oczyść ją w DMF, aby wytrącić stały produkt.
- Hydrolizować produkt stały w kwasie trifluorooctowym (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 ml) w temperaturze 90 °C i wysuszyć. Usunąć rozpuszczalnik o ciśnieniu poniżej 80 kPa w celu otrzymania końcowego produktu pośredniego, suchego bladożółtego proszku.
- Rozpuścić produkt pośredni (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq) w tetrahydrofuranie (THF)/etanolu, 1:1 v/v (100 ml). Następnie powoli dodawać 1,43 g NaBH4 (35,7 mM, 1,5 e) w temperaturze 0 °C. Po 3 godzinach usunąć wszystkie rozpuszczalniki w próżni i zawiesić pozostałość w roztworze wody i dichlorometanu w stosunku 1:1 (po 50 ml każdy).
- Przygotować dichlorometan w celu ekstrakcji produktu z warstwy wodnej. Usuń warstwę organiczną i wysusz siarczan magnezu.
- Oczyść surowy produkt za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym przy użyciu DCM/MeOH w stosunku 10:1 (1% TEA). Na koniec otrzymaj 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) stosunkowo czystego żółtawego proszku NB-COOH.
3. Synteza żelatyny-NB
- Przygotuj 5 g żelatyny na jedną partię modyfikacji. Przygotować jednorodny roztwór żelatyny, rozpuszczając 5 g żelatyny w 100 ml wody dejonizowanej i przechowywać w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Tutaj zdefiniowano oryginalną 33 x 10-5 moli ε-aminowe grupy/g żelatyny11. - Zdefiniuj stosunek paszy (FR) jako stosunek molowy między grupami NB a pierwszorzędowymi grupami aminowymi w żelatynie. W tym badaniu 53 mg NB z 1 g żelatyny zdefiniowano jako FRNB = 1.
- Rozpuścić 1,060 mg NB-COOH w 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu aktywacji grup karboksylowych NB-COOH. Ponieważ grupa NB jest wrażliwa na światło ultrafioletowe (UV) w roztworze, zawsze trzymaj ją z dala od światła.
- Dodać 746 mg chlorowodorku 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodimidu (EDC) do roztworu NB-COOH DMSO i mieszać przez 5 minut. Po rozpuszczeniu EDC dodać 448 mg N-hydroksysukcynimidu (NHS) i mieszać przez 5 minut.
- Za pomocą zakraplacza powoli wrzucać mieszaninę z szybkością 0,5 ml/min do rozpuszczonego roztworu żelatyny, energicznie mieszając, aby reagować w temperaturze 45 °C przez 4 godziny.
4. Oczyszczanie i przechowywanie produktu
- Roztwór żelatyny-NB należy dializować z nadmiarem wody dejonizowanej przez co najmniej 3 dni, a następnie zebrać, zamrozić i liofilizować, aby uzyskać pianki żelatynowe-NB. Pianki należy przechowywać w eksykatorze w ciemności do dalszego użycia.
- Liofilizowane pianki żelatynowe-NB rozpuścić w wodzie dejonizowanej o temperaturze 37 °C, bezpośrednio przed użyciem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 2A przedstawia schemat głównych reakcji chemicznych biorących udział w syntezie żelatyny-NB, która wspomaga integrację tkankową poprzez szczepienie grup NB na żelatynę. Rycina 2B pokazuje, że O-nitrobenzen hydrożelu żelatyny-NB przekształca się w grupę NB bezpośrednio po naświetlaniu UV, a następnie aktywna grupa aldehydowa może zostać sieciowana z grupą aminową w celu utworzenia zasady Schiffa. Rycina 2C wskazuje, że różne p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Materiały klejące to nowa klasa materiałów. Coraz więcej badaczy angażuje się w syntezę różnego rodzaju materiałów adhezyjnych i stara się znaleźć ich zastosowania w biotechnologii, inżynierii tkankowej, medycynie regeneracyjnej i innych dziedzinach, co w ostatnich latach doprowadziło do energicznego rozwoju. Oprócz skupienia się na silnej przyczepności materiałów klejących, naukowcy zwracają również większą uwagę na inne właściwości, takie jak wstrzykiwalność, samoregeneracja, hemostatyczne, przeciwbakteryjne, kontrolow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorowodorek 1-(3dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodimidu (EDC) | Aladyn | L287553 | |
| 4-hydroksy-3-(metoksy-D3)benzaldehyd | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichlorometan | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimetyloformamid (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| żelatyna | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| siarczan magnezu | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| ester metylowy kwasu metylowego 4-(4-formylo-2-metoksyfenoksyfenylo)butanowego | CHEMSRC | 141333-27-9 | |
| 4-bromomaślan metylu | Aladyn | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroksysukcynimid (NHS) | Aladyn | D342712 | |
| kwas azotowy | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| węglan potasu | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladyn | D380010 | |
| kwas trifluorooctowy (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
Bibliografia
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604(2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587(2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315(2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060(2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
