Artykuł metodologiczny

Ablacja laserowa i mikroskopia przyżyteczna w celu zbadania przebudowy jelit

DOI:

10.3791/64756

⸱

9 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Pathology, The Netherlands Cancer Institute, 2Oncode Institute, 3Animal Laboratory Facility, The Netherlands Cancer Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów jelita po zranieniu wywołanym laserem. Poprzez wystawienie jelita myszy na działanie lasera wielofotonowego, utrata jednej lub wielu krypt jest indukowana lokalnie. Poprzez wielokrotne obrazowanie uszkodzonego obszaru przez miesiące, uchwycona jest dynamika regeneracji jelit w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie regeneracji jelit in vivo to wyjątkowe wyzwanie techniczne. Brak protokołów obrazowania podłużnego uniemożliwił głębszy wgląd w dynamikę skali komórek i tkanek, która koordynuje regenerację jelit. W tym miejscu opisujemy metodę mikroskopii przyżyciowej, która miejscowo indukuje uszkodzenie tkanek w pojedynczej skali krypty i śledzi reakcję regeneracyjną nabłonka jelitowego u żywych myszy. Pojedyncze krypty lub większe pola jelitowe zostały poddane ablacji za pomocą wielofotonowego lasera podczerwonego o wysokiej intensywności w sposób kontrolowany w czasie i przestrzeni. Późniejsze, długotrwałe, powtarzalne obrazowanie przyżyciowe umożliwiło śledzenie uszkodzonych obszarów w czasie i umożliwiło monitorowanie dynamiki krypty podczas odzyskiwania tkanek przez okres wielu tygodni. Zdarzenia przebudowy krypty, takie jak rozszczepienie krypty, fuzja i zanik, zaobserwowano w sąsiedniej tkance po uszkodzeniu wywołanym laserem. Protokół ten umożliwia badanie dynamiki krypt zarówno w warunkach homeostatycznych, jak i patofizjologicznych, takich jak starzenie się i inicjacja guza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonkowa wyściółka jelita jest stale zagrożona przez kwasy żołądkowe, toksyny i mikrobiotę, które mogą powodować zakłócenia bariery nabłonkowej. Struktura jelit i organizacja tkanek są wyspecjalizowane w ciągłym samoodnawianiu i naprawianiu uszkodzeń. Jednowarstwowy nabłonek jelita cienkiego jest zorganizowany w jednostki crypt-villus1. W homeostazie samoodnawiające się jelitowe komórki macierzyste Lgr5+, które znajdują się u podstawy krypty, dają początek zróżnicowanemu potomstwu. Zróżnicowane komórki potomne przemieszczają się do końca osi kosmków w sposób przenośnika taśmowego, gdzie są zrzucane, aby wyściółka jelita została uzupełniona w ciągu 3-5 dni2,3. W dłuższej perspektywie nie wszystkie komórki Lgr5+ przyczyniają się w równym stopniu do odnowy tkanek, ponieważ zależy to również od zdolności komórek do poruszania się w kierunku przenośnika taśmowego w kierunku podstawy krypty (tj. ruch wsteczny)4,5. Rzeczywiście, po ablacji komórek Lgr5+ przez, na przykład, promieniowanie, komórki progenitorowe poza podstawą krypty przemieszczają się do podstawy, aby odróżnicować i uzupełnić pulę komórek macierzystych6,7,8.

Ostre zapalenie może spowodować utratę komórek macierzystych Lgr5+9,10. Oprócz utraty komórek macierzystych, wiele czynników zewnętrznych może powodować ostre uszkodzenie nabłonka w skali krypty. Wykazano, że promieniowanie, leczenie chemiczne i antybiotyki uszkadzają krypty jelitowe i kosmki11. Większe pola krypt i kosmków mogą być dotknięte infekcjami bakteryjnymi, wirusowymi i pasożytniczymi12. Jelito posiada niezwykłą zdolność do regeneracji po wewnętrznych i zewnętrznych uszkodzeniach w skali krypty przez rozszczepienie krypty (podział jednej krypty na dwie)13. Po zranieniu, krypty w obszarze przylegającym do uszkodzenia ulegają rozszczepieniu, aby uzupełnić numery krypt. Zjawisko to występuje również, choć w mniejszym stopniu, podczas homeostazy14,15. Aby zrównoważyć potencjalny wzrost liczby krypt podczas homeostazy, krypty mogą również łączyć (łącząc dwie krypty w jedną)16,17. Nie wiadomo, czy fuzja krypt odgrywa również rolę w przywracaniu numerów krypt po zranieniu. Co więcej, dynamika i czynniki regulacyjne tego procesu pozostają do wyjaśnienia.

Modele urazów są niezbędne do badania regeneracji tkanek in vivo. Do badania regeneracji tkanki jelitowej wykorzystano różne modele urazów. Poprzednie strategie eksperymentalne wykorzystywały wysokie dawki promieniowania w celu wyczerpania puli komórek macierzystych18 lub leczenie siarczanem dekstranu sodu (DSS) w celu wywołania przewlekłego i ostrego zapalenia jelita grubego oraz utraty krypty u myszy19,20. Ablacja pojedynczych komórek za pomocą środków genetycznych lub optycznych została wykorzystana do udoskonalenia uszkodzeń tkanek i uważana za atrakcyjne narzędzie do wyjaśnienia roli komórek macierzystych i progenitorowych21,22 i badania regeneracji naczyń krwionośnych23. Dodatkowo, opracowano system biopsyczno-urazowy w celu wywołania uszkodzeń na większych polach kilku krypt i kosmków 24. Co ważne, reakcja na szkodliwą zniewagę może być różna wzdłuż osi proksymalno-dystalnej jelita, jak podawano w przypadku promieniowania, które spowodowało więcej uszkodzeń w jelicie cienkim niż w okrężnicy25. Podkreśla to potrzebę stosowania ukierunkowanych metod, które kontrolują zarówno zakres szkodliwego urazu, jak i jego lokalizację w przewodzie pokarmowym.

Zakres uszkodzeń i regeneracja były tradycyjnie oceniane za pomocą statycznych środków, które dostarczają ograniczonych informacji na temat dynamiki regeneracji tkanek. Mikroskopia przyżyciowa (IVM) otworzyła unikalne możliwości ilościowego określania zachowania komórek macierzystych, przebudowy nabłonka i regeneracji w wielu narządach26,27,28,29,30, a także dostarczyła istotnych informacji na temat biologii jelit4,5,21,31,32,33,34,35,36.

Tutaj opisujemy metodę powodowania czasoprzestrzennie zdefiniowanego uszkodzenia jelit i uchwycenia regeneracji błony śluzowej jelita. Wykorzystujemy dwie ablacje laserowe oparte na fotonach do uszkodzenia krypt jelitowych i śledzimy natychmiastową reakcję rany i długotrwałą rekonwalescencję za pomocą powtarzalnej mikroskopii przyżyciowej. Nasz protokół pozwala na mapowanie regeneracyjnej przebudowy architektury tkanki jelitowej w odpowiedzi na miejscowe uszkodzenie tkanki. Dynamika krypty, w tym rozszczepienia i fuzji, może być łatwo określona ilościowo i śledzona w czasie. Zastosowanie ablacji laserowej i powtarzalnego obrazowania przyżyciowego może być wykorzystane jako platforma do badania dynamiki architektury jelit w skali tkankowej podczas homeostazy i patofizjologii, takiej jak inicjacja guza.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i zgodą Organu ds. Opieki nad Zwierzętami (AWB) Holenderskiego Instytutu Raka (NKI).

UWAGA: Skonsultuj się z komisją etyki zwierząt instytutu przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów na zwierzętach.

1. Przygotowanie do operacji i obrazowanie przyżyciowe

  1. Zabiegi przedoperacyjne
    1. Indukuj 8-12-tygodniowe K19-CreERT237: Rosa26-mTmG38 i Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 myszy, wstrzykując tamoksyfen rozpuszczony w oleju słonecznikowym dootrzewnowo 4-6 tygodni przed zabiegiem (Ryc. 1).
    2. Zastosuj środek przeciwbólowy. Wstrzyknąć podskórnie 200 μl buprenorfiny (0,1 mg/kg masy ciała) rozcieńczonej w NaCl 0,9% na 30 g myszy podskórnie. Karprofen (0,067 mg/ml) należy podawać w butelce zawierającej 125 ml niezakwaszonej, autoklawowanej wody pitnej na 24 godziny przed zabiegiem. Alternatywnie należy podać zastrzyk karprofenu podskórnie (5 mg/kg) 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu.
  2. Przygotowanie do zabiegu
    1. Wprowadź autoklawowane sterylne narzędzia chirurgiczne do szafki na zagrożenia biologiczne.
    2. Włącz poduszkę grzewczą i ustaw temperaturę na 37 °C.
  3. Przygotowanie do obrazowania przyżyciowego
    1. Włączyć komorę mikroskopu z kontrolowaną temperaturą co najmniej 4 godziny przed obrazowaniem, aby zapewnić wystarczającą ilość czasu na stabilizację temperatury.
      UWAGA: Potrzebny czas może się różnić w zależności od używanej maszyny.
    2. Utrzymuj stabilną temperaturę wewnątrz komory klimatycznej na poziomie 37 °C.
    3. Włącz mikroskop dwufotonowy, skaner i laser.
    4. Uruchom oprogramowanie do obrazowania.
    5. Dostosuj długość fali lasera do 960 nm i otwórz migawkę.

2. Chirurgia i obrazowanie przyżyciowe

  1. Chirurgiczne odsłonięcie jelita
    1. Znieczul mysz za pomocą 2%-3% izofluranu i umieść ją na poduszce grzewczej, przykrytej sterylną szmatką. Sprawdź głębokość znieczulenia, oceniając częstotliwość i jakość oddychania (jeden oddech/sekundę) oraz sprawdzając odruch myszy.
    2. Przykryj oczy myszy maścią do oczu.
    3. Wstrzyknąć podskórnie 200 μl podgrzanej sterylnej soli fizjologicznej.
    4. Ogol brzuch i usuń włosy. Zmień sterylną szmatkę w polu operacyjnym.
    5. Włóż sondę doodbytniczą, aby monitorować temperaturę myszy.
      UWAGA: Temperatura powinna wynosić około 37 °C.
    6. Załóż nową parę sterylnych rękawiczek.
    7. Oczyść obszar operacyjny w okrężny sposób naprzemiennie szorując roztworem antyseptycznym, a następnie trzykrotnie 80% etanolem. Usuń nadmiar etanolu sterylnym wacikiem.
      UWAGA: W tym momencie bardzo ważne jest, aby monitorować mysz pod kątem hipotermii.
    8. Przykryj mysz sterylną obłożeniem chirurgicznym.
    9. Sprawdź refleks myszy.
    10. Wykonaj pionowe nacięcie linii środkowej o długości ~10 mm przez skórę za pomocą sterylnego skalpela.
    11. Naciąć kresę białą za pomocą nożyczek, aby oddzielić mięśnie proste brzucha i otworzyć brzuch.
    12. Znajdź jelito ślepe myszy za pomocą sterylnych wacików nasączonych sterylną, wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną, aby użyć jej jako punktu odniesienia.
    13. Wykonaj małe nacięcie w kawałku sterylnej gazy, zwilż go w podgrzanej sterylnej soli fizjologicznej i umieść nad nacięciem.
    14. Wyjmij jelito sterylnymi wacikami nasączonymi podgrzanym sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Utrzymuj nawodnienie jelita, dodając sterylną, wstępnie podgrzaną sól fizjologiczną.
    15. Umieść sterylną, wykonaną na zamówienie komorę obrazowania obok myszy.
    16. Przenieś mysz do podgrzanego sterylnego pudełka do obrazowania.
    17. Umieść jelito na sterylnym szkle pudełka do obrazowania. Umieść głowę myszy w rurce inhalacyjnej pudełka do obrazowania, jak pokazano na Rysunek 1.
    18. W razie potrzeby zabezpiecz mysz sterylną elastyczną folią i taśmą.
    19. Umieść pudełko do obrazowania zawierające mysz w komorze mikroskopu.
  2. Obrazowanie przyżyciowe
    1. Monitoruj mysz podczas obrazowania, sprawdzając częstotliwość, głębokość oddechu i temperaturę za pomocą sondy doodbytniczej co 15 minut. Zawartość izofluranu powinna mieścić się w przedziale 1%-2%. Dostosuj w razie potrzeby.
    2. Znajdź obszar w jelicie za pomocą okularu mikroskopu.
    3. Uzyskaj widok o szerokim polu widzenia obszaru zainteresowania za pomocą wewnętrznej kamery mikroskopu, jak pokazano na Rysunek 2A.
    4. Zobrazuj obszar zainteresowania za pomocą lasera 960 nm mikroskopu wielofotonowego. Dostosuj moc lasera i długość fali zgodnie z fluoroforami użytymi w eksperymencie.
    5. Uzyskaj 10-20-stopniowy stos z 3 μm obszaru zainteresowania.
  3. Ablacja laserowa
    1. Wybierz pojedynczą pozycję lub wiele pozycji z kafelka przedstawionego wcześniej na obrazie.
    2. Użyj funkcji kalibracji punktu wybielania w oprogramowaniu do obrazowania przy powiększeniu 32 i rozdzielczości pikseli 124 x 124 pikseli z prędkością skanowania 400 Hz, wykorzystując właściwość skanowania dwukierunkowego przez 3-10 s, w zależności od wielkości dążonego uszkodzenia. Inicjację uszkodzenia w obszarze krypty można rozpoznać po wzroście autofluorescencji zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym.
    3. Powtórz poprzednie dwa kroki dla wielu regionów w tej samej myszy.
    4. Po ablacji zdobądź stosy z uszkodzonych obszarów, aby potwierdzić lokalizację i zakres uszkodzenia.
  4. Zamknięcie pola operacyjnego
    1. Umieść mysz, jeszcze pod narkozą, w sterylnym miejscu do szycia.
    2. Włóż odsłonięte jelito z powrotem do jamy brzusznej za pomocą sterylnych wacików nasączonych podgrzaną sterylną solą fizjologiczną.
    3. Zszyj kresę białą, wykonując prosty szew ciągły za pomocą wchłanialnego szwu 5-0. Zamknij końce szwu węzłami chirurgicznymi.
    4. Powtórz ten sam krok z warstwą skóry.
    5. Wyłączyć stację izofrubanu oraz oczyścić i wysterylizować komorę obrazowania oraz wkładkę.
    6. Wyczyść narzędzia chirurgiczne za pomocą środka do czyszczenia narzędzi chirurgicznych, enzymatycznego środka czyszczącego i smaru do narzędzi chirurgicznych. Po wysuszeniu wysterylizuj narzędzia chirurgiczne wraz z pudełkiem operacyjnym w autoklawie.
  5. Opieka pooperacyjna
    1. Pozwól myszy dojść do siebie po operacji, podczas gdy klatka jest umieszczona na poduszce grzewczej na ~1 h.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, umieść mysz z innymi kolegami z klatki. Samotne mieszkanie nie jest konieczne do rekonwalescencji.
    2. Sprawdzaj temperaturę myszy co 15 minut podczas odzyskiwania.
    3. Wstrzyknąć podskórnie 200 μl buprenorfiny (0,1 mg/kg masy ciała) rozcieńczonej w NaCl 0,9% na 30 g myszy 6-12 godzin po zabiegu.
    4. Karprofen (0,067 mg/ml) należy podawać w butelce zawierającej 125 ml niezakwaszonej, autoklawowanej wody pitnej przez 72 godziny po zabiegu.
    5. Zważ mysz i monitoruj dobrostan codziennie przez 1 tydzień po operacji.

3. Chirurgia powtarzalna i obrazowanie przyżyciowe

  1. chirurgia
    1. W drugim punkcie czasowym (co najmniej 1 tydzień po pierwszej sesji obrazowania) powtórz kroki 1.1.2, 1.2, 1.3 i 2.1.
  2. Obrazowanie przyżyciowe
    1. Powtórz kroki 2.2.1-2.2.3.
    2. Użyj wzoru naczyń krwionośnych, aby znaleźć te same obszary zainteresowania, które zostały zobrazowane w pierwszym punkcie czasowym.
    3. Powtórz kroki 2.2.4 i 2.2.5.
  3. Zamknięcie pola operacyjnego
    1. Powtórz krok 2.4.1.
    2. Jeśli mysz nie ma być obrazowana w innym punkcie czasowym, poświęć mysz, wykonując zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu końcowym. W przeciwnym razie przejdź do następnego kroku.
      UWAGA: Zgodnie z wytycznymi Dyrektywy UE 2010/63/UE, załącznik IV, zwichnięcie szyjki macicy jest dopuszczalną metodą.
    3. Powtórz kroki 2.4.2-2.4.6.
  4. Opieka pooperacyjna
    1. Powtórz kroki 2.5.1-2.5.5.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować rodzaj wyników, które można uzyskać za pomocą metody ablacji laserowej połączonej z obrazowaniem przyżyciowym, przeprowadziliśmy eksperyment, jak pokazano w Rysunek 1. Najpierw wstrzyknęliśmy K19-CreERT2; mTmG (K19cre-mTmG) oraz Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Myszy Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti) z tamoksyfenem do stochastycznie znakowania komórek jednym z kolorów konfetti (lub zielonym białkiem fluorescencyjnym [GFP] w przypadku myszy mTmG). K19-cre indukuje śledzenie linii ze wszystkich komórek nabłonkowych, podczas gdy Lgr5-cre indukuje śledzenie tylko z komórek macierzystych8,18,37. Wstrzyknięcie tamoksyfenu podawano 4-6 tygodni przed zabiegiem i pierwszą sesją obrazowania w celu uzyskania krypt, w których wszystkie komórki są monoklonalne dla określonego koloru. Dokładna identyfikacja tych samych regionów tkanek przez kilka tygodni jest niezbędna do śledzenia losów tych samych krypt w czasie. Nieodłączne cechy architektury tkankowej, takie jak unaczynienie, mogą być wykorzystane jako wiarygodne punkty orientacyjne tkanek i zostały tutaj zarejestrowane za pomocą wewnętrznej kamery mikroskopu. Ponadto oznaczenie niewielkiej części krypt (co najmniej dwoma) różnymi kolorami pomogło rozpoznać te same krypty w każdej sesji obrazowania i śledzić ich zachowanie podczas procesu regeneracji po uszkodzeniu lasera. Po chirurgicznym naświetleniu jelita myszy i uzyskaniu zarówno obrazów obszarowych zainteresowania, jak i obrazów fluorescencyjnych (Rysunek 2A), ustawienia punktu wybielania lasera wielofotonowego można użyć do ablacji jednej lub więcej krypt ( Rysunek 2B, C). Inicjację uszkodzenia można rozpoznać po wzroście autofluorescencji zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym. Aby zbadać dynamikę odzyskiwania krypt, procedurę chirurgiczną i obrazową powtórzono tygodnie/miesiące po pierwszej sesji obrazowania, a struktury nieodłącznie związane z tkankami (unaczynienie i wzory klonalnie znakowanych krypt) wykorzystano jako punkty orientacyjne do znalezienia dokładnie tej samej lokalizacji urazu (Ryc. 2). Gdy ta metoda została zastosowana u myszy Lgr5Cre-Confetti, gdzie Lgr5-eGFP jest wyrażany w sposób nierównomierny, można było uchwycić zmiany w numerach i kształtach krypt po uszkodzeniu wywołanym laserem (Rysunek 3). Podczas gdy niektóre regiony nie wykazały żadnych zmian w liczbie i strukturze krypt (Rysunek 3B), inne regiony wykazały rozległą przebudowę krypt, co widać w liczbie zdarzeń rozszczepienia i fuzji krypt (Rysunek 3C) oraz utracie krypt 2 tygodnie po urazie wywołanym przez laser (Rysunek 3D). Wprowadzając różne rozmiary uszkodzeń i określając ilościowo zdarzenia rozszczepienia, fuzji i zaniku po ablacji, jak w przykładzie pokazanym na (Rysunek 3E), można odwzorować dynamikę regeneracji wywołanej urazem w różnych modelach mysich.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie układu eksperymentalnego. Znakowanie in vivo komórek jelitowych odbywa się poprzez wstrzyknięcie tamoksyfenu dootrzewnowo w genetycznie zmodyfikowanych modelach mysich w celu wywołania rekombinacji za pośrednictwem Cre w kryptach jelitowych. Po dniach lub tygodniach (gdy krypty są monoklonalne dla określonego koloru) jelito jest chirurgicznie naświetlane i poddawane ablacji laserowej przy użyciu mikroskopu wielofotonowego z komorą o kontrolowanej temperaturze. Zakres uszkodzeń krypty jest charakteryzowany natychmiast po ablacji, a mysz może dojść do siebie po zabiegu. Wielokrotna ekspozycja chirurgiczna i IVM są stosowane do monitorowania regeneracji jelit w czasie. Wzór i rozmieszczenie układu krwionośnego oraz różnokolorowe krypty służą do odnalezienia tych samych regionów kilka tygodni lub miesięcy po ablacji. Przebudowę krypty (np. rozszczepienie lub fuzję) można zaobserwować w miejscu uszkodzenia kilka tygodni po ablacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Obrazowanie podłużne regeneracji tkanek po indukowanym laserem uszkodzeniu jelita. Gdy jelito jest ustawione dokładnie w ten sam sposób, naczynia krwionośne jelita mogą być używane jako mapa do znajdowania i obrazowania dokładnie tych samych regionów. (A) Obrazy przeglądowe jelita z kamery. Przerywane białe linie reprezentują wzór układu naczyniowego sąsiadującego z miejscem uszkodzenia (biała ramka), używany jako punkt orientacyjny do znalezienia tego samego obszaru poddanego ablacji laserowej w innym punkcie czasowym. Dwa dolne obrazy pokazują powiększony widok białego pola. Strzałka przedstawia dokładne miejsce ablacji laserowej w 1. dniu i 1 miesiąc później. (B) Fluorescencyjne obrazy pojedynczych uszkodzeń krypty uchwycone przez mikroskop wielofotonowy. Strzałka w niebieskim polu pokazuje miejsce uszkodzenia w dniu 1 i 1 miesiąc później. (C) Fluorescencyjne obrazy uszkodzonego pola krypt. Strzałki w niebieskim polu oznaczają obszar uszkodzenia w dniu 1 i 1 miesiąc później. Podziałka: 1 mm (A, góra); 0,25 mm (A, dół); 200 μm (duży przegląd B i C); i 50 μm (powiększone obrazy B i C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazowanie przyżyciowych losów krypt po ablacji laserowej. (A) Korzystając z modelu konfetti, krypty oznaczone różnymi kolorami mogą być śledzone w czasie, aby odwzorować dynamikę odzyskiwania. Biała strzałka przedstawia miejsce ablacji laserowej. Żółte pole reprezentuje sąsiedni obszar (<100 μm od miejsca uszkodzenia), podczas gdy niebieskie i fioletowe pola reprezentują obszary oddalone (>100 μm) od obszaru poddanego ablacji laserowej. Obserwuje się różne tryby regeneracji. (B) Niektóre regiony pozostają niezmienione, jak w fioletowym polu. (C) W innych regionach dochodzi do przebudowy krypt w postaci rozszczepienia lub fuzji krypt; Przerywane białe linie i strzałki przedstawiają zdarzenia rozszczepienia krypty, a pomarańczowe przerywane linie i strzałki przedstawiają zdarzenia fuzji krypty. (D) W niektórych regionach zaobserwowano zanikanie krypty, tak jak w żółtym polu gdzie krypta zaznaczona pomarańczową przerywaną linią zniknęła. (E) Przykładowa kwantyfikacja pokazująca liczbę zdarzeń związanych z przebudową krypt zaobserwowanych na obszarach sąsiadujących (tj. mniej niż 100 μm) i daleko od (tj. więcej niż 100 μm) miejsca uszkodzenia. Podziałka skali: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten łączy mikroskopijną ablację laserową i podłużną mikroskopię przyżyciową, aby śledzić regenerację jelit od wczesnej odpowiedzi na uszkodzenie do długotrwałej przebudowy tkanki. Technika ta została opracowana w ścisłym przestrzeganiu względów etycznych w celu wywołania i zobrazowania mikroskopijnej ablacji laserowej, a jeśli jest precyzyjnie przestrzegana, utrzyma dobrostan zwierząt. Podczas operacji ważne jest, aby upewnić się, że integralność jelita jest dobrze zachowana. Można to osiągnąć poprzez delikatne obchodzenie się z tkanką sterylnymi mokrymi wacikami, co zapobiega krwawieniu lub wysychaniu tkanki. Zakres mikroskopijnych uszkodzeń wywołanych laserem powinien być również dokładnie oceniony poprzez obrazowanie różnych warstw jelitowych obszaru po ablacji laserowej. Jeżeli badacz pragnie dostosować częstotliwość etapów doświadczalnych opisanych w niniejszym protokole, przed rozpoczęciem doświadczenia powinien skonsultować się z komisją etyczną ds. zwierząt instytutu w celu ustalenia konsekwencji dla dobrostanu.

Powtarzalna mikroskopia przyżyciowa pozwala monitorować regenerację tkanek u tej samej myszy w czasie. Wielokrotne chirurgiczne odsłonięcie jelita z łatwością zapewnia dostęp optyczny do całego przewodu pokarmowego. Cechy charakterystyczne dla tkanek, takie jak układ naczyniowy, służą jako punkty orientacyjne do identyfikacji tych samych regionów jelitowych podczas każdej sesji obrazowania. W ten sposób ten sam obszar tkanki może być obrazowany przez kilka tygodni, co umożliwia ilościowe określenie długoterminowej regeneracji tkanek w tym samym obszarze jelita u tej samej myszy. Kontrola czasoprzestrzenna oferowana przez łączoną metodę chirurgii i obrazowania ma tę zaletę, że ten sam narząd może być obrazowany zarówno w warunkach homeostatycznych, jak i regeneracyjnych u tej samej myszy, co stoi w przeciwieństwie do poprzednich modeli uszkodzenia całego narządu, w których próbki kontrolne i regenerujące pochodziły od różnych myszy 11,12,18,19,20. W związku z tym nasze warunki eksperymentalne minimalizują wymaganą liczbę zwierząt potrzebnych do eksperymentu i zmniejszają zmienność wewnątrzzwierzęcą.

Rozwiązywanie problemów z protokołem powinno rozpocząć się od przeglądu techniki obchodzenia się z myszą i jelitami oraz kontroli sprzętu i ustawień mikroskopowych. W tym protokole jest wiele krytycznych kroków, które wymagają dodatkowej uwagi. Po pierwsze, w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt i stałej wysokiej jakości danych, wszystkie prace muszą być wykonywane w czystym, sterylnym środowisku przy użyciu techniki aseptycznej, a temperatura myszy powinna być utrzymywana podczas operacji i każdej sesji obrazowania. Utrzymywanie nawodnienia tkanki sterylną, wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną podczas obrazowania jest niezbędne i zapobiega zwłóknieniu tkanek.

Aby upewnić się, że eksperyment zostanie przeprowadzony w sposób powtarzalny, ważne jest, aby ustawić lasery przed użyciem w celu optymalnej akwizycji i zmierzyć moc wyjściową lasera wielofotonowego na początku każdej sesji. Parametry takie jak rodzaj obiektywu, powiększenie, czas przebywania, moc lasera i długość fali mają wpływ na zakres mikroskopijnej ablacji laserowej i powinny być brane pod uwagę. W tym badaniu zarówno ablacja laserowa, jak i obrazowanie są przeprowadzane z mocą lasera o mocy 1,2 W (poza soczewką) przy długości fali 960 nm przez obiektyw Fluotar VISIR 25x/0,95 WATER. Zmiana długości fali lub właściwości skanowania optycznego wpływa na zakres uszkodzeń mikroskopijnych. Niższa długość fali (np. 840 nm) przekłada się na fotony o wyższej energii i często na wyższą moc wyjściową lasera i może zwiększyć mikroskopijne uszkodzenia. Większe powiększenie skutkuje większą energią na region, a tym samym krótszym czasem na ablację krypt i na odwrót. Czas przebywania pikseli można również wydłużyć lub zmniejszyć, aby zmienić szybkość ablacji i zakres obrażeń. Gdy obrazowana tkanka nie jest stabilna (np. z powodu ruchów perystaltycznych), ablacja musi być wykonana szybko. W tym celu należy zoptymalizować szybkość ablacji, na przykład poprzez zwiększenie zoomu i/lub mocy lasera.

Znalezienie tego samego regionu jelita podczas wielu sesji obrazowania jest kolejnym krytycznym krokiem, który należy wykonać prawidłowo, aby zapewnić powodzenie eksperymentu. Aby to zrobić, jelito musi być ustawione dokładnie w ten sam sposób we wszystkich punktach czasowych. Zalecamy, aby zawsze używać jelita ślepego jako punktu odniesienia, aby znaleźć te same obszary w jelicie cienkim i grubym. Delikatne rozciąganie tkanki zainteresowania za pomocą wacików bawełnianych zapewnia, że obszar zainteresowania znajduje się w zakresie obiektywnej odległości roboczej i maksymalizuje liczbę regionów, które można prześledzić. Ponadto zalecamy, aby zawsze przeprowadzać ablację i obrazować wiele mikroskopijnych pozycji u każdej myszy, aby uwzględnić regiony, które mogą nie zostać zlokalizowane w późniejszej sesji obrazowania. Jeśli nie można znaleźć regionów, mimo że ustawienie jelita jest prawidłowe, pomocne może być przegrupowanie myszy i zmiana orientacji odsłoniętego obszaru. Śledzenie krypt w czasie może być kłopotliwe w przypadku eksperymentów, w których większe pola jelitowe kilku sąsiednich krypt są ablowane. Takie szkodliwe zniewagi mogą wywołać przebudowę tkanki poza monowarstwę nabłonka, co może z czasem doprowadzić do modyfikacji punktów orientacyjnych tkanek używanych do śledzenia regionu. Wybór punktów orientacyjnych znajdujących się w odpowiedniej odległości od uszkodzonego miejsca i uchwycenie większych pól widzenia, które przewyższają uszkodzony obszar o kilkaset mikrometrów, zwiększa szansę na udane długoterminowe eksperymenty. Oprócz nieprawidłowego ułożenia jelita na etapie mikroskopu, ruchy perystaltyczne przewodu pokarmowego mogą zakłócać obrazowanie. Ten problem można rozwiązać na dwa sposoby. Jeśli częstotliwość ruchów nie jest zbyt duża, proces można powtórzyć w tym samym regionie ze zwiększonym czasem ekspozycji. Alternatywnie można zastosować większe ilości znieczulenia w celu zmniejszenia perystaltyki. Zalecamy ograniczenie większych dawek izofluranu do krótkich modyfikacji. Ogólnie rzecz biorąc, sesje obrazowania powinny być jak najkrótsze, optymalnie poniżej 3 godzin, aby zapewnić szybki powrót do zdrowia.

Połączona ablacja laserowa i podłużna mikroskopia przyżyteczkowa ma kilka zalet w porównaniu z innymi modelami uszkodzeń. Poprzednie modele obrażeń (chemicznych) nie były w stanie lokalnie ograniczyć szkodliwej zniewagi 6,11,12,19,20. Ablacja laserowa przezwycięża tę wadę, ograniczając uszkodzenia do określonego obszaru zainteresowania. Dzięki temu badacze mogą kontrolować lokalizację urazu, a także zakres uszkodzeń. Nasilenie uszkodzeń można modulować w celu ablacji krypt lub całych mikroskopijnych pól jelitowych, aby poinformować o reakcjach regeneracyjnych w skali krypty. Oprócz kontroli przestrzennej, ablacja laserowa pozwala również na precyzyjne określenie czasu wystąpienia uszkodzeń, przewyższając tym samym precyzję poprzednich modeli leków, substancji chemicznych i infekcji 9,10,11,12,19,20. Nasz protokół rozszerza poprzednie badania, w których wykorzystano indukowaną laserem ablację termiczną jako metodę wywoływania miejscowego uszkodzenia w jelicie 21,23. Poprzednie modele uszkodzeń wywołanych laserem obrazowały lokalne obszary w jelicie cienkim21 lub powierzchnię światła dystalnej okrężnicy23. Połączenie chirurgii i ablacji laserowej umożliwia wizualizację nabłonka jelitowego (w szczególności krypt) w wysokiej rozdzielczości, a także wykonanie ablacji laserowej i obrazowania kontrolnego odzyskiwania tkanek w dowolnej pozycji jelita cienkiego, jelita ślepego i bliższej części okrężnicy. Rejestruje regenerację tych samych regionów jelitowych w czasie, co pozwala na wizualizację różnych warstw jelita (błony śluzowej, błony podśluzowej, mięśni i błony surowiczej) zgodnie z konfiguracją eksperymentalną. Nasza technika jest głównie dostosowana do długotrwałego, powtarzanego obrazowania przez okres wielu tygodni/miesięcy. Aby zbadać krótkoterminową dynamikę odzyskiwania krypt (np. przez kilka kolejnych dni po uszkodzeniu), opisane tutaj podejście do ablacji laserowej można połączyć z oknami obrazowania przyżyciowego 27,28,40.

Protokół ten może być wykorzystany do wielu zastosowań badawczych z różnych dziedzin naukowych, które obejmują regenerację, immunologię i badania nad rakiem. Obrazowanie podłużne regeneracji jelit rzuca światło na dynamikę komórkową, która zachowuje integralność nabłonka i funkcję bariery, umożliwia obronę gospodarza przed patogenami w świetle jelita oraz leży u podstaw usuwania i rozprzestrzeniania się mutacji onkogennych. Każde pytanie naukowe będzie stawiać inne wymagania dotyczące zakresu uszkodzeń wywołanych przez laser i czasu trwania obrazowania. Fluorescencyjne myszy reporterowe i wstrzykiwane barwniki mogą drastycznie rozszerzyć i udoskonalić dane, które można uzyskać, umożliwiając wizualizację dowolnej komórki i struktury będącej przedmiotem zainteresowania. Na przykład mysz Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti może być używana do wizualizacji potomstwa komórek macierzystych, podczas gdy reporter Rosa26-mTmG informuje o architekturze tkanki. Razem te ostatnie osiągnięcia technologiczne sprawiają, że eksperymenty przyżyciowe w jelitach stają się lukratywnym narzędziem do pogłębiania naszej wiedzy na temat biologii i chorób jelit.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Holenderską Organizację Badań Naukowych NWO (grant Vici 09150182110004 dla J.v.R. i grant Veni 09150161910151 dla H.A.M.), OCENW. GROOT.2019.085 (dla J.v.R) oraz stypendium podoktorskie EMBO (grant ALTF 452-2019 dla H.A.M).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Skrzynka indukcyjna anestezjologiiTechnika weterynaryjna
AutoklawCertoclav
BetadineMylan202809
Pielucha (podkład)Absorin comfort
Kleszcze DumontFine Scientific Tools11255-20 lub 11272-40Inox, styl #55, służy do trzymania otrzewnej
Enzymatyczny środek do czyszczenia narzędziRobozEC-1000
Etanol 80%domowej robotyNA
Maść do oczuDuratears Z (Alcon)288/28282-6
Drobne nożyczki proste 9 cmFine Scientific Tools14060-09Służy do cięcia skóry i otrzewnej myszy
Gaza 5 cmX5 cmCutisoft (Bsn medyczna)45847-00
Graefe Kleszcze Zakrzywione ząbkowaneFine Scientific Tools11051-10Służy do przytrzymywania skóry
Hartman Hemostat StraightFine Scientific Tools13002-10Służy do szycia
Poduszka grzewczaComfortT5-5000
Pudełko do obrazowaniaWykonana
folia do nacinaniaNobafilm172215
Odwrócony wielofotonowy mikroskop z automatycznym stolikiemLeica MicrosystemsNA
Isoflurane (vetflurane)Pharmachemie BV, Haarlem, Holandia305788
Waporyzator izofluranowyPenlon sigma delta
Taśma papierowa MicroporeMicropore
NaCl 0.9%BraunDostępne inne marki
Igła 25GBD300600
Taśma papierowa tesaNA
ParafilmBemisPM-994półprzezroczysta
ŻyletkiSupermax stalInne marki Dostępne
doodbytniczeKent Scientific20250-91
Rimadyl Bydło (karprofen)Zoetis B.VRejestracja# REG NL 10130
Cienkie nożyczki studenckie proste 11,5 cmFine Scientific Tools91460-11Służy do cięcia gazy
Środek do czyszczenia narzędzi chirurgicznychRobozIC-1000
Smar do narzędzi chirurgicznychRobozIL-1000
Strzykawki (1 ml)BD303172Dostępne inne marki
TamoksyfenSigmaT5648
Temgesic (chlorowodorek buprenorfiny)Indivior UK Limited/Reckitt BenckiserHealthcare Registration# RVG 08725
Vicryl polyglactin szew 5-0 FS-2 igłaEthiconV292ZH
VirkonSBio-servicesroztwór antyseptyczny
Drewniany wacik bawełniany (sterylny)Klinion531530Dostępne inne marki
na zamówienie taśma nierdzewna sondy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  2. Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
  3. Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
  4. Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
  5. Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
  6. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  7. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  8. Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
  9. Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
  10. Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
  11. Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
  12. Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
  13. Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
  14. Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
  15. Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
  16. Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
  17. Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
  18. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  19. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  20. Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
  21. Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989(2018).
  22. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  23. Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
  24. Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
  25. Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
  26. Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
  27. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917(2014).
  28. Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647(2019).
  29. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
  30. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
  31. Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
  32. Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937(2020).
  33. Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
  34. Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
  35. Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
  36. Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
  37. Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  40. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dynamika kryptregeneracja tkanekobrazowanie wielofotonowepodzia kryptfuzja kryptnab onek jelitowyobrazowanie pod u ne

Powiązane artykuły