Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Summary

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Abstract

Technologia obrazowania multipleksowanego wykorzystująca kodowanie kreskowe przeciwciał z oligonukleotydami, która sekwencyjnie wykrywa wiele epitopów w tym samym fragmencie tkanki, jest skuteczną metodologią oceny guza, która poprawia zrozumienie mikrośrodowiska guza. Wizualizację ekspresji białek w tkankach utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie uzyskuje się, gdy określony fluorofor jest wyżarzany do kodu kreskowego związanego z przeciwciałem za pomocą komplementarnych oligonukleotydów, a następnie przeprowadza się obrazowanie próbki; Rzeczywiście, metoda ta pozwala na użycie konfigurowalnych paneli ponad 40 przeciwciał w jednej reakcji barwienia tkanek. Metoda ta jest kompatybilna ze świeżo zamrożonymi tkankami, tkankami utrwalonymi w formalinie, tkankami zatopionymi w parafinie, hodowanymi komórkami i komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej, co oznacza, że naukowcy mogą wykorzystać tę technologię do oglądania różnych typów próbek w rozdzielczości pojedynczej komórki. Ta metoda rozpoczyna się od ręcznego protokołu barwienia i utrwalania, a wszystkie kody kreskowe przeciwciał są nakładane za pomocą koktajlu przeciwciał. Przyrząd do barwienia fluidyki jest w pełni zautomatyzowany i wykonuje iteracyjne cykle znakowania, obrazowania i usuwania spektralnie odrębnych fluoroforów, aż wszystkie biomarkery zostaną zobrazowane za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Obrazy są następnie zbierane i kompilowane we wszystkich cyklach obrazowania, aby osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki dla wszystkich markerów. Jednoetapowe barwienie i delikatne usuwanie fluoroforów nie tylko pozwala na wysoce multipleksowaną analizę biomarkerów, ale także zachowuje próbkę do dodatkowej dalszej analizy, jeśli jest to pożądane (np. barwienie hematoksyliną i eozyną). Ponadto oprogramowanie do analizy obrazu umożliwia przetwarzanie obrazu - kompensację dryfu obrazu, odejmowanie tła, segmentację komórek i grupowanie - a także wizualizację i analizę obrazów i fenotypów komórek w celu generowania przestrzennych map sieci. Podsumowując, technologia ta wykorzystuje skomputeryzowany system mikroprzepływowy i mikroskop fluorescencyjny do iteracyjnej hybrydyzacji, obrazowania i usuwania znakowanych fluorescencyjnie sond DNA, które są komplementarne do związanych tkankowo, sprzężonych z oligonukleotydami przeciwciał.

Introduction

Mikrośrodowisko guza (TME) jest niezwykle niejednorodne, składa się z komórek nowotworowych, komórek zrębu nowotworowego, komórek odpornościowych, niekomórkowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej oraz licznych licznych cząsteczek wytwarzanych i uwalnianych przez komórki nowotworowe, zrębowe i odpornościowe^1,2. Coraz więcej dowodów wskazuje, że TME odgrywa kluczową rolę w przeprogramowywaniu różnicowania guza, wzrostu, inwazji, przerzutów i odpowiedzi na terapie³.

Zrozumienie, w jaki sposób różne typy komórek w TME oddziałują na siebie i komunikują się ze sobą za pomocą sieci sygnalizacyjnych, jest niezbędne do poprawy diagnostyki raka, optymalizacji immunoterapii i opracowania nowych metod leczenia⁴. Tradycyjne techniki mikroskopii tkankowej, w tym immunohistochemia (IHC) i immunofluorescencja (IF), są stosowane od dziesięcioleci do badania typów komórek, obfitości i komunikacji w próbkach guza. Niestety, techniki te zazwyczaj mogą ocenić tylko jeden lub dwa markery białkowe w sekcji tkanki i nie mogą ujawnić złożonych relacji przestrzennych i strukturalnych między tymi komórkami^5,8,7.

W ciągu ostatnich dwóch dekad powstało kilka technologii obrazowania multipleksowego⁸. Technologie te zapewniają znacznie lepszy wgląd w skład, funkcję i lokalizację komórek odpornościowych w TME, prowadząc do szybkiego postępu w zakresie zdolności do identyfikacji i przestrzennego profilowania złożonych TME na poziomie pojedynczej komórki^9,10. Relacje przestrzenne i strukturalne różnych komórek nowotworowych i odpornościowych w TME są obecnie w czołówce badań biologicznych i klinicznych z wykorzystaniem tych technologii obrazowania multipleksowego^11,12.

Niedawno opracowana technologia obrazowania multipleksowego, wykorzystująca kodowanie kreskowe przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami, jest wpływową platformą badań biologicznych pojedynczych komórek, opartą na wykrywaniu przeciwciał skoniugowanych oligonukleotydami w próbkach FFPE (utrwalonych w formalinie), zatopionych w parafinie^13,14. Obecnie ta technologia obrazowania multipleksowego pozwala na jednoczesne obrazowanie ponad 100 markerów w jednym przekroju tkanki¹⁵, co zwiększyło liczbę typów komórek, które można rozróżnić in situ. Umożliwia to poziom analizy przestrzennej guza i komórek odpornościowych, który nie jest możliwy przy użyciu tradycyjnych metod immunofenotypowania¹⁶.

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół koniugacji oczyszczonych przeciwciał do oligonukleotydów i walidacji tej koniugacji za pomocą multipleksowanej platformy obrazowania i wielocyklowej procedury obrazowania z tkanką FFPE. Ponadto opisujemy podstawowe procedury przetwarzania obrazu i analizy danych stosowane w tej technologii.

Protocol

To retrospektywne badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the University of Texas MD Anderson Cancer Center. Próbki tkanek FFPE zostały pobrane od pacjentów w MD Anderson w ramach rutynowej standardowej opieki. Nie przeprowadzono interwencji diagnostycznych ani terapeutycznych. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów na wykorzystanie pobranych próbek do badań i publikacji.

1. Źródła przeciwciał użyte do projektowania panelu przeciwciał

1. Stwórz panel przeciwciał do obrazowania multipleksowego po dokładnym rozważeniu jakości tkanek i białek będących przedmiotem zainteresowania. W projekcie panelu przeciwciał brane są pod uwagę trzy źródła przeciwciał: 1) w pełni zwalidowane komercyjnie przeciwciała, 2) przeciwciała przesiewowe za pomocą technologii obrazowania multipleksowego oraz 3) przeciwciała współdzielone przez użytkownika końcowego.
   UWAGA: Wykazano, że przeciwciała przesiewowe w technologii obrazowania multipleksowego działają i są dostępne u dostawców. Te przesiewowe przeciwciała można zastosować do multipleksowanego barwienia obrazu po koniugacji oligonukleotydów przez użytkownika.
2. Jeśli nie można znaleźć interesującego białka w wyżej wymienionych źródłach, należy zastosować klony przeciwciał, o których wiadomo, że współpracują z IHC. Ponadto w tej technologii obrazowania multipleksowego zaleca się stosowanie izotypów IgG, a nie klonów IgM, ze względu na wyższy wskaźnik niepowodzeń w przypadku klonów IgM niż w przypadku klonów IgG.

2. Przed koniugacją przeciwciał

1. Identyfikując klony przeciwciał do koniugacji za pomocą kodów kreskowych obrazowania multipleksowego, należy rozważyć zakup przeciwciał wolnych od nośnika w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub podobnym buforze. Wiadomo, że białka nośnikowe, w tym BSA, gluten, glicerol i inne dodatki białkowe, zmniejszają zdolność koniugacji.
2. Wybierz najbardziej odpowiedni klon przeciwciała i zawsze optymalizuj warunki barwienia (tj. pobieranie antygenu i miareczkowanie) przed koniugacją. W tym celu należy zastosować niesprzężony klon przeciwciała do tkanki dodatniej i ujemnej dla tego przeciwciała przy użyciu standardowego IF lub IHC.
   UWAGA: Jeśli oczyszczone przeciwciało nie jest dostępne na rynku, przed koniugacją należy przeprowadzić proces oczyszczania przeciwciał. Procedura oczyszczania stosowana z zestawami do oczyszczania przeciwciał nie jest w niniejszym dokumencie omówiona.

3. Koniugacja przeciwciał

1. Otrzymać odczynniki do koniugacji przeciwciał. Dostępne na rynku zestawy do koniugacji zawierają roztwór blokujący filtr, roztwór redukcyjny 2, roztwór do koniugacji, roztwór oczyszczający, roztwór do przechowywania przeciwciał (wszystkie przechowywane w temperaturze 4 °C) i roztwór redukcyjny 1 (przechowywane w temperaturze -20 °C).
2. Koniugacja
   UWAGA: Oczyszczone przeciwciało poddaje się działaniu środka redukującego, dzięki czemu zredukowane cząstki przeciwciała reagują z kodem kreskowym multipleksowanego obrazowania używanym w tej technologii, a tym samym tworzą wiązanie kowalencyjne. Proces ten trwa około 4,5 godziny i daje około 120 μl sprzężonego przeciwciała, które jest żywotne przez 1 rok. Całe odwirowanie przeprowadza się w temperaturze pokojowej (RT), a przepływ jest odrzucany, z wyjątkiem ostatniego etapu (ppkt 3.2.9), w którym probówka zbiorcza zawiera sprzężone przeciwciało.
   1. Odessać i nanieść 500 μl roztworu blokującego filtr za pomocą pipety do kolumn filtrujących o masie cząsteczkowej 50 kDa i odwirować w dół przy 12 000 x g przez 2 minuty, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.
      UWAGA: Jeśli zauważalny jest pozostałości roztworu w górnej części kolumny, odwróć filtr w probówce zbiorczej i wiruj w dół przy 3,000 x g przez 2 minuty.
   2. Pobrać pipetę 50 μg przeciwciała w objętości 100 μl roztworu do kolumny filtrującej i odwirować przy 12 000 x g przez 8 min.
      UWAGA: Użyć spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie oczyszczonego przeciwciała i obliczyć objętość roztworu odpowiadającą 50 μg przeciwciała. Jeśli objętość roztworu przeciwciała jest mniejsza niż 100 μl, dostosuj objętość do 100 μl, dodając 1x PBS. Zachować 1 μg niesprzężonego przeciwciała w celu potwierdzenia koniugacji (krok 4.4).
   3. Odpipetować 260 μl głównej mieszanki redukcyjnej (20 μl roztworu redukcyjnego 1 zmieszanego z 825 μl roztworu redukcyjnego 2, co wystarcza do trzech reakcji koniugacji przeciwciał) do każdej kolumny filtracyjnej. Delikatnie wiruj mieszankę główną przez 2-3 sekundy lub pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać roztwór z przeciwciałem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   4. Po inkubacji odwirowywać kolumny filtracyjne przy 12 000 x g przez 8 minut. Dodać 450 μl roztworu koniugacyjnego do kolumn filtracyjnych i wirować przy 12 000 x g przez 8 minut.
   5. Ponownie zawieś żądany kod kreskowy w 10 μl wody wolnej od nukleaz i 210 μl roztworu do koniugacji.
      UWAGA: Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować znacznik przeciwciał do barwienia. Nie należy ponownie używać podwielokrotności kodu kreskowego przeciwciał.
   6. Po zakończeniu odkręcania w kroku 3.2.4 dodać ponownie zawieszony znacznik przeciwciała (około 220 μl) do każdej odpowiedniej kolumny filtrującej. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby wymieszać odczynniki. Zamknąć pokrywy kolumn filtracyjnych i inkubować reakcję koniugacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po 2 godzinach odwirować kolumny filtracyjne przy 12 000 x g przez 8 min.
      UWAGA: W protokole potwierdzenia zaleca się odłożenie 5 μl sprzężonego roztworu w probówce do reakcji łańcuchowej polimerazy i przechowywanie go w temperaturze 4 °C (patrz poniżej).
   7. Odpipetować 450 μl roztworu oczyszczającego do każdej kolumny filtracyjnej i wirować do 12 000 x g przez 8 minut. Powtórzyć trzy razy.
   8. Odpipetować 100 μl roztworu do przechowywania do kolumn filtracyjnych. Delikatnie odpipetować mieszaninę w górę iw dół ponad 10 razy i ostrożnie umyć boki filtrów w kolumnie.
      UWAGA: Rozpuścić 50 μg przeciwciała w 100 μl roztworu do przechowywania. Jeśli reakcja koniugacji rozpoczyna się od więcej niż 50 μg przeciwciała, dodaj więcej roztworu magazynującego w tym stosunku.
   9. Odwróć kolumny filtracyjne w świeżej probówce zbiorczej. Wirować w dół przy 3,000 x g przez 2 minuty przy RT. Zachowaj zebrany roztwór. Pipetować sprzężony roztwór przeciwciała do sterylnych zakręcanych probówek i przechowywać przez okres do 1 roku w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Przeciwciało sprzężone należy przebadać za pomocą technologii obrazowania multipleksowego po 2 dniach. Wcześniejsze testy mogą skutkować silnym zabarwieniem jądrowym tła.

4. Potwierdzenie koniugacji

UWAGA: Przed przeprowadzeniem eksperymentów barwienia przeciwciałem sprzężonym przez użytkownika przy użyciu technologii obrazowania multipleksowego, koniugacja powinna być potwierdzona za pomocą elektroforezy żelowej z 5 μL sprzężonego przeciwciała (patrz krok 3.2.6) wraz z 1 μg niesprzężonego przeciwciała (zwykle w 2 μL mieszaniny) jako kontrola. Udana koniugacja przeciwciał zostanie wykazana przez wzrost masy cząsteczkowej przeciwciała. Jednak ten protokół potwierdzenia ocenia jedynie powodzenie reakcji chemicznej do koniugacji i nie odnosi się do walidacji przeciwciał stosowanej do obrazowania multipleksowego.

1. Odpipetować odpowiednio 8 μl i 11 μl wody wolnej od nukleaz do zarezerwowanego przeciwciała sprzężonego i przeciwciała kontrolnego niesprzężonego, aby uzyskać końcową objętość 13 μl.
2. Pobrać pipetą 5 μl buforu do próbki LDS (lub innego systemu elektroforezy z dodecylosiarczanem sodu i żelem poliakrylamidowym) i 2 μl środka redukującego próbkę do każdej próbki zarezerwowanego sprzężonego przeciwciała i poddać próbki denaturacji w suchej łaźni o temperaturze 95 °C przez 10 minut.
3. Podczas denaturacji próbek rozcieńczyć 40 ml buforu MOPS SDS w 760 ml ultraczystej wody, umieścić żel w zbiorniku systemu elektroforezy i wlać rozcieńczony bufor do pracy na żel.
4. Po zakończeniu 10-minutowego okresu denaturacji załadować jedną studzienkę żelu wstępnie wybarwionym wzorcem białka, jedną z niesprzężonym przeciwciałem (z kroku 3.2.2), a pozostałe studzienki próbkami sprzężonych przeciwciał. Następnie uruchom żel pod napięciem 150 V, aż na końcu żelu pojawi się wzorzec białka.
   UWAGA: Żel łatwo przylega do pojemników nadających się do kuchenki mikrofalowej, a tym samym może się rozerwać, dlatego w kolejnych krokach należy obchodzić się z żelem ostrożnie.
5. Po zakończeniu biegu przenieś żel do pojemnika nadającego się do kuchenki mikrofalowej, wstępnie napełnionego ultraczystą wodą i podgrzewaj go w kuchence mikrofalowej, aż pojawi się pierwszy pęcherzyk w wodzie.
   UWAGA: Czas tworzenia się bąbelków różni się znacznie w zależności od używanej kuchenki mikrofalowej.
6. Spuść wodę z pojemnika, wlej około 250 ml barwnika Coomassie G-250 na żel i podgrzej żel w kuchence mikrofalowej, aż pojawi się pierwsza bańka. Następnie wyjmij pojemnik z żelem i plamą Coomassie G-250 z kuchenki mikrofalowej i umieść go na shakerze na 10 minut.
7. Po wstrząśnięciu ostrożnie odcedź plamę, zastąp ją około 200 ml ultraczystej wody, a następnie umieść pojemnik na shakerze, aby umyć żel.
8. Spuść ultraczystą wodę i zastąp ją nową ultraczystą wodą pięć razy lub do momentu, gdy resztki plamy nie będą widoczne w kąpieli wodnej. Pozostaw żel do umycia na noc na shakerze, aż pasma będą widoczne, jeśli to konieczne, przed sfotografowaniem żelu (Rysunek 1).
   UWAGA: Przeciwciała stosowane w obrazowaniu multipleksowanym powinny mieć wzorce barwienia porównywalne z przeciwciałami sprzężonymi z barwnikiem. Skrawki tkanek ze znanymi antygenami dodatnimi dla przeciwciał sprzężonych mogą być barwione przeciwciałami sprzężonymi z oligonukleotydami i barwnikami. W tej pracy, w każdym przypadku, morfologie tkanek dla obu typów przeciwciał były równoważne i zharmonizowane ze sobą, podobnie jak przewidywana dystrybucja komórek, w oparciu o biologię badanych białek i próbek tkanek testowych. Wynik ten pokazuje skuteczność stosowania ugrupowań przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami do metod opartych na barwieniu tkanek z wykorzystaniem tkanki FFPE.

5. Barwienie przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami

1. Przygotuj szkiełka nakrywkowe do umieszczenia tkanek.
   1. Namocz szkiełka nakrywkowe w 0,1% roztworze poli-L-lizyny przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, aby poprawić przyleganie tkanek.
   2. Po namoczeniu odcedź roztwór poli-L-lizyny i myj szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą przez 30 sekund. Powtórz mycie od czterech do sześciu razy. Usuń szkiełka nakrywkowe z ultraczystej wody używanej do mycia i umieść je na niestrzępiącym się ręczniku do wyschnięcia przez noc.
      UWAGA: Histolog musi pociąć wybraną tkankę na odcinki o grubości 5 μm, umieścić je na środku szkiełka nakrywkowego naładowanego poli-L-lizyną i pozostawić do wyschnięcia na noc. Po wyschnięciu szkiełka nakrywkowe z skrawkami tkanek muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 6 miesięcy. Panel barwienia w tym protokole zawierał 26 markerów. Tkanka użyta w tym protokole była normalną ludzką tkanką migdałkową. Czas namaczania szkiełek nakrywkowych nie powinien przekraczać 1 tygodnia. Szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej i muszą być zużyte w ciągu 2 miesięcy od przygotowania.
2. Dzień przed barwieniem umieść uchwyt na szkiełko nakrywkowe w piekarniku o temperaturze 60 °C na noc.
3. Następnego dnia umieścić próbkę szkiełka nakrywkowego w nagrzanym uchwycie na szkiełko nakrywkowe w suszarce o temperaturze 60 °C. Po pieczeniu przez 30 minut sprawdź, czy parafina rozpuściła się z tkanki.
4. Szybko umieścić uchwyt/próbkę szkiełka nakrywkowego w następującej serii roztworów: dwie rundy środka do odparafinowania przez 6 minut każda; dwie rundy 100% etanolu przez 5 minut każda; jedna runda 90% etanolu przez 5 minut; jedna runda 70% etanolu przez 5 minut; jedna runda 50% etanolu przez 5 minut; jedna runda 30% etanolu przez 5 minut; i dwie rundy ultraczystej wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC) przez 5 minut każda.
   UWAGA: Wszystkie rozcieńczenia etanolu są przygotowywane z ultraczystą wodą uzdatnioną DEPC. Jeśli ksylen jest używany do odparafinowania, należy go użyć w okapie.
5. Poddając uchwyt szkiełka nakrywkowego/próbkę serii roztworów, należy wykonać następujące czynności:
   1. Przygotuj komorę wilgotnościową, umieszczając na dnie puste pudełko po końcówkach do pipet z ręcznikiem papierowym nasączonym wodą.
   2. Napełnij szybkowar wystarczającą ilością wody, aby do połowy pokryć zlewkę o pojemności 50 ml.
   3. Umieścić 5 ml metanolu na próbkę w zlewce w temperaturze 4 °C.
   4. Rozcieńczyć bufor AR9 ultraczystą wodą uzdatnioną DEPC do 1x; potrzeba około 50 ml rozcieńczonego buforu na uchwyt szkiełka nakrywkowego.
6. Po zakończeniu serii roztworów napełnij szklaną zlewkę o pojemności 50 ml około 40 ml buforu 1x AR9, zanurz uchwyt/próbkę szkiełka nakrywkowego w zlewce i całkowicie przykryj zlewkę/uchwyt szkiełka nakrywkowego folią aluminiową.
   1. Umieść pokrytą folią aluminiową zlewkę/uchwyt szkiełka nakrywkowego w szybkowarze wypełnionym wodą i gotuj pod wysokim ciśnieniem (około 15 psi) przez 20 minut.
   2. Po ugotowaniu wyjmij zlewkę/uchwyt szkiełka nakrywkowego, ostrożnie rozwiń folię aluminiową i pozwól zlewce/szkiełku nakrywkowemu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.
   3. Wyjmij uchwyt/próbkę szkiełka nakrywkowego z bufora 1x AR9 i zanurz ją w dwóch rundach ultraczystej wody poddanej działaniu DEPC, wykonując inkubację próbek w obu rundach przez 2 minuty każda.
   4. Podczas inkubacji pobrać bufor hydratacyjny, roztwory blokujące N, blokujące G, blokujące J i blokujące S oraz rozcieńczalnik/blok przeciwciał z zestawu do barwienia multipleksowanego obrazowania. W przypadku dwóch próbek szkiełek nakrywkowych oznacz płytki 6-dołkowe dla roztworów, korzystając z konfiguracji pokazanych na rysunku Rysunek 2.
   5. Umieścić próbkę szkiełka nakrywkowego w dwóch rundach po 5 ml buforu hydratacyjnego na 2 minuty każda.
   6. Po obu rundach umieszczania w buforze hydratacyjnym umieścić próbkę szkiełka nakrywkowego w 5 ml rozcieńczalnika/bloku przeciwciał do obrazowania multipleksowanego i inkubować przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej (nie przekraczać 30 minut).
   7. Podczas inkubacji należy przygotować koktajl przeciwciał, sporządzając 200 μl mieszanki wzorcowej roztworów rozcieńczalnika/bloku przeciwciał do obrazowania multipleksowanego, blokera N, blokera G, blokera J i blokera S.
      UWAGA: Oblicz całkowitą ilość przeciwciał na podstawie liczby markerów i zwalidowanego miareczkowania każdego markera, a następnie odejmij całkowitą ilość przeciwciał od mieszanki wzorcowej. Na przykład dla sześciu markerów, z których każdy ma miareczkowanie 1:200, równanie wyglądałoby następująco: 200 μl mieszanki głównej − 6 μl koktajlu przeciwciał = 194 μl mieszanki głównej.
7. Po inkubacji w rozcieńczalniku/bloku przeciwciał do multipleksowania do obrazowania, umieścić próbkę szkiełka nakrywkowego w komorze wilgotnościowej przygotowanej w kroku 5.5.1, odpipetować 190 μl koktajlu przeciwciał na próbkę szkiełka nakrywkowego i inkubować próbkę szkiełka nakrywkowego w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
   1. Po inkubacji przemyć próbkę szkiełka nakrywkowego w dwóch rundach 5 ml rozcieńczalnika/bloku przeciwciał do obrazowania multipleksowanego przez 2 minuty każda.
   2. Aby związać przeciwciała z tkanką na szkiełku nakrywkowym, należy wykonać kroki 5.7.3-5.7.5 w komorze wilgotnościowej.
   3. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 10 minut z 16% formaldehydem rozcieńczonym do 1,6% roztworem do przechowywania, a następnie umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x PBS.
   4. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 5 minut z metanolem o temperaturze 4 °C, a następnie przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x PBS.
   5. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 20 minut z 5 ml odczynnika utrwalającego rozcieńczonego 1x PBS, a następnie przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 1x PBS.
   6. Przechowywać zabarwione szkiełka nakrywkowe w buforze do przechowywania w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni

6. Płytka reporterska do obrazowania multipleksowanego

UWAGA: Płytka 96-dołkowa, określana jako płytka reporterowa, zawierająca fluorofory z kodami kreskowymi w indywidualnych dołkach, jest przygotowywana zgodnie z specjalnie zaprojektowanymi eksperymentami z obrazowaniem multipleksowanym i koreluje z każdą próbką barwionego szkiełka nakrywkowego. Poniższe kroki służą do przygotowania płytki reporterowej.

1. Przygotować wzorcową mieszaninę reporterową, łącząc 4,880 μl wody wolnej od nukleaz, 600 μl 10-krotnie multipleksowanego buforu do obrazowania, 500 μl odczynnika do oznaczania i 20 μl roztworu barwienia jądrowego. To wystarczy na 20 cykli wszystkich studni.
2. W każdym cyklu specjalnie zaprojektowanego eksperymentu z obrazowaniem multipleksowym należy wypełnić studzienkę 245 μl roztworu zawierającego wzorcową mieszaninę reporterową i specyficzne dla tego cyklu fluorofory z kodami kreskowymi.
   UWAGA: Zobacz Rysunek 3 dla konfiguracji płytki reportera używanej w tym protokole dla panelu rakowego.
3. Aby chronić fluorofory z kodami kreskowymi, przyklej foliową osłonę płytki na płytkę reporterową i umieść płytkę w multipleksowanym przyrządzie do obrazowania.
4. Płytkę reportera należy przechowywać w ciemnym pudełku w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.

7. Kalibracja i uruchamianie maszyny do obrazowania multipleksowego

UWAGA: Mikroskop fluorescencyjny do obrazowania o wysokiej rozdzielczości rejestruje cztery różne kanały fluorescencyjne w każdym cyklu obrazowania multipleksowanego przy 20x, 100% świetle wzbudzającym i przy niskim fotowybielaniu.

1. Skalibruj ostrość obrazowania za pomocą kanału DAPI, umieszczając szkiełko nakrywkowe próbki na stoliku mikroskopu, ręcznie pipetując 700 μl roztworu barwienia jądrowego w stosunku 1:1 500 na tkankę.
   UWAGA: Szkiełko nakrywkowe jest zatrzymywane na stoliku mikroskopu podczas mycia próbki i obrazowania.
2. Aby przygotować multipleksowany przyrząd do obrazowania, rozcieńczyć 10-krotnie multipleksowany bufor obrazowania do 1x za pomocą ultraczystej wody uzdatnionej DEPC i napełnić butelki z odczynnikami odpowiednimi roztworami/rozpuszczalnikami, w tym rozcieńczonym 1-krotnym multipleksowanym buforem do obrazowania, ultraczystą wodą poddaną DEPC i dimetylosulfotlenkiem (DMSO).
3. Po odpowiednim napełnieniu butelek z odczynnikami, wprowadź projekt eksperymentu do oprogramowania do zarządzania multipleksami przyrządów do obrazowania; wyznacz prawidłowy cykl, numery studzienek, miejsca w stosie z, nazwę markera, klasę i czas ekspozycji dla każdego cyklu (Rysunek 4); ustaw wszystkie parametry mikroskopu; i wybierz obszary zainteresowania na szkiełku nakrywkowym próbki, które mają zostać zobrazowane.
   1. Kliknij przycisk Eksperyment w oprogramowaniu sterującym (Rysunek 4A). W oknie Experiment Setup and Management (Ustawienia eksperymentu i zarządzanie nim) kliknij przycisk New Template (Nowy szablon) (Rysunek 4B).
   2. Wpisz nazwę projektu w miejscu obok przycisku Projekt (Rysunek 4C). Wpisz lub wybierz całkowitą liczbę cykli (Rysunek 4D).
   3. Kliknij przycisk Przypisanie kanału, wpisz informacje dla każdego cyklu w kolumnach (Rysunek 4E) i kliknij przycisk Zapisz szablon. Rozpocznij eksperyment, klikając przycisk Rozpocznij eksperyment.
      UWAGA: Podczas eksperymentu z obrazowaniem multipleksowym przyrząd pobiera fluorofory z kodami kreskowymi z jednej studzienki płytki reporterowej (maksymalnie cztery fluorofory na dołek, w tym DAPI), dozuje je bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe próbki i obrazuje obszary zainteresowania dla każdego kanału fluorescencji. Po wszystkich obrazach dla tego cyklu, przyrząd zmywa fluorofory z kodami kreskowymi i dozuje następny cykl reporterów (z następnego dołka na płytce reporterowej). Obrazowanie jest kontynuowane do momentu zakończenia wszystkich cykli z użyciem 26 markerów.

8. Kolekcja obrazów

UWAGA: Multipleksowane obrazy mogą być zbierane za pomocą dowolnego dostosowanego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego skonfigurowanego z czterema kanałami fluorescencji (DAPI, Cy3, Cy5 i Cy7) i wyposażonego w obiektyw Plan Fluor 20x. Obrazowanie i mycie próbek szkiełek nakrywkowych odbywa się iteracyjnie automatycznie przy użyciu specjalnie opracowanego zestawu fluidycznego. Obrazy są uzyskiwane za pomocą oprogramowania procesora (wersja 1.8.0.7) w formacie QPTIFF.

1. W oknie procesora kliknij przycisk Input (Wejście) i wybierz nazwę eksperymentu.
2. W sekcji Opcje przetwarzania wybierz i zaznacz opcje Odejmowanie tła, Dekonwolucja, Rozszerzona głębia ostrości i Korekcja cieniowania. Kliknij przycisk Start.

9. Analiza obrazu

UWAGA: Pozyskane obrazy można przesłać do opatentowanego oprogramowania do automatycznej analizy obrazów lub oprogramowania typu open source (Rysunek 5) w celu dalszej analizy.

1. Kliknij ikonę QuPath na komputerze i otwórz oprogramowanie. Przeciągnij plik QPTIFF do okna przeglądarki.
2. Kliknij na przycisk Jasność i Kontrast, który otworzy okno Jasność i Kontrast. Zaznacz lub usuń zaznaczenie znacznika w kolumnie Wybrane, aby wyświetlić lub zamknąć sygnał znacznika.
3. Kliknij przycisk Powiększ, aby dopasować, aby powiększyć lub pomniejszyć obszar zainteresowania.
   UWAGA: Zwielokrotniona wizualizacja danych obrazu zapewnia użytkownikowi głęboki wgląd w mikrośrodowisko tkanek. Poszczególne markery w próbkach FFPE mogą być wizualizowane w formacie fluorescencyjnym (Rysunek 6 i Rysunek 7) lub w widoku patologii. Do przetwarzania złożonych obrazów i analizy multipleksowanych obrazów tkanek można wykorzystać kilka platform obliczeniowych. Korzystając z tego oprogramowania, fenotypowanie przestrzenne, a także odkrywanie rzadkich komórek i obliczanie sąsiedztwa komórek, mogą być realizowane za pomocą obrazów całych slajdów tkanki o ultrawysokiej multipleksacji wygenerowanej za pomocą technologii obrazowania multipleksowego. Zobacz Rysunek 6 dla 26 przeciwciał w panelu raka i próbce migdałka (Rysunek uzupełniający 1).

Results

Wykorzystaliśmy próbki migdałków FFPE do opracowania 26-markerowego panelu immunologicznego onkologicznego, aby zilustrować stan immunologiczny tkanki FFPE za pomocą systemu analizy obrazu z kodowaniem kreskowym. Ogólnie rzecz biorąc, 19 przeciwciał jest obecnie stosowanych w innych badaniach obrazowania multipleksowego w naszym laboratorium. Wszystkie markery zostały przetestowane przy użyciu tkanki FFPE z chromogennym IHC. Wszystkie przeciwciała były sprzężone z unikalnymi oligonukleotydami DNA. Podczas ustawiania szkiełek nakrywkowych za pomocą internetowego menedżera przyrządów (Rysunek 4) dla tej technologii analizy obrazu z kodami kreskowymi, należy zauważyć, że pierwszy i ostatni cykl są zawsze "puste" (Rysunek 2 i Rysunek 4), który zapewnia sygnały fluorescencji tła, które należy odjąć od określonych sygnałów przeciwciał. Po zebraniu obrazów w formacie QPTIFF za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego można je wizualizować za pomocą kilku opatentowanych programów do automatycznej analizy obrazów lub programów typu open source. Obrazy kompozytowe mogą pokazywać wszystkie znaczniki lub wybrane znaczniki, aby uzyskać lepszy widok sygnałów (Rysunek 5). Co więcej, każde przeciwciało można wizualnie ocenić pod kątem lokalizacji jądrowej, cytoplazmatycznej lub błoniastej. Komórki odpornościowe, nowotworowe i zrębowe można łatwo zidentyfikować. Następnie analiza obrazu może dostarczyć informacji o intensywności sygnału, zakresie dynamicznym i rozkładzie przestrzennym wszystkich markerów (Rysunek 6). Ta technika pozwoliła nam przeanalizować wszystkie 26 markerów na poziomie subkomórkowym w jednym przekroju tkanki (Rysunek 7). Analizując kolokalizację markerów, mogliśmy zidentyfikować fenotypy komórkowe, zlokalizować przestrzenne położenie komórki, obliczyć odległość między komórkami i znaleźć rozmieszczenie komórek. Kluczowym osiągnięciem tej technologii jest prezentacja solidnego panelu 26 markerów skoncentrowanych na statusie immunologicznym mikrośrodowiska tkankowego.

Rysunek 1: Obraz walidacji przeciwciał skoniugowanych na zamówienie przy użyciu żelu białkowego Bis-Tris. Pas 1 żelu pokazuje wzorzec białka. Pas 2 i tor 4 pokazują przeciwciała sprzężone z kodami kreskowymi (strzałki). Pas 3 i tor 5 pokazują ciężkie i lekkie pasma łańcuchowe z niesprzężonego przeciwciała (groty strzałek). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Mapa konfiguracji płytki barwiącej dla dwóch próbek szkiełek nakrywkowych. Skróty: HB = bufor hydracyjny; B = rozcieńczalnik/blok przeciwciał; PSFS = roztwór utrwalający po barwieniu; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami; MeOH = metanol; S = roztwór do przechowywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Konfiguracja płyty reportera. Każde sprzężone przeciwciało ma kod kreskowy, który jest komplementarny do określonego reportera. Aby ustawić płytkę reporterową, należy wymienić każde sprzężone przeciwciało i odpowiadający mu reporter. Następnie każdemu przeciwciału przypisywany jest numer cyklu. Wydajność dwóch cykli ślepej próby (C1 i C18) służy do oceny poziomu autofluorescencji w trzech kanałach fluorescencyjnych oraz do odejmowania tła po obrazowaniu za pomocą oprogramowania sterującego akwizycją obrazu. Na tym etapie kreator oprogramowania sprawdzi urządzenie, aby upewnić się, że wszystkie ustawienia są poprawne (Rysunek 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Akwizycja obrazu za pomocą oprogramowania sterującego do konfiguracji eksperymentu. (A) Wybierz zakładkę Eksperyment w lewym dolnym rogu oprogramowania sterującego, aby przygotować i rozpocząć instalację. (B,C) Wybierz pozycję Nowy szablon, aby wprowadzić ustawienia eksperymentalne z nową nazwą projektu i eksperymentu. (D) Zmienić studzienkę początkową cyklu i liczbę cykli, aby odzwierciedlić lokalizację reportera w 96-dołkowej tabliczce reporterowej. (E) Przypisać właściwe kanały fluorescencyjne do czterech kanałów wyznaczonych do przebiegu doświadczalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wizualizacja obrazu za pomocą oprogramowania internetowego (QuPath). W oknie przeglądarki pokazanych jest 26 markerów w wycinku FFPE barwionej tkanki migdałków. W oknie Jasność i kontrast wyświetlane są znaczniki ze znacznikami wyboru. Na koniec w oknie przeglądarki pojawia się próbka FFPE z wybranymi znacznikami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Wizualizacja obrazu za pomocą oprogramowania internetowego. (A) Skrawki tkanki migdałków wybarwiono dla 26 markerów, a obrazy przekrojów w formacie QPTIFF wizualizowano za pomocą komercyjnego oprogramowania do przeglądania slajdów cyfrowych lub oprogramowania typu open source (QuPath) w celu adnotacji i przeglądu. (B-F) Sześć znaczników zostało wyświetlonych w tej samej adnotacji, aby zapewnić lepszy widok sygnałów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Widoki 26 indywidualnych znaczników używanych w oprogramowaniu internetowym. Ekspresja markera w tkance migdałka jest pokazana za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego za pomocą panelu immunoonkologicznego (u góry po lewej). Pokazane są poszczególne znaczniki w dwóch małych obszarach (czerwone prostokąty). Powiększona wstawka pokazuje komórki dodatnie dla tych znaczników (białe strzałki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Podsumowanie procesu akwizycji obrazów multipleksowanych. Wycinki tkanek FFPE wybarwiono przy użyciu panelu 26 przeciwciał, a następnie przeprowadzono reakcję wielocyklową. Surowe obrazy wybarwionych skrawków poddano obróbce obliczeniowej, a przy użyciu obrazów kompozytowych przeprowadzono analizę gęstości komórek i analizę przestrzenną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Walidacja IHC w tkance migdałków. Wycinki tkanek FFPE barwiono przy użyciu pojedynczego przeciwciała. Wyrażenie markera w tkance migdałka jest pokazane w małym powiększeniu, a powiększona wkładka pokazuje komórki dodatnie dla markera (czerwone prostokąty). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

TME odgrywa zasadniczą rolę w rozwoju, progresji i odpowiedziach na leczenie. Ponadto gęstość specyficznych podzbiorów limfocytów naciekających nowotwór w TME może służyć jako biomarker prognostyczny dla niektórych typów raka. Co ciekawe, oprócz składu komórkowego TME, charakterystyka przestrzenna guza może stanowić zarys dla zrozumienia biologii guza i identyfikacji potencjalnych biomarkerów prognostycznych^12,17.

Ponieważ liczne populacje komórek odpornościowych są zaangażowane w odpowiedzi prorakowe lub przeciwnowotworowe, lepsze zrozumienie tych komórek i ich relacji przestrzennych między sobą oraz z komórkami nowotworowymi pomoże w identyfikacji nowych strategii immunoterapeutycznych. Wcześniejsze badania stratyfikowały lokalizację i rozmieszczenie przestrzenne komórek TME na podstawie struktury tkanki w obszarach wewnątrznowotworowych i okołonowotworowych oraz inwazyjnych marginesów komórek nowotworowych^18,19. W ciągu ostatnich 15 lat postęp technologiczny sprawił, że analiza fenotypowa pojedynczych komórek na podstawie ich przestrzennego rozproszenia stała się nowym, wpływowym narzędziem do badania TME i kategoryzacji potencjalnych biomarkerów do immunoterapii nowotworów. Histochemia Multiplex IF może jednocześnie oszacować wiele markerów biologicznych²⁰.

Podobnie jak w przypadku strategii przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami, do badania TME wykorzystuje się cztery typy platform multipleksowych opartych na białkach: systemy wykrywania przeciwciał znakowanych chromegenem, fluorescencją, kodami kreskowymi DNA i izotopami metali. Ekonomiczne chromogeniczne platformy IHC umożliwiają wizualizację całego preparatu i ocenę patologiczną przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii jasnego pola. W multipleksowanych IF i IHC stosuje się przeciwciała sprzężone z fluoroforami. Platforma multipleksowa IF/IHC wykrywa przeciwciała o wysokiej swoistości i może określić ilościowo docelowe przeciwciała nawet na poziomie subkomórkowym ^6,21. Ponadto, ze względu na charakter chromogenów i fluoroforów, zastosowanie jednego panelu przeciwciał może uchwycić ekspresję do 10 biomarkerów na jednym szkiełku. Na platformach opartych na izotopach metali przeciwciała znakowane metalem są używane do wykonywania obrazowania multipleksowego z rozdzielczością pojedynczą komórkową i przestrzenną oraz wysoką czułością dla poszczególnych odcinków tkanek²². Teoretycznie te metody oparte na przeciwciałach sprzężonych z metalami umożliwiają jednoczesne wykrywanie ponad 100 biomarkerów na jednym wycinku tkanki. Jednym z wyzwań związanych z techniką znakowania izotopowego jest interferencja izobaryczna, która uniemożliwia osiągnięcie 100% czystości wzbogacenia²³. Co więcej, interferencja zwiększa się wraz ze wzrostem liczby markerów. Platformy wykrywania przeciwciał sprzężonych z DNA rozpoznają przeciwciała oznaczone unikalnymi kodami kreskowymi DNA. Na tych platformach można jednocześnie rejestrować ponad 40 biomarkerów z wysoką swoistością⁶.

Obrazowanie multipleksowe to dostępna na rynku platforma wykrywania przeciwciał znakowanych kodem kreskowym DNA do nakładania przeciwciał sprzężonych z DNA na pojedynczy szkiełko tkankowe w jednym kroku (ryc. 8). Na etapie przygotowania tkanki, w przeciwieństwie do platformy obrazowania multipleksowanej wiązką jonów, która wymaga użycia szkiełek pokrytych złotem uzyskanych od producentów, platforma obrazowania multipleksowanego wymaga jedynie zwykłych szkiełek nakrywkowych lub szkiełek pokrytych 0,1% poli-L-lizyną, aby pomóc tkance przylegać do niej i utrzymać tkankę w stanie nienaruszonym podczas procesu barwienia i obrazowania. Zaleca się stosowanie skrawków tkanek na szkiełkach nakrywkowych w ciągu 4 tygodni po sekcji, ponieważ długotrwałe przechowywanie niebarwionych preparatów powoduje zmniejszenie antygenowości. Barwioną próbkę szkiełka nakrywkowego można przechowywać w buforze do przechowywania w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni bez utraty sygnału barwienia. Do przechowywania próbek szkiełek nakrywkowych nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt. System obrazowania multipleksowego został zmodernizowany tak, aby zamiast szkiełek nakrywkowych używał zwykłych szkiełek, co umożliwia barwienie większych tkanek i łatwą obsługę. W przypadku stosowania roztworu redukującego do koniugacji przeciwciał (krok 3.2.3), reakcja powinna być ograniczona do nie więcej niż 30 minut, aby zapobiec uszkodzeniu przeciwciał. blokujące w kroku 5.6.6 powinny być świeżo przygotowane, a blokujące nie mogą być ponownie używane.

W porównaniu z platformami wykrywania przeciwciał multipleksowych znakowanymi chromogenem, fluorescencją i izotopami metali, technologia obrazowania multipleksowego ma pewne zalety. Na przykład na rynku dostępnych jest ponad 60 wstępnie zaprojektowanych paneli przeciwciał do obrazowania multipleksowego, co pomaga zaoszczędzić czas i koszty związane z koniugacją i walidacją przeciwciał, a liczba wstępnie zaprojektowanych paneli przeciwciał rośnie. Przeciwciała te, które obejmują marker raka pan-cytokeratynę, marker czerniaka SOX10, marker naczyniowy CD31, marker zrębowy SMA i liczne markery komórek odpornościowych, są zwalidowane i gotowe do eksperymentu. W przypadku przeciwciał, które nie są wstępnie zaprojektowane, dostępny na rynku zestaw do koniugacji przeznaczony do użytku z obrazowaniem multipleksowym jest prosty i przyjazny dla użytkownika. Przeciwciała sprzężone z klientem są dobre przez 1 rok, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C. Ponadto do wykonania zdjęć nie jest wymagana rozgrzewka maszyny. W tej technologii obrazowania multipleksowego iteracyjne etapy mycia, hybrydyzacji i usuwania w akwizycji obrazu rzadko skutkują zmniejszeniem intensywności markera lub degradacją morfologii tkanek ^5,24,25. Co więcej, obrazy kompozytowe są rejestrowane w formacie QPTIFF za pomocą prostego trójkolorowego mikroskopu fluorescencyjnego i mogą być przesyłane i analizowane za pomocą oprogramowania do analizy cyfrowej innych firm. Markery barwienia można wizualizować w rozdzielczości pojedynczej komórki, a fenotypy komórek można scharakteryzować poprzez kolokalizację markerów (ryc. 6 i ryc. 7). Kompleksowa analiza obrazu multipleksowego ujawnia ponadto przedziały tkankowe, kwantyfikację markerów jednokomórkowych oraz dane dotyczące najbliższego sąsiedztwa i bliskości (ryc. 8).

Wyzwaniem w multipleksowej analizie obrazu jest identyfikacja typu komórki. Zazwyczaj, gdy do obrazu stosuje się więcej klasyfikatorów pojedynczych obiektów, adnotacje do nich dodawane są rzadziej spotykane fenotypy. Dlatego zaleca się stosowanie znanych markerów, które nie ulegają koekspresji w tym samym klasyfikatorze i stosowanie tylko klasyfikatora związanego z fenotypem do adnotacji pojedynczych komórek. Różnice w adnotacji typu komórki spowodują zasadniczo różne wyniki przestrzenne, takie jak różnice w rozmieszczeniu przestrzennym komórek i analizie sąsiedztwa komórkowego^26,27.

Wielopoziomowa analiza obrazu okazała się skuteczna w barwieniu i obrazowaniu wielu typów próbek, w tym tkanki FFPE, świeżo zamrożonej tkanki, zarchiwizowanych całych preparatów i mikromacierzy tkankowych. Multipleksowane obrazy piersi, mózgu, płuc, śledziony, nerek, węzłów chłonnych i skrawków tkanki skórnej można uzyskać za pomocą głębokich danych fenotypowania przestrzennego pojedynczych komórek 5,16,25,28.

Oczekuje się, że w przyszłości pojawi się więcej wstępnie zaprojektowanych przeciwciał do obrazowania multipleksowego. Ponadto bardzo potrzebne jest opracowanie specjalnego oprogramowania do multipleksowej analizy obrazu. Obecnie istnieje wiele dostępnych na rynku i otwartych programów do analizy obrazu Hi-Plex²⁹, ale naukowcy nadal potrzebują pomocy w stworzeniu standardowego przepływu pracy dla tych analiz^30,31. Chociaż obrazy kompozytowe przechwycone za pomocą tego protokołu są kompatybilne z oprogramowaniem innych firm, może to spowodować dodatkowe koszty dla użytkownika. Kolejną wadą technologii obrazowania multipleksowego jest redukcja sygnału w wykrywaniu białek jądrowych po iteracyjnym myciu, hybrydyzacji i zdzieraniu za pomocą dużych paneli przeciwciał. Na szczęście można to zminimalizować, pobierając fluorofory z kodami kreskowymi we wczesnych cyklach podczas projektowania płytek reporterskich. Niedawno platforma ta została zmodernizowana o nowy system szybkiego skanowania, który znacznie skrócił czas uzyskiwania obrazów kompozytowych³². Ponadto doniesiono, że nowa strategia wykorzystująca kody kreskowe sprzężone z tyramidem usprawnia obrazowanie oparte na kodowaniu kreskowym przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami. Technologia ta ma na celu wzmocnienie sygnałów barwienia, dla których trudno jest uzyskać przeciwciała sprzężone z kodem kreskowym³³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Bufor AR9	Akoya Biosciences	AR900250ML
10x Bufor	Akoya Biosciences	7000001
16% paraformaldehyd	Thermo Fisher Scientific	28906
1X Rozcieńczalnik/Blok przeciwciał	Akoya Biosciences	ARD1001EA
Zestaw do koniugacji przeciwciał	Akoya Biosciences	7000009	Zawiera roztwór blokujący filtr, roztwór redukujący przeciwciała 1, roztwór redukujący przeciwciała 2, roztwór sprzęgający, roztwór oczyszczający, roztwór do przechowywania przeciwciał
Odczynnik do oznaczania	Akoya Biosciences	7000002
pirowęglan dietylu	Sigma-Aldrich	40718-25ML
wysokotlenowy	Avantor/VWR	BDH1115-4LP
200 proof
G Blocker V2	Akoya Biosciences	240199
Histoclear	Thermo Fisher Scientific	50-329-50
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Milli-Q Integral 10	Milipore
Mikroskop fluorescencyjny Niknon	Keyence Corp. of America	BZ-X810
Plama jądrowa	Akoya Biosciences	7000003
Woda wolna od nukleaz	Thermo Fisher Scientific	AM9938
NuPAGE	Thermo Fisher Scientific	NP0008
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190136
Kombinacja kodów kreskowych/reporterów PhenoCycler	Akoya Biosciences	5450004 (BX025/RX025)
		5450003 (BX022/RX022)
		5450023 (BX002/RX002)
		5250002 (BX020/RX020)
		2520003 (BX023/RX023)
		5250005 (BX029/RX029)
		5250007 (BX035/RX035)
		5250012 (BX052/RX052)
		5550012 (BX030/RX030)
		5550015 (BX042/RX042)
		5550014 (BX036/RX036)
QuPath	Open-Source	https://qupath.github.io/
SimplyBlue SafeStain	Thermo Fisher Scientific	LC6065
Staining Set	(Akoya Biosciences	7000008	zawiera bufor hydracyjny, bloker N, bloker J, bloker S, odczynnik utrwalający, bufor do przechowywania