Tutaj opisujemy metodę efektywnego manipulowania krytycznymi ścieżkami rozwojowymi w łożysku myszy in vivo. Odbywa się to poprzez wstrzyknięcie i elektroporację plazmidów CRISPR do łożysk ciężarnych matek w 12,5 dniu embrionalnym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysz In Vivo Ukierunkowana manipulacja CRISPR
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Łożysko jest niezbędnym organem, który reguluje i utrzymuje rozwój ssaków w macicy. Łożysko jest odpowiedzialne za przenoszenie składników odżywczych i odpadów między matką a płodem oraz za produkcję i dostarczanie czynników wzrostu i hormonów. Manipulacje genetyczne łożyska u myszy mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia specyficznej roli łożyska w rozwoju prenatalnym. Specyficzne dla łożyska myszy transgeniczne z ekspresją Cre mają różną skuteczność, a inne metody manipulacji genami łożyska mogą być użyteczną alternatywą. W artykule opisano technikę bezpośredniej zmiany ekspresji genów łożyska za pomocą manipulacji genami CRISPR, która może być wykorzystana do modyfikacji ekspresji docelowych genów. Stosując stosunkowo zaawansowane podejście chirurgiczne, ciężarne matki poddawane są laparotomii w 12,5 dobie embrionalnej (E12,5), a plazmid CRISPR jest dostarczany szklaną mikropipetą do poszczególnych łożysk. Plazmid jest natychmiast elektroporowany po każdym wstrzyknięciu. Po wyzdrowieniu matki łożyska i zarodki mogą kontynuować rozwój do czasu oceny w późniejszym czasie. Ocena łożyska i potomstwa po zastosowaniu tej techniki może określić rolę specyficznej w czasie funkcji łożyska w rozwoju. Ten rodzaj manipulacji pozwoli lepiej zrozumieć, w jaki sposób genetyka i funkcja łożyska wpływają na wzrost i rozwój płodu w wielu kontekstach chorobowych.
Wprowadzenie
Łożysko jest niezbędnym organem zaangażowanym w rozwój płodu. Główną rolą łożyska jest dostarczanie niezbędnych czynników i regulowanie transportu składników odżywczych i odpadów do i od płodu. Łożyska ssaków składają się zarówno z tkanki płodowej, jak i matczynej, które tworzą interfejs płód-matka, a zatem genetyka zarówno matki, jak i płodu wpływa na funkcję1. Anomalie genetyczne lub upośledzona funkcja łożyska mogą drastycznie zmienić rozwój płodu. Wcześniejsze prace wykazały, że genetyka i rozwój łożyska są związane ze zmienionym rozwojem określonych układów narządów u płodu. W szczególności nieprawidłowości w łożysku są związane ze zmianami w mózgu, sercu i układzie naczyniowym płodu2,3,4,5.
Transport hormonów, czynników wzrostu i innych cząsteczek z łożyska do płodu odgrywa główną rolę w rozwoju płodu6. Wykazano, że zmiana produkcji określonych cząsteczek w łożysku może zmienić rozwój neurologiczny. Stan zapalny matki może zwiększyć produkcję serotoniny poprzez zmianę ekspresji genu metabolicznego tryptofanu (TRP) w łożysku, co z kolei powoduje nagromadzenie serotoniny w mózgu płodu7. Inne badania wykazały nieprawidłowości łożyska wraz z wadami serca. Uważa się, że nieprawidłowości w łożysku przyczyniają się do wrodzonych wad serca, najczęstszych wad wrodzonych u ludzi8. Niedawne badanie zidentyfikowało kilka genów, które mają podobne szlaki komórkowe zarówno w łożysku, jak i sercu. Jeśli zostaną zakłócone, szlaki te mogą powodować defekty w obu narządach9. Ubytki łożyska mogą nasilać wrodzone wady serca. Rola genetyki i funkcji łożyska w rozwoju określonych układów narządów płodu jest nową dziedziną badań.
Myszy mają łożyska hemochorialne i inne cechy łożysk ludzkich, co czyni je bardzo użytecznymi modelami do badania chorób ludzkich1. Pomimo znaczenia łożyska, obecnie brakuje ukierunkowanych manipulacji genetycznych in vivo. Co więcej, obecnie dostępnych jest więcej opcji nokautów lub nokdaunów niż manipulacje nadekspresją lub wzmocnieniem funkcji w klasie placenta10. Istnieje kilka transgenicznych linii eksprymujących Cre do manipulacji specyficznych dla łożyska, każda w różnych liniach trofoblastów w różnych punktach czasowych. Należą do nich Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER i Gcm1-Cre11,12,13,14. Chociaż te transgeny Cre są wydajne, mogą nie być zdolne do manipulowania niektórymi genami w określonych punktach czasowych. Inną powszechnie stosowaną metodą nokautowania lub nadekspresji genów łożyskowych jest wprowadzenie wektorów lentiwirusowych do kultury blastocyst, co powoduje manipulację genetyczną specyficzną dla trofoblastów15,16. Technika ta pozwala na silną zmianę w ekspresji genów łożyska na wczesnym etapie rozwoju. Zastosowanie interferencji RNA in vivo było rzadko stosowane w łożysku. Insercja plazmidów shRNA może być przeprowadzona podobnie jak technika CRIPSR opisana w tym artykule. Zostało to zrobione w E13.5, aby skutecznie zmniejszyć ekspresję PlGF w łożysku, co ma wpływ na unaczynienie mózgu potomstwa17.
Oprócz technik, które są głównie używane do nokautowania lub nokautowania, często przeprowadza się nadekspresję za pomocą adenowirusów lub insercji białka egzogennego. Techniki stosowane do nadekspresji mają różne wskaźniki powodzenia i w większości są wykonywane w późniejszym okresie ciąży. Aby zbadać rolę insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1) w funkcji łożyska, przeprowadzono transfer genu łożyskowego za pośrednictwem adenowirusa w celu wywołania nadekspresji genu IGF-1 18,19. Przeprowadzono to pod koniec ciąży myszy na E18.5 poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie łożyska. Aby zapewnić dodatkowe opcje i uniknąć możliwych niepowodzeń ustalonych manipulacji genetycznych łożyska, takich jak niepowodzenia kombinacji Cre-Lox, możliwa toksyczność adenowirusów i niezamierzone działanie shRNA, można zastosować bezpośrednią manipulację CRISPR łożyska in vivo20,21,22. Ten model został opracowany w celu rozwiązania problemu braku modeli nadekspresji i stworzenia modelu z elastycznością.
Ta technika opiera się na pracy Lecuyer et al., w której plazmidy shRNA i CRISPR były celowane bezpośrednio in vivo w łożyska myszy w celu zmiany ekspresji PlGF17. Technika ta może być wykorzystana do bezpośredniej zmiany ekspresji genów łożyska za pomocą manipulacji CRISPR w wielu punktach czasowych; do tej pracy wybrano E12.5. W tym momencie łożysko dojrzało i jest wystarczająco duże, aby nim manipulować, co pozwala na wstawienie specyficznego plazmidu CRISPR na E12.5, który może mieć znaczący wpływ na rozwój płodu od połowy do późnej ciąży23,24. W przeciwieństwie do podejść transgenicznych, ale podobnych do indukcji wirusa lub interferencji RNA, technika ta pozwala na nadekspresję lub nokaut w określonych punktach czasowych przy użyciu stosunkowo zaawansowanego podejścia chirurgicznego, unikając w ten sposób możliwego upośledzenia łożyska lub śmiertelności zarodka z powodu wcześniejszych zmian. Ponieważ tylko kilka łożysk otrzymuje plazmid doświadczalny lub kontrolny w miocie, podejście to pozwala na dwa rodzaje kontroli wewnętrznych. Te kontrole to te, którym wstrzyknięto i elektroporowano odpowiedni plazmid kontrolny oraz te, które nie są poddawane bezpośredniej manipulacji. Technika ta została zoptymalizowana w celu wytworzenia nadekspresji genu IGF-1 w łożysku myszy za pomocą plazmidu CRISPR z synergicznym mediatorem aktywacji (SAM). Gen IGF-1 został wybrany, ponieważ IGF-1 jest niezbędnym hormonem wzrostu dostarczanym do płodu, który jest wytwarzany głównie w łożysku przed urodzeniem25,26. Ta nowa technika CRISPR ukierunkowana na łożysko pozwoli na bezpośrednią manipulację, która pomoże określić związek między funkcją łożyska a rozwojem płodu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami federalnymi oraz polityką Uniwersytetu Iowa i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Zwierzęta i hodowla
- Trzymaj zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światła dziennego z jedzeniem i wodą ad libitum.
- Użyj samic myszy CD-1 w wieku 8-15 tygodni. Użyj obecności korka kopulacyjnego, aby zidentyfikować E0,5.
- Na E0.5 pojedynczo mieszkają ciężarne matki.
2. Kalibracja mikropipety
UWAGA: Kalibracja mikropipety powinna być przeprowadzona przed operacją, jeśli to możliwe.
- Przed wykonaniem i kalibracją mikropipety należy rozcieńczyć wszystkie plazmidy do zalecanego stężenia (0,1 μg/μl) w wodzie wolnej od DNaz. Wymieszać plazmid z odpowiednio rozcieńczonym barwnikiem Fast Green (1 μg/μL w PBS) (końcowe stężenie plazmidu: 0,06 μg/μL).
- Wyciągać mikropipety za pomocą szklanych kapilar o średnicy 10 cm i średnicy zewnętrznej 0,86 mm za pomocą ściągacza do mikropipet.
- Ostrożnie odłamać końcówkę mikropipety (2-3 mm) sterylnymi kleszkami.
- Załaduj mikropipetę do końcówki mikrokapilarnej przymocowanej do mikroiniektora. Upewnij się, że mikrowstrzykiwacz jest podłączony do mikroiniektora i że poziom azotu jest wystarczający do kalibracji mikropipety.
- Po podłączeniu mikropipety do mikrowstrzykiwacza napełnij ją roztworem barwnika Fast Green, aby przeprowadzić kalibrację (1 μg/μL w PBS). Skalibruj mikropipetę, aby wstrzyknąć objętość około 3,5 μl. Opróżnij ("wyczyść") mikropipetę, przygotowując się do załadowania roztworów plazmidu, jak poniżej.
UWAGA: Każda mikropipeta będzie nieco inna. Aby uniknąć uszkodzenia łożyska podczas iniekcji, czas wstrzyknięcia powinien być ustawiony w zakresie 0,5-1,5 s. Ciśnienie powinno być ustawione w zakresie 1-8,5 psi. Skalibrować każdą mikropipetę oddzielnie; Jeśli mikropipeta nie może być skalibrowana w tych parametrach, nie należy jej używać.
3. Chirurgia (Rysunek 1A)
UWAGA: Aby się przygotować, oczyść powierzchnie zarówno obszaru przygotowawczego, jak i chirurgicznego 70% etanolem. Umieść chłonny podkład w obszarze przygotowania. W obszarze operacyjnym połóż poduszkę grzewczą, a następnie umieść na niej chłonny podkład. Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed zabiegiem. Czas znieczulenia zapory nie powinien przekraczać 1 godziny.
- Znieczulenie
- Ciężarnej matce należy podać 5 mg/kg NLPZ (meloksykamu) lub innego zatwierdzonego leku przeciwbólowego na 30 minut do 1 godziny przed zabiegiem.
- Umieść ciężarną komatkę w komorze indukcyjnej podłączonej do parownika izofluranowego.
- Ustaw waporyzator na 4% izofluranu i 3,5 l/min tlenu.
- Gdy znieczulenie zostanie potwierdzone brakiem reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i zmniejszoną częstością oddechów, należy usunąć koferdam z komory indukcyjnej do obszaru przygotowania.
- Przygotowanie do zabiegu
- W obszarze przygotowania należy umieścić koferkę na wznak ze stożkiem nosowym.
- Zmniejsz ilość izofluranu w parowniku do 2% i tlenu do 3,5 l/min, gdy zapora znajduje się w stożku nosowym.
- Dokładnie ogol brzuch koferdamu i usuń nadmiar sierści. Naprzemiennie pokrywaj ogolony brzuch roztworem powidonu i 70% etanolem trzy razy za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką. Nałożyć ostatnią warstwę roztworu powidonu. Aby zapobiec wysuszeniu rogówki, umieść sztuczny żel łzowy na obu oczach matki (Rysunek 2A, B).
- Po przygotowaniu należy przesunąć koferdam ze stożkiem nosowym do wyznaczonego obszaru operacyjnego.
- Laparotomia macicy
UWAGA: Przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego należy używać sterylnych rękawiczek. Zmień rękawice, jeśli dojdzie do kontaktu z jakąkolwiek niesterylną powierzchnią.- W obszarze operacyjnym umieść koferdam na wznak i zabezpiecz stożek nosowy taśmą. Ustaw poduszkę grzewczą pod wkładem chłonnym na 45 °C.
- Za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj około 2 cm nacięcie w linii środkowej skóry. Użyj kleszczy, aby namiotować skórę i wykonaj pionowe nacięcie w skórze. Następnie wykonaj kolejne nacięcie o podobnej wielkości przez otrzewną, aby odsłonić rogi macicy. Za pomocą kleszczy nałóż otrzewną, wykonując pionowe nacięcie (Rysunek 2C, D).
UWAGA: Niewłaściwe rozbicie namiotu podczas nacinania otrzewnej może prowadzić do śmiertelnego nacięcia jelit. - Delikatnie masuj rogi macicy przez nacięcie, naciskając boki brzucha. Zrób to, ostrożnie prowadząc macicę bez narzędzi, używając tylko palców, aby uniknąć przypadkowych obrażeń. Umieść odsłoniętą macicę na sterylnej serwety chirurgicznej pokrywającej brzuch matki i utrzymuj ją wilgotną przez cały zabieg za pomocą kropli sterylnego soli fizjologicznej, którą można podgrzać do 30 °C przed użyciem w razie potrzeby (Rysunek 2E, F).
UWAGA: Rogi macicy można zidentyfikować zgodnie z opisem w Wang et al.27. - Po odsłonięciu macicy wybierz trzy pary łożysk do manipulacji.
UWAGA: Łożyska można zidentyfikować zgodnie z opisem Elmore et al.24. Aby zmaksymalizować przeżywalność zarodków, nie należy leczyć więcej niż 6 łożysk. Jeśli obecnych jest mniej niż 12 zarodków, nie należy wstrzyknąć więcej niż 4 łożyska. Wybierz dwa sąsiadujące ze sobą łożyska, tak aby jedno otrzymało zastrzyk kontrolny, a drugie otrzymało eksperymentalny plazmid. Wykorzystanie dwóch sąsiadujących ze sobą łożysk pozwala na lepsze porównanie łożysk w podobnych miejscach macicy, a także umożliwia zwiększenie przeżywalności. Wybrane pary łożysk są wybierane losowo i rozmieszczone w obu rogach macicy (Ryc. 1B). - Należy zarejestrować miejsce manipulacji łożyskiem i organizację zarodków w rogach macicy, tak aby można było zidentyfikować zarodki i łożyska podczas pobierania, ponieważ jedna matka będzie nosicielką zarówno kontrolnych, jak i eksperymentalnie leczonych łożysk/zarodków.
- Iniekcja łożyskowa i elektroporacja plazmidu kontrolnego
UWAGA: Aby zachować technikę aseptyczną, przed użyciem wysterylizuj łopatki do elektroporacji i mikrowstrzykiwacz zimnym środkiem sterylizującym. Zmień rękawice, jeśli dojdzie do kontaktu z jakąkolwiek niesterylną powierzchnią.- Za pomocą skalibrowanej mikropipety załadować wystarczającą ilość odpowiedniego plazmidu kontrolnego na trzy wstrzyknięcia. Wykonaj wszystkie wstrzyknięcia na głębokości ~0,5 mm bocznie do łożyska między decidua (biały) a strefą połączeniową (ciemnoczerwony) (Rysunek 3A-F).
- Wykonać wstrzyknięcia w trzy łożyska kontrolne.
UWAGA: Wykonaj wszystkie kontrolne wstrzyknięcia plazmidu przed wstrzyknięciami eksperymentalnymi, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego plazmidów mikropipetą. Pozwoli to na użycie tej samej mikropipety, ponieważ wymiana mikropipet i czas kalibracji drastycznie wydłużają czas operacji i zmniejszają przeżywalność matki. - Wykonać elektroporację łożysk kontrolnych z wstrzyknięciem plazmidu w ciągu 2 minut od wstrzyknięcia.
- Do elektroporacji użyj pary wioseł o średnicy 3 mm przymocowanych do maszyny do elektroporacji. Aby zapewnić skuteczność inkorporacji CRISPR i żywotność zarodków, użyj następujących ustawień elektroporacji: 2 impulsy, 30 V, impuls 30 ms, impuls wyłączony 970 ms, jednobiegunowy.
- Po wstrzyknięciu, ale bezpośrednio przed elektroporacją, miejsca kontaktu należy pokryć sterylnym roztworem soli fizjologicznej, nakładając sól fizjologiczną precyzyjnie na trzy miejsca na ścianie macicy i łopatki za pomocą zakraplacza lub strzykawki.
- Delikatnie dociśnij łopatki do elektroporacji po bocznych stronach łożyska. Umieść łopatkę anody nad miejscem wstrzyknięcia, a katodę dokładnie naprzeciwko ( Rysunek 4A-C).
- Naciśnij impuls na maszynie do elektroporacji i poczekaj, aż dwa impulsy zakończą się przed wyjęciem łopatek do elektroporacji.
UWAGA: Podczas impulsów często widać niewielką ilość białej piany między łopatkami a łożyskiem. Jeśli tak się nie stanie, przed dalszym użyciem sprawdź napięcie z łopatek za pomocą woltomierza. Jeśli odczyt na woltomierzu nie zgadza się z ustawieniem napięcia elektroporacji, łopatki nie działają.
- Iniekcja łożyskowa i elektroporacja plazmidu doświadczalnego
- Postępuj zgodnie z tymi samymi instrukcjami od kroku 3.4.1. do kroku 3.4.2, używając plazmidu eksperymentalnego zamiast plazmidu kontrolnego.
- Wykonać elektroporację wszystkich trzech eksperymentalnie wstrzykniętych łożysk w ciągu 2 minut od wstrzyknięcia. Należy to zrobić w taki sam sposób, jak w przypadku osób, którym wstrzyknięto plazmidy kontrolne. Wykonaj kroki 3.4.4. , aby wykonać krok 3.4.7.
- Zakończenie zabiegu
- Po zakończeniu manipulacji łożyskiem delikatnie masuj rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej, używając tylko palców (Ryc. 5A).
- Najpierw wykonaj podwójnie zawiązane szwy pojedyncze na warstwie otrzewnej za pomocą powlekanych i plecionych szwów rozpuszczalnych o długości 45 cm ze stopu igieł 3/8c o średnicy 13 mm. Odstępy między szwami 2-3 mm od siebie (Rysunek 5B).
- Po zszyciu warstwy otrzewnej należy zszyć skórę szwami rozpuszczalnymi. Potrójnie zawiąż pojedyncze szwy w odległości 2-3 mm od siebie, aby upewnić się, że zapora nie może odpiąć szwu (Rysunek 5C).
- Po zakończeniu szycia ustaw izofluran na 1%, a tlen na 3,5 l/min i nałóż klej tkankowy na szwy na skórze (Rysunek 5D).
UWAGA: Klej tkankowy jest opcjonalny, ale zalecany, aby zapobiec ponownemu otwarciu nacięcia z powodu żucia zapory. - Gdy klej tkankowy wyschnie, wyłącz waporyzator i usuń koferdam z obszaru operacyjnego. Umieść koferdam w klatce podtrzymującej na plecach.
4. Opieka pooperacyjna i monitorowanie
- Pozwól ciężarnej matce dojść do siebie w czystej klatce pod nadzorem przez co najmniej 30 minut, aby upewnić się, że nie dojdzie do natychmiastowych komplikacji po operacji. Obserwuj, aż będzie w pełni zdolny do poruszania się i będzie mógł stanąć na nogi bez pomocy. Pojedynczo dom zapory po operacji.
- Postępuj zgodnie z instytucjonalną opieką pooperacyjną i monitorowaniem aż do pobrania zarodków. Rejestruj wagę koferdamu i codziennie monitoruj szwy i miejsce nacięcia.
5. Pobranie łożyska E14.5
- Na E14.5 należy głęboko znieczulić matkę koktajlem ketamina/ksylazyna (1 mg/ml ketaminy i 0,1 mg/ml ksylazyny), a następnie przemieścić matkę szyjną .
- Wykonaj nacięcie w kształcie litery V w brzuchu matki za pomocą nożyczek i usuń macicę. Natychmiast umieścić na 5 cm szalce Petriego na lodzie. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń zarodek i odpowiadające mu łożysko z macicy.
UWAGA: Zachowaj zapis lokalizacji zarodka i odpowiadającego mu łożyska w rogach macicy, aby określić, które z nich otrzymało bezpośrednią manipulację podczas operacji. - Zapisz ciężar łożyska. Używając kleszczyków i maszynek do golenia bez RNAse, przetnij łożysko na pół wzdłuż linii środkowej. Umieść jedną połowę w 4% PFA w temperaturze 4 °C. Pozostałą połowę ponownie przeciąć na pół i przechowuj pozostałe dwie ćwiartki w temperaturze -80 °C w dwóch probówkach, z których jedna zawiera odczynnik do przechowywania RNA.
UWAGA: Zarodki i inne tkanki matczyne mogą być przechowywane z kolekcji w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
6. Analiza ekspresji genów łożyskowych
- Ćwiartkę łożyska należy przechowywać w temperaturze -80 °C w odczynniku do przechowywania RNA.
- Przetwarzaj łożyska pod kątem qPCR zgodnie z opisem w Elser et al. przy użyciu metody Trizol do izolacji RNA, spektrofotometru do stężenia RNA, zestawu do syntezy cDNA i qPCR za pomocą SYBR Green Master Mix28. Zamiast zestawu Turbo DNAfree DNAse, o którym mowa w Elser et al., użyj zestawu do oczyszczania RNAclean po izolacji RNA Trizol, aby upewnić się, że próbki nie zawierają zanieczyszczeń28.
UWAGA: Przeczytaj kartę charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) dla Trizolu i użyj go w dygestoriach chemicznych. - Ocenić insercję plazmidu kontrolnego ze starterami GFP i plazmidu eksperymentalnego ze starterami BLAST (startery wymienione w tabeli uzupełniającej 1). Użyj wartości CT, aby określić obecność plazmidu.
UWAGA: Wartości CT powyżej 35 są fałszywie dodatnie i tylko te poniżej 35 powinny być uważane za pozytywny wskaźnik, że plazmid został pomyślnie wstawiony. - Oceń ekspresję łożyska IGF-1 znormalizowaną do genu porządkowego 18s (startery wymienione w tabeli uzupełniającej 1). Użyj metody ddCT, aby obliczyć zmianę krotności, a następnie oblicz znormalizowaną zmianę krotności próbek eksperymentalnych na średnią zmianę krotności próbek kontrolnych.
7. Analiza poziomu białka łożyskowego
- Użyć ćwiartki łożyska, która była przechowywana w temperaturze -80 °C. Homogenizować tkankę w roztworze buforowym złożonym z 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl2 i 10 mM inhibitora proteazy w diH2O o końcowym pH 7,4. Użyj ręcznego homogenizatora i tłuczka, aby rozdrobnić tkankę.
UWAGA: Próbka nie powinna przekraczać 10% objętości bufora. - Rozcieńczyć homogenizowane próbki w buforze w stosunku 1:12, tak aby mieściły się w wykrywalnym zakresie zestawu do oznaczania kwasu bicynowego (BCA). Wykonaj test BCA zgodnie z instrukcjami producenta i określ ilościowo całkowite białko za pomocą czytnika płytkowego.
- Po wykonaniu testu BCA znormalizować wszystkie próbki do tego samego całkowitego stężenia białka wynoszącego 2 mg/ml dla testu ELISA IGF-1, tak jak to zrobiono w Gumusoglu i wsp.29.
- Wykonaj test ELISA IGF-1 zgodnie z instrukcjami producenta i określ ilościowo poziomy białka IGF-1 za pomocą czytnika płytek przy użyciu standardowej krzywej stężenia.
8. Przestrzenna weryfikacja CRIPSR za pomocą fluorescencyjnego etykietowania hybrydyzacji in situ
- Po odpowiednim utrwaleniu połówek łożyska w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 1-3 dni, przenieś je do 20% sacharozy w temperaturze 4 °C przed zamrożeniem w optymalnej temperaturze cięcia (OCT).
- Szeregowo pokrój połówki łożyska osadzone w KIOSTAT w temperaturze -20 °C na sekcje 10 μm i umieść je na szkiełkach, które mają być oznaczone. Przekrój łożysko tak, aby widoczne były wszystkie trzy podregiony. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C do momentu użycia do hybrydyzacji in situ.
- Wykonaj fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) zgodnie z protokołami producenta. Hybrydyzować jedno szkiełko z sondą dCas9-3xNLS-VP64 i drugi "siostrzany" szkiełko tego samego łożyska za pomocą sondy Prl8a8.
UWAGA: Sonda dCas9-3xNLS-VP64 wykrywa obecność plazmidu z nadekspresją. Sonda Prl8a8 uwypukla gąbczaste trotrofoblasty w strefie połączeniowej, co pozwala na identyfikację podregionów łożyska. Te dwie sondy są oznaczone na oddzielnych "siostrzanych" szkiełkach, aby uniknąć interferencji fluorescencji wielokanałowej z zieloną autofluorescencją w łożyskach. - Oznacz obie sondy barwnikiem detekcyjnym (Opal 620). Po wypełnieniu protokołu producenta dla FISH, należy nałożyć podłoże montażowe DAPI i umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci.
- Zobrazuj szkiełka na pionowym złożonym mikroskopie fluorescencyjnym i przetwórz je za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu. W tym przypadku wykorzystano oprogramowanie CellSens.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ogólne wyniki procedury (Rysunek 6)
W badaniu zastosowano trzy grupy manipulacyjne. Obejmowały one łożyska wstrzyknięte ogólnym plazmidem kontrolnym CRISPR Cas9 (Cas9 Control), kontrolnym plazmidem CRISPR do aktywacji (Act Control) lub plazmidem aktywacyjnym SAM IGF-1 (Igf1-OE). Grupa Cas9 Control jest bardziej odpowiednia dla plazmidów do nokautu, a kontrola aktywacji dla plazmidów do nadekspresji/aktywacji. Aby ocenić zmiany żywotności spowodo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Łożysko jest głównym regulatorem wzrostu płodu i, jak wspomniano wcześniej, zmiany w ekspresji lub funkcji genów łożyska mogą znacząco wpływać na rozwój płodu6. Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do przeprowadzenia ukierunkowanej manipulacji CRISPR in vivo łożyska myszy przy użyciu stosunkowo zaawansowanego podejścia chirurgicznego. Technika ta pozwala na uzyskanie znacznego plonu zdolnych do życia zarodków i odpowiadających im łożysk, które można wykorzystać do dalszych b...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy podają następujące źródła finansowania: R01 MH122435, NIH T32GM008629 i NIH T32GM145441. Autorzy dziękują laboratoriom dr Val Sheffield i dr Calvina Cartera na Uniwersytecie Iowa za korzystanie z sali operacyjnej i sprzętu, a także dr Ericowi Van Otterloo, dr Nandakumarowi Narayananowi i dr Matthew Weberowi za pomoc w mikroskopii. Autorzy dziękują również dr Sarze Maurer, Mayi Evans i Sreelekha Kundu za ich pomoc w pilotażowych operacjach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki 1,5 ml USA | Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) w PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899. | |
| 96 Płytka studzienkowa | Cornings | 3598 | Do zestawu BCA |
| Podkłady chłonne | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Kontrola aktywacji Plazmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Woda wolna od dnazy przewidziana do rozcieńczania |
| Odwrotna transkryptaza AMV | New England Biolabs | M0277L | Służy do syntezy cDNA |
| Znieczulenie Parownik gazowy | Vetamac | VAD-601TT | VAD-kompaktowy waporyzator |
| Sztuczny żel łzowy | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Zestaw do oznaczania białek BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Kwantyfikacja białek |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Ręczny homogenizator tkanek |
| Oprogramowanie CellSens | Olympus | V4.1.1 | Przetwarzanie obrazu do obrazów FISH. |
| Wirówka 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Wirówka płytkowa |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | Izolacja RNA |
| Aplikatory z bawełnianą końcówką | ProAdvantage | 77100 | Sterylizuj przed użyciem |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Woda bez dnazy przewidziana do rozcieńczania |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Mikroskop preparacyjny | Leica | M125 C | Używany do obrazowania po nekroskopii |
| Szwy rozpuszczalne | Med Vet International | J385H | |
| Woda destylowana | Gibco | 15230162 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Wapń; (-) Magnezowy |
| elektroelektroelektroporator ECM 830 (maszyna do elektroporacji) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Tylko generator |
| Elektryczna maszynka do golenia | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Łopatki do elektroporacji/Pęsety | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | Łopatki o średnicy 3 mm; przewody w zestawie |
| Kaseta do zatapiania: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Kasety do osadzania łożyska |
| Etanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| Kanistry F-Air | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Filtr nadmiaru izofluranu |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Rozpuścić do 1 μ g/ml i filtr; chronić przed światłem |
| Fotometr mikropłytkowy na bazie filtra (czytnik płytek) | Fisher Scientific | 14377576 | Może być stosowany do kleszczyków BCA i ELISA |
| VWR | 82027-386 | Cienkie końcówki, proste, ząbkowane | |
| Roztwór formaliny, buforowany obojętnie, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Szklane kapilary - szkło borokrzemianowe (mikropipeta) | Instrument | SutterB150-86-10 | O.D.: 1,5 mm, ID w: 0,86 mm, długość 10 cm |
| Koktajl inhibitorów proteazy i fosfotazy Halt (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Bufor do homogenizacji białek |
| Poduszka grzewcza | Thermotech | S766D | Cyfrowa wilgotna poduszka grzewcza |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | W pełni surowa szczęka; zakrzywiona |
| Kąpiel w gorącej wodzie | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plazmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Woda wolna od dnaz przewidziana do rozcieńczania |
| Komora indukcyjna | Vetamac | 941443 | Nie jest wymagany określony rozmiar litra |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Izoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | Izolacja RNA |
| Ketamina HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Bufor do homogenizacji białek |
| MicroAmp™ Optyczna 384-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym | Fisher Scientific | 4309849 | Płytki z kodami kreskowymi nie są wymagane |
| Końcówka mikrokapilarna | Eppendorf | 5196082001 | Dołączona do mikrowtryskiwacza BTX |
| Mikroiniektor | Aparat BTX Harvard | 45-0766 | Uchwyt na pipety ze stali nierdzewnej, długość 130 mm, do pipet od 1 do 1,5 mm |
| Microject 1000A (wtryskarka) | Aparat BTX Harvard | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus |
| System Model P-97 | Instrument Sutter | P-97 | Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowego |
| Mieszalnik do mikropłytek (wytrząsarka do płytek) | scilogex 822000049999 | ||
| Mysz/Szczur IGF-I/IGF-1 Zestaw Quantikine ELISA | R & D Systems | MG100 | |
| Igły | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0,3 mm x 13 mm) |
| Zbiornik azotu | Linde | 7727-37-9 | Dowolny gaz wewnętrzny |
| Niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analityczne, takie jak stożek nosowy Meloxicam |
| Vetamac | 921609 | 9-14 mm | |
| Barwnik detekcyjny Opal 620 | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Stosowany do RYB |
| Mieszanka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Zbiornik tlenu | Linde | 7782 - 44 - 7 | tlenowe klasy medycznej |
| USA Scientific Inc | 14155390 | ||
| Roztwór jodu powidonu, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Energetyka SYBR&handel; Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific 4367659 | ||
| losowych heksamerów qPCR (losowe startery) | New England Biolabs | S1330S | Służy do syntezy cDNA |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| Zestaw do czyszczenia RNA i Koncentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Zawiera wszystkie odczynniki wymagane do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Sondy sprzedawane oddzielnie. |
| RNAscope i handel; Sonda- MM-PRL8A8-C2 | Zaawansowana diagnostyka komórek | 528641-C2 | |
| RNAzakres i handel; Sonda- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Zaawansowana diagnostyka komórek | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Suchy piec do hybrydyzacji in situ |
| Nożyczki | VWR | 82027-578 | Nożyczki preparacyjne, ostra końcówka, 4¹/? |
| Chlorek sodu (sól) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterylny, 0,9% |
| cytrynian sodu, sól trisodowa, dihydrat, [kwas cytrynowy, dihydrat trisodowy] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Koncentrat wodorotlenku sodu 1N, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Bufor do homogenizacji białek |
| Parowiec | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterylna serweta chirurgiczna | Busse | 696 | Sterylizuj przed użyciem |
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Szkło osłonowe Surgipath 24x60 | Leica | ||
| BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | Strzykawka Luer Slip Tip sterylna, jednorazowego użytku, 1 ml | |
| Thermo Naukowo-Handlowa; Invitrogen&handel; Nanodrop &handel; Jeden spektrofotometr z WiFi i Qubit™ 4 Fluorometr | Fisher Scientific | 13-400-525 | Ta konfiguracja jest dostarczana z fluorometrem Qubit 4. Kwantyfikacja kubitów nie jest wymagana. |
| Klej tkankowy | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Bufor do homogenizacji białek |
| TRIzol™ Odczynnik | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Izolacja RNA |
| Pakiet buforowy TSA Zaawansowana diagnostyka | komórek | 322810 | Służy do rozcieńczania barwnika detekcji Opal 620 |
| Uniwersalny obwód | F Vetamac | 40200 | Dołączany do waporyzatora i akcesoriów do waporyzatora |
| Pionowy złożony mikroskop fluorescencyjny | Olympus | BX61VS | Używany do obrazowania RYB |
| Vectorshield z DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Nośniki montażowe do szkiełek nakrywkowych |
| ViiA™ 7 System PCR w czasie rzeczywistym z 384-dołkowym blokiem | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | Służy do wykrywania bloków SYBR 384-dołkowych. Dostępne TaqMan i/lub mniejsze bloki |
| Lakier do paznokci Wet n Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Ksylazyna 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
Bibliografia
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
- Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735(2018).
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230(2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570(2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756(2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236(2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652(2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44(2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632(2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653(2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909(2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202(2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118(2021).
- Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
