Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Summary

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Abstract

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) i siatkówka są funkcjonalnie i strukturalnie połączonymi tkankami, które współpracują ze sobą, aby regulować percepcję światła i widzenie. Białka na powierzchni wierzchołkowej RPE są ściśle związane z białkami na zewnętrznej powierzchni segmentu fotoreceptora, co utrudnia konsekwentne oddzielanie RPE od fotoreceptorów/siatkówki. Opracowaliśmy metodę skutecznego oddzielania siatkówki od RPE ludzkich oczu w celu wygenerowania kompletnych płaskich mocowań RPE/naczyniówki i siatkówki do oddzielnej analizy komórkowej fotoreceptorów i komórek RPE. Wstrzyknięcie doszklistkowe roztworu D-mannitolu o wysokiej osmolarności, cukru nietransportowanego przez RPE, wywołało oddzielenie RPE i siatkówki w całej komorze tylnej, nie powodując uszkodzenia połączeń komórkowych RPE. Nie zaobserwowano żadnych plastrów RPE przyczepionych do siatkówki. Znakowanie aktyny falloidyną wykazało zachowanie kształtu RPE i umożliwiło analizę morfometryczną całego nabłonka. Opracowano oprogramowanie oparte na sztucznej inteligencji (AI) w celu dokładnego rozpoznawania i segmentacji granic komórek RPE oraz ilościowego określania 30 różnych wskaźników kształtu. Ta metoda preparacji jest wysoce powtarzalna i może być łatwo rozszerzona na inne modele zwierzęce.

Introduction

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) i siatkówka nerwowa są ze sobą silnie połączone ze względu na silną fizjologiczną zależność fotoreceptorów od RPE. Podczas rozwarstwiania mechaniczne oddzielenie siatkówki nerwowej od RPE powoduje rozerwanie komórek RPE, przy czym wierzchołkowe części RPE pozostają przyczepione do zewnętrznych segmentów fotoreceptorów siatkówki. Zakres zrostu RPE do siatkówki jest tak duży, że ilość pigmentu pozostałego na siatkówce po oddzieleniu jest wykorzystywana do ilościowego określenia siły zrostu siatkówki¹. W szczególności ścisłe połączenia RPE i łącząca je struktura aktynowa, które znajdują się po stronie wierzchołkowej, zrywają się podczas separacji mechanicznej. W związku z tym barwienie płaskich mocowań RPE dla granic komórek powoduje powstanie niejednolitej monowarstwy, w której wiele komórek ma brakujące granice. Efekt ten nasila się, gdy tkanka jest utrwalana paraformaldehydem (PFA) przed rozbiorem, ponieważ białka stają się usieciowane.

Badania nad dostarczaniem leków do ciała szklistego wykazały, że wstrzyknięcia roztworów hiperosmotycznych w tylnej komorze wywołują odwarstwienie siatkówki^2,3. W tych eksperymentach 50 μl różnych roztworów, w zakresie od 1000 mOsm do 2400 mOsm, wstrzykniętych do środkowego ciała szklistego, spowodowało odwarstwienie siatkówki w ciągu kilku minut. Warto zauważyć, że nawet po długich ekspozycjach na roztwory o wysokiej osmolarności, ścisłe połączenia RPE wydawały się nienaruszone na transmisyjnych obrazach mikroskopowych elektronów zarówno oczu królika, jak i małpy³. Postępując zgodnie z podobną strategią, wstrzyknęliśmy do środkowego ciała szklistego hiperosmotyczny roztwór D-mannitolu, aby wywołać skuteczne odwarstwienie siatkówki przed wykonaniem sekcji RPE. Ponieważ D-mannitol nie jest transportowany przez klasę RPE4, utrzymuje się wysokie stężenie w ciele szklistym, generując gradient osmotyczny. Skuteczne oddzielenie RPE od siatkówki w całej komorze tylnej gwarantuje zachowanie połączeń komórkowych RPE i pozwala na badanie morfometrii RPE na całym flatmountie. Ponadto opracowaliśmy oprogramowanie oparte na sztucznej inteligencji (AI), które rozpoznaje i segmentuje fluorescencyjnie oznaczone granice komórek RPE, określa ilościowo 30 różnych wskaźników kształtu i tworzy mapy cieplne każdej metryki do wizualizacji^5,6.

Protocol

Ludzkie globy zwłok zostały uzyskane z Advanced Sight Network (Birmingham, AL). Prace wykonywane na tkankach zwłok są zwolnione przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną NIH z komisji etycznej ds. badań.

1. Wysyłka kuli do oczu

1. Po enukleacji wyślij świeże gałki oczne w pojemniku wypełnionym lodowatym DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺,
   UWAGA: Lepiej jest wypreparować oko w ciągu 24 godzin po enukleacji. Morfologia RPE nie ulega zmianie w tym oknie czasowym.

2. Przygotowanie formy silikonowej

1. Wytnij dolne 20 mm rury z okrągłym dnem o średnicy 25 mm. Umieść go u podstawy kwadratowej łodzi wagowej (81 mm x 81 mm x 25 mm).
2. Wymieszaj dwa składniki zestawu elastomerów silikonowych w proporcji 10:1, uważając, aby nie uwięzić powietrza. Wlać mieszaninę do łodzi wagowej zawierającej kulistą część rurki okrągłodennej.
3. Utwardź silikon w temperaturze pokojowej przez noc. Wyjmij łódkę ważącą i rurkę z okrągłym dnem z utwardzonej formy silikonowej.

3. Sekcja RPE

1. Oczyść twardówkę świeżego oka z mięśni i tkanki łącznej. Przymocuj oko do silikonowej formy za pomocą igieł 27 G przewleczonych przez twardówkę. Wypełnij wnękę formy DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺,
   UWAGA: Uważaj, aby nie naruszyć komory oka. Igły powinny przechodzić tylko przez twardówkę.
2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 21 G wstrzyknąć ~ 400 μl roztworu D-mannitolu o stężeniu 1 700 mOsm do ciała szklistego. Wbić igłę przez pars plana, aby uniknąć przebicia przedniej komory oka. Pozostaw oko w temperaturze pokojowej na ~45 min.
3. Rozetnij przednią komorę na poziomie pars plana za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy. Tylną komorę oka wypełnić DPBS 1x Ca²⁺ i Mg²⁺. Pod mikroskopem stereoskopowym zlokalizuj plamkę żółtą (żółtą plamkę na siatkówce).
4. Jeśli dostępny jest chirurgiczny obcinacz do ciała szklistego, usuń ciało szkliste i zastąp go DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Alternatywnie spróbuj podnieść ciało szkliste za pomocą kleszczy i przeciąć je drobnymi nożyczkami.
5. Zwracając uwagę na zachowanie okolicy plamki żółtej, pokrój oko na ćwiartki: nosowe, skroniowe, górne i dolne. Usuń igły, jeśli przeszkadzają.
6. Przenieść tylną komorę oka z motylem na 100 mm szalkę Petriego zawierającą DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Przed usunięciem siatkówki zaznacz płatek zawierający plamkę żółtą, wykonując niewielkie nacięcie (w kształcie litery V) na brzegu rzęskowym. Podnieś i odetnij całe ciało szkliste, które leży na siatkówce.
7. Delikatnie unieś siatkówkę z wielu stron za pomocą zakrzywionej szpatułki lub kleszczy, aby sprawdzić, czy siatkówka odłączyła się od RPE i aby umożliwić krążenie płynu między dwiema warstwami.
   UWAGA: Siatkówka będzie nadal przyczepiona na samym obrzeżu (brzegi rzęskowe) i na nerwie wzrokowym.
8. Wytnij siatkówkę z brzegów rzęsek we wszystkich płatkach, uważając, aby nie zarysować RPE. Umieść tkankę w 4% PFA i inkubuj przez ~1 godzinę. Umyć 3x DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Przenieść tkankę do pojemnika wypełnionego DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: W tym momencie siatkówka jest przyczepiona tylko do nerwu wzrokowego. To jest punkt przerwy w tym eksperymencie.
9. Przenieść próbkę na płytkę Petriego o średnicy 100 mm zawierającą DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Wybij głowę nerwu wzrokowego za pomocą stempla biopsyjnego 1,5 mm i zbierz siatkówkę. Przechowywać siatkówkę nerwową w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Przed wybiciem głowy nerwu wzrokowego należy maksymalnie przeciąć nerw wzrokowy po stronie twardówki. Zwiększy to precyzję stempla. Wybicie nerwu wzrokowego po zamocowaniu flatmounta w 4% PFA zmniejsza uszkodzenie komórek RPE znajdujących się wokół nerwu wzrokowego.
10. Usuń twardówkę z RPE/naczyniówki, delikatnie podnosząc warstwę RPE/naczyniówki z obwodu i przecinając naczynia naczyniówkowe i tkankę łączną, które znajdują się między twardówką a RPE, za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas. Gdy RPE/naczyniówka zostanie całkowicie oddzielony od twardówki, zbierz warstwę RPE/naczyniówki. Przenieść tkankę do pojemnika wypełnionego DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ i przechowywać w temperaturze 4°C.
    UWAGA: W tym momencie eksperyment można wstrzymać.

4. Barwienie

1. Przenieś RPE/naczyniówkę do jednego dołka na płytce 6-dołkowej. Zablokować i przepuścić próbkę w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), 0,5% Tween 20 i 0,5% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Inkubować próbkę z falloidyną sprzężoną z fluoroforem 647 w rozcieńczeniu 1:250 w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ z 1% BSA, 0,5% Tween 20 i 0,5% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć 3x w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺.
3. Przenieść próbkę RPE/naczyniówki na szkiełko podstawowe o wymiarach 50 mm x 75 mm i spłaszczyć je. Pokrój każdy "płatek" na dwie części, aby próbka była bardziej płaska. Zwróć uwagę na plamkę żółtą. Narysuj kontur płaskiego uchwytu za pomocą hydrofobowego pisaka.
4. Aby ugasić autofluorescencję lipofuscyny, dodać 500 μl roztworu wygaszacza autofluorescencji rozcieńczonego w stosunku 1:20 w 70% etanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
5. Umyć dokładnie (co najmniej 3x) w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Wyjmij DPBS i dodaj nośnik montażowy. Umieść szkło nakrywkowe na płaskim uchwycie i uszczelnij lakierem do paznokci.
6. Zobrazuj płaską mocowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (najlepiej przy użyciu obiektywu 10x lub 20x).

5. Analiza REShAPE

UWAGA: Ponieważ algorytm oparty na sztucznej inteligencji REShAPE został przeszkolony na obrazach 10x i 20x, zaleca się używanie obiektywu 10x lub 20x podczas obrazowania. Jeśli nie, obrazy będą musiały zostać odpowiednio przeskalowane.

1. Jeśli obrazy są uzyskiwane za pomocą więcej niż jednego kanału fluorescencyjnego, należy wyizolować kanał używany do pozyskiwania granic komórek. Eksportuj obrazy jako 16-bitowe pliki TIF w skali szarości.
   UWAGA: Obrazy uzyskane z rozszerzeniem .czi nie muszą być eksportowane jako pliki TIF, ale kanał zawierający obramowania komórek nadal musi być izolowany.
2. Zainstaluj oprogramowanie na platformach Windows x64 lub Linux (Centos 7).
   UWAGA: Oprogramowanie i instrukcję instalacji można znaleźć pod adresem https://github.com/nih-nei/REShAPE.
3. Otwórz oprogramowanie (Rysunek 1).
4. Na karcie Katalogi wybierz foldery wejściowe i wyjściowe. W katalogu wejściowym wybierz folder zawierający obrazy. W katalogu wyjściowym pozwól oprogramowaniu automatycznie zmienić ścieżkę na "katalog wejściowy/Przetworzone". Alternatywnie zmień katalog wyjściowy ręcznie.
   UWAGA: Oprogramowanie będzie iterować po wszystkich obrazach zawartych w folderze wejściowym.
5. Na karcie NN Segmentation Options (Opcje segmentacji NN) wybierz następujące ustawienia segmentacji obrazu:
   1. Rozmiar partii: Wpisz wartość 20 w polu tekstowym jako dobry punkt początkowy, ale zmniejsz ją, jeśli w systemie zabraknie procesorów graficznych (GPU).
      UWAGA: Oryginalny obraz jest dzielony na mniejsze kafelki w celu przetworzenia. Rozmiar partii określa, ile płytek może być przetwarzanych jednocześnie.
   2. Używać GPU?: Jeśli system nie ma wystarczającej ilości zasobów GPU, zaznacz pole Nie.
   3. Skala wewnętrzna: Korzystając z menu rozwijanego, zmień skalowanie wewnętrzne na Brak w przypadkach, gdy obrazy nie zostały uzyskane obiektywem 10x lub 20x. Na przykład zmniejsz 40-krotne obrazy do połowy za pomocą przycisku 1/2. Opcje skalowania dostępne w menu rozwijanym są następujące: 5x, 2x, Brak, 1/2, 1/5.
      UWAGA: Uczenie maszynowe zostało przeszkolone na obrazach 10x i 20x. Może nie rozpoznawać granic komórek na zdjęciach wykonanych w innych powiększeniach. W takim przypadku obrazy binarne będą wyświetlane jako całkowicie czarne.
   4. Arti Filter: Użyj zakładki filtra artefaktów, aby usunąć bardzo jasne cząstki (zanieczyszczenia lub małe części siatkówki lub tkanki łącznej wokół nerwu wzrokowego), które mogą być obecne na obrazie i mogą zakłócać segmentację granic komórek. Domyślnie nie jest używany żaden filtr. Opcje sztucznych filtrów w menu rozwijanym są następujące: Zwykły, Silny i Słaby.
6. Na karcie Opcja obrazu kafelkowego wstaw wartość w polu tekstowym, aby określić stopień nakładania się kafelków obrazu, dostosowując parametr Sąsiadujące kafelki obrazu. Nakładanie się 100 pikseli zwykle działa dobrze.
7. Na karcie Output Graphic Options (Opcje grafiki wyjściowej) dostosuj ustawienia generowania mapy cieplnej:
   1. Rekonstruować obrazy kafelkowe?: jeśli system nie ma wystarczających zasobów do analizy dużych obrazów, zaznacz pole Nie, aby umożliwić oprogramowaniu zakończenie analizy poprzez zapisanie pojedynczych kafelków bez rekonstrukcji całego obrazu.
   2. Utwórz kolorowe obrazy: Aby wygenerować mapy cieplne, wybierz opcję Wszystko z menu rozwijanego.
   3. W obszarze Kolorowanie wybierz dowolną z różnych palet kolorów dostępnych w menu rozwijanym: Termiczny, Zielony, Mpl-magma, Faza, Ogień, Jet, Cyan Hot.
   4. W polu Format obrazu zapisz obrazy jako TIF lub PNG, wybierając jedną z opcji na karcie.
   5. W odniesieniu do funkcji Use Manual Limits? zaznacz pole Nie, aby zezwolić oprogramowaniu na użycie minimalnych i maksymalnych wartości wykrytych na każdym obrazie. Zaznacz pole Tak, aby ręcznie dostosować zakres wartości dla każdej mapy cieplnej metryki kształtu, a następnie kliknij przycisk Ustaw limity, aby wybrać zakresy dla poszczególnych parametrów, wstawiając wartości w polach tekstowych. Po zmianie interesujących nas wartości kliknij Zapisz. Kliknij Załaduj domyślne, aby zresetować wszystkie limity.
      UWAGA: Użyj ręcznych limitów, jeśli konieczne jest porównanie map cieplnych z wielu obrazów, na przykład podczas porównywania wpływu różnych związków na kształt komórki. W ten sposób używany jest ten sam zakres wartości. Zestaw wartości, które należy wprowadzić ręcznie, różni się w zależności od rodzaju próbki. Zaleca się wykonanie kilku iteracji, aby wybrać optymalny zakres.
8. Na karcie Ograniczenia rozmiaru komórki dla analizy wybierz próg rozmiaru komórki do analizy:
   1. W polu Mniejszy rozmiar komórki wstaw w polu tekstowym rozmiar najmniejszej komórki, która ma zostać uwzględniona w analizie.
   2. W polu Górny rozmiar komórki wstaw w polu tekstowym rozmiar największej komórki, która ma zostać uwzględniona w analizie.
      UWAGA: Jednostka rozmiaru komórki zmienia się z pikseli na mikrometry do kwadratu w zależności od opcji wybranej na karcie Automatyczna konwersja jednostek.
9. Na karcie Automatyczna konwersja jednostek wybierz preferowaną jednostkę do analizy:
   1. W polu Konwertować piksele na jednostki rzeczywiste? zaznacz pole Nie, aby uruchomić analizę w jednostkach pikseli. Zaznacz pole Tak, aby uruchomić analizę w mikrometrach.
   2. W polu Długość paska skali (piksele) wprowadź wartość piksela w polu tekstowym.
   3. W polu Długość podziałki liniowej (mikrony) wprowadź w polu tekstowym odpowiednią odległość w mikrometrach.
10. Aby rozpocząć analizę, naciśnij przycisk Go For It.
    UWAGA: Oprogramowanie może również mierzyć żywotność komórek, gdy komórki są barwione 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) i jodkiem propidyny (zakładka opcji CZI), ale nie dotyczy to płaskich mocowań RPE.

Rysunek 1: Graficzny interfejs użytkownika REShAPE. Graficzny interfejs użytkownika ma różne zakładki do wybierania katalogów roboczych (karta Katalogi), modyfikowania opcji segmentacji (karty Opcje segmentacji NN i Opcje obrazu kafelkowego), określania parametrów analizy (karty Ograniczenia rozmiaru komórki dla analizy i automatycznej konwersji jednostek) oraz do generowania mapy cieplnej (karta Opcje grafiki wyjściowej). Skrót: GUI = graficzny interfejs użytkownika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Ten protokół daje jednopłaszczyznowy obraz płaskiego montażu, gdzie lokalizacja komórki i 30 metryk kształtu są mierzone dla każdej poprawnie zidentyfikowanej komórki RPE (Rysunek 2). Folder o nazwie "Przetworzone" jest generowany automatycznie w katalogu wejściowym. Ten folder zawiera cztery podkatalogi o nazwach "Analiza", "Oznaczone kolorami", "Połączone pliki" i "Obrazy podzielone na segmenty" oraz niektóre pliki tymczasowe wygenerowane podczas analizy. Folder "Połączone pliki" zawiera arkusz kalkulacyjny ze wszystkimi pomiarami kształtów oraz arkusz kalkulacyjny z częstotliwościami liczby sąsiadujących komórek wszystkich połączonych plików. Folder "Analiza" zawiera arkusz kalkulacyjny ze wszystkimi pomiarami kształtu oraz arkusz kalkulacyjny z częstotliwościami zliczania sąsiednich komórek dla każdego obrazu osobno. Katalog "Segmented Images" zawiera końcowe maski binarne obramowań komórek RPE; Może być wykorzystany do oceny jakości segmentacji. Katalog "Oznaczone kolorami" zawiera mapy cieplne dla każdego pomiaru kształtu, aby zobrazować wzory kształtów na każdym obrazie. Definicje i skróty metryk kształtu można znaleźć w tabeli 1.

Czasami płaskie mocowania RPE mogą zawierać resztki siatkówki, które nie zostały dokładnie usunięte, szczególnie w okolicach nerwu wzrokowego. Zabarwienie próbki falloidyną powoduje silny sygnał pochodzący z siatkówki, co może powodować problemy z segmentacją granic komórek RPE. Niektóre kafelki będą wyświetlane jako całkowicie czarne, podczas gdy otaczające je kafelki będą wykazywać normalną segmentację. Inne jasne obiekty, które mogą być obecne na obrazie, również spowodują generowanie czarnych kafelków (Rysunek 3). W takich przypadkach wybranie jednej z opcji filtrowania (Słaba, Zwykła, Silna) dostępnych w menu rozwijanym Filtr Arti zapobiegnie tworzeniu się czarnych kafelków.

REShAPE przyjmuje jako dane wejściowe 8-bitowe lub 16-bitowe obrazy w skali szarości, ale nie obrazy RGB. Użycie obrazów RGB do analizy REShAPE spowoduje uzyskanie całkowicie czarnych obrazów binarnych. W takim przypadku konwersja obrazów RGB na skalę szarości spowoduje utworzenie poprawnie podzielonych na segmenty obrazów binarnych (Rysunek 4). W niektórych przypadkach, gdy granice RPE nie są prawidłowo rozpoznawane, na przykład, jeśli barwienie nie jest optymalne lub jeśli próbka jest uszkodzona przez zadrapanie (Rysunek 5A), duże skupiska komórek mogą być zidentyfikowane jako pojedyncza bardzo duża komórka ( Figura 5B). W takim przypadku duże obiekty można wykluczyć z analizy, zmniejszając próg rozmiaru komórki (Rysunek 5C). Można to osiągnąć, wstawiając niższą wartość w polu tekstowym Górny rozmiar komórki. Spowoduje to jednak zmianę zasięgu mapy cieplnej. Jeśli badacz zdecyduje się to zrobić, możliwe jest również zachowanie oryginalnego zakresu mapy cieplnej (Rysunek 5D) poprzez zaznaczenie pola Tak w funkcji Użyj limitów ręcznych?. Następnie badacz musi kliknąć lewym przyciskiem myszy przycisk Ustaw limity i wstawić żądane wartości w polach tekstowych, aby określić ręczne limity.

Rysunek 2: Kompletna analiza morfometryczna całej ludzkiej monowarstwy RPE. (A) Widok w małym powiększeniu całego ludzkiego RPE/naczyniówki (magenta: falloidyna). (B) Powiększony widok komórek RPE barwionych falloidyną. (C) Segmentacja granic komórek RPE generowana przez REShAPE dla całego płaskiego montażu RPE/naczyniówki u człowieka oraz (D) odpowiedni widok powiększony. (E) Wygenerowana przez oprogramowanie mapa cieplna ilustrująca obszar komórek poszczególnych komórek RPE w całym ludzkim uchwycie płaskim. Skala termiczna w lewym górnym rogu pokazuje zakres użytych wartości. (F) Odpowiedni powiększony widok przedstawiający poszczególne komórki RPE pokolorowane według obszaru. Podziałka = (B,D,F) 50 μm, (A,C,E) 5 mm. Skrót: RPE = nabłonek barwnikowy siatkówki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Filtrowanie jasnych artefaktów. (A) Ludzki RPE flatmount wybarwiony na granice komórek (magenta: falloidyna) może prezentować jasne obszary (zielone prostokąty), które zakłócają segmentację. (B) Segmentacja granic komórek RPE całego flatmounta zawiera trzy całkowicie czarne płytki (zielone strzałki) odpowiadające jasnym obszarom fluorescencji. (C,E) Dwa z czarnych kafelków odpowiadają obszarom zawierającym jasne kropki, które mogą być jakimiś odłamkami. (D) Jedna z czarnych płytek została wygenerowana przez fragment siatkówki nerwowej wokół nerwu wzrokowego, który nie został prawidłowo usunięty. Fragmenty siatkówki nerwowej są znacznie jaśniejsze niż warstwa RPE i utrudniają segmentację komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wymagany obraz wejściowy. Komórki RPE wybarwione na granicy komórek zostały zapisane jako (A) RGB lub (B) 16-bitowe obrazy w skali szarości do analizy REShAPE. (C) Wynikiem analizy obrazu RBG jest obraz binarny, (D), podczas gdy analiza obrazu w skali szarości daje prawidłowo podzielony plik binarny granic komórek. REShAPE może analizować tylko 8-bitowe lub 16-bitowe obrazy w skali szarości. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Nieoptymalne wyniki. (A) Obraz fragmentu monowarstwy RPE, gdzie komórki zabarwione falloidyną zostały przypadkowo porysowane. (B) Mapa cieplna komórek RPE pokolorowana według wymiaru obszaru komórki. Duży górny próg rozmiaru komórki obejmuje duże obiekty w analizie. (C) Mapa cieplna obszaru komórki, w której wybrano mniejszy górny próg rozmiaru komórki w celu wykluczenia dużych obiektów z analizy. (D) Mapa cieplna obszaru komórki, w której wybrano mniejszy górny próg rozmiaru komórki i ustawiono ręczne limity, aby zachować pierwotnie używany zakres mapy cieplnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Parametry REShAPE. Tabela zawiera definicje każdego parametru i skróty używane w surowych arkuszach kalkulacyjnych (pliki "_Data.csv") oraz w mapach cieplnych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

Za pomocą tego protokołu można osiągnąć konsekwentne i skuteczne oddzielanie ludzkiego RPE od siatkówki. Metoda ta pozwala na badanie regionalnych różnic w kształcie RPE w całej siatkówce^człowieka5. Kluczowym krokiem w protokole jest fizyczne oddzielenie RPE od siatkówki. Jeśli obie tkanki nie są całkowicie oderwane w niektórych obszarach, należy delikatnie unieść siatkówkę, uważając, aby nie uszkodzić tkanek. Analiza REShAPE dużych płaskich uchwytów może wymagać użycia systemów o znacznych zasobach pamięci RAM. W takim przypadku ponowny montaż całego obrazu można wyłączyć, aby oprogramowanie mogło pomyślnie zakończyć analizę pomimo braku zasobów przetwarzania.

Głównym ograniczeniem stosowania REShAPE do segmentacji płaskich uchwytów RPE u ludzi jest to, że algorytm sztucznej inteligencji został w większości przeszkolony na obrazach indukowanych pluripotencjalnych RPE pochodzących z komórek macierzystych. W związku z tym segmentacja płaskich uchwytów RPE dla ludzi jest mniej dokładna. Komórki RPE od starzejących się dawców zawierają dużą ilość lipofuscyny⁷, a szerokie spektrum jej autofluorescencji zakłóca segmentację granic komórek. W przyszłości więcej obrazów płaskich mocowań RPE zostanie wykorzystanych w celu poprawy segmentacji granic komórek w tego rodzaju próbce. Pomimo tego ograniczenia, REShAPE został specjalnie przeszkolony w rozpoznawaniu i segmentacji granic komórek RPE i działa lepiej niż inne istniejące metody, takie jak segmentacja komórek RPE Voronoi⁸ i CellProfiler⁹ .

Co więcej, w porównaniu z ręczną segmentacją¹⁰, REShAPE ma tę zaletę, że szybko analizuje duże obrazy (przetestowano ~130 000 pikseli x 130 000 pikseli). Podsumowując, ta metoda preparacji jest wysoce powtarzalna i może być łatwo rozszerzona na inne modele zwierzęce. Ponadto oprogramowanie może być wykorzystywane do badania kształtu RPE w płaskich mocowaniach oczu lub w modelach hodowli komórkowych w celu zbadania efektu niektórych zabiegów. Wreszcie, wszechstronność REShAPE sprawia, że ma on szerokie zastosowanie do analizy innych typów komórek nabłonkowych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dziurkacz do biopsji 1,5 mm	Acuderm Inc.	P1525
Albumina bydlęca	MP Biomedicals	160069
Szkło nakrywkowe 50 x 75 mm, grubość #1,5	Laboratoria Badań Mózgu	5075-1.5D
Zakrzywiona szpatułka	Katena	K3-6600
D-Mannitol	Sigma	M9546
DPBS 1x z Ca2+ i Mg2+	Gibco	14040-133
Drobne nożyczki	Narzędzia do nauki	14558-11
Fluormount-G	Southern Biotech	0100-01
Kleszcze - Dumont #5	Fine Science Tools	11252-23
Szkiełka mikroskopowe 50 x 75 x 1,2 mm	Laboratoria Badań Mózgu	5075
Igły 21 G x 1-1/2" podskórne	Becton Dickinson (BD)	305167
Igły 27 G x 1-1/4" podskórne	Becton Dickinson (BD)	305136
Paraformaldehyd 16%	Mikroskopia elektronowa	15710
Szalka Petriego 100 mm	Corning	430167
Phalloidin-iFluor 647	Abcam	ab176759
Żyletki	PAL (Personna)	62-0177
Probówki z okrągłym dnem 50 ml	Newegg	9SIA4SR9M88854
Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning Corporation	4019862
Kwadratowa łódź wagowa (81 mm x 81 mm x 25 mm)	Sigma	W2876
System do witrektomii chirurgicznej	BD Visitrec	585100	opcjonalna
strzykawka 1 ml	Becton Dickinson (BD)	309659
Triton X-100	Sigma	T9284
TrueBlack	Biotium	23007	wygaszanie autofluorescencji
Tween 20	Affymetrix	20605
Vannas Nożyczki sprężynowe - 3 mm krawędź tnąca	Fine Science Tools	15000-10