Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Podsumowanie

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Streszczenie

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) i siatkówka są funkcjonalnie i strukturalnie połączonymi tkankami, które współpracują ze sobą, aby regulować percepcję światła i widzenie. Białka na powierzchni wierzchołkowej RPE są ściśle związane z białkami na zewnętrznej powierzchni segmentu fotoreceptora, co utrudnia konsekwentne oddzielanie RPE od fotoreceptorów/siatkówki. Opracowaliśmy metodę skutecznego oddzielania siatkówki od RPE ludzkich oczu w celu wygenerowania kompletnych płaskich mocowań RPE/naczyniówki i siatkówki do oddzielnej analizy komórkowej fotoreceptorów i komórek RPE. Wstrzyknięcie doszklistkowe roztworu D-mannitolu o wysokiej osmolarności, cukru nietransportowanego przez RPE, wywołało oddzielenie RPE i siatkówki w całej komorze tylnej, nie powodując uszkodzenia połączeń komórkowych RPE. Nie zaobserwowano żadnych plastrów RPE przyczepionych do siatkówki. Znakowanie aktyny falloidyną wykazało zachowanie kształtu RPE i umożliwiło analizę morfometryczną całego nabłonka. Opracowano oprogramowanie oparte na sztucznej inteligencji (AI) w celu dokładnego rozpoznawania i segmentacji granic komórek RPE oraz ilościowego określania 30 różnych wskaźników kształtu. Ta metoda preparacji jest wysoce powtarzalna i może być łatwo rozszerzona na inne modele zwierzęce.

Wprowadzenie

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) i siatkówka nerwowa są ze sobą silnie połączone ze względu na silną fizjologiczną zależność fotoreceptorów od RPE. Podczas rozwarstwiania mechaniczne oddzielenie siatkówki nerwowej od RPE powoduje rozerwanie komórek RPE, przy czym wierzchołkowe części RPE pozostają przyczepione do zewnętrznych segmentów fotoreceptorów siatkówki. Zakres zrostu RPE do siatkówki jest tak duży, że ilość pigmentu pozostałego na siatkówce po oddzieleniu jest wykorzystywana do ilościowego określenia siły zrostu siatkówki¹. W szczególności ścisłe połączenia RPE i łącząca je struktura aktynowa, które znajdują się po stronie wierzchołkowej, zrywają się podczas separacji mechanicznej. W związku z tym barwienie płaskich mocowań RPE dla granic komórek powoduje powstanie niejednolitej monowarstwy, w której wiele komórek ma brakujące granice. Efekt ten nasila się, gdy tkanka jest utrwalana paraformaldehydem (PFA) przed rozbiorem, ponieważ białka stają się usieciowane.

Badania nad dostarczaniem leków do ciała szklistego wykazały, że wstrzyknięcia roztworów hiperosmotycznych w tylnej komorze wywołują odwarstwienie siatkówki^2,3. W tych eksperymentach 50 μl różnych roztworów, w zakresie od 1000 mOsm do 2400 mOsm, wstrzykniętych do środkowego ciała szklistego, spowodowało odwarstwienie siatkówki w ciągu kilku minut. Warto zauważyć, że nawet po długich ekspozycjach na roztwory o wysokiej osmolarności, ścisłe połączenia RPE wydawały się nienaruszone na transmisyjnych obrazach mikroskopowych elektronów zarówno oczu królika, jak i małpy³. Postępując zgodnie z podobną strategią, wstrzyknęliśmy do środkowego ciała szklistego hiperosmotyczny roztwór D-mannitolu, aby wywołać skuteczne odwarstwienie siatkówki przed wykonaniem sekcji RPE. Ponieważ D-mannitol nie jest transportowany przez klasę RPE4, utrzymuje się wysokie stężenie w ciele szklistym, generując gradient osmotyczny. Skuteczne oddzielenie RPE od siatkówki w całej komorze tylnej gwarantuje zachowanie połączeń komórkowych RPE i pozwala na badanie morfometrii RPE na całym flatmountie. Ponadto opracowaliśmy oprogramowanie oparte na sztucznej inteligencji (AI), które rozpoznaje i segmentuje fluorescencyjnie oznaczone granice komórek RPE, określa ilościowo 30 różnych wskaźników kształtu i tworzy mapy cieplne każdej metryki do wizualizacji^5,6.

Protokół

Gałki oczne pobrano z ciał ludzkich z Advanced Sight Network (Birmingham, AL). Prace wykonane na tkance pośmiertnej zostały zwolnione przez Institutional Review Board NIH z wymogu zatwierdzenia przez komisję etyki badań.

1. Transport gałek ocznych

1. Po enukleacji należy przesłać świeże gałki oczne w pojemniku wypełnionym lodowatym DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺.
   UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie sekcji oka w ciągu 24 h po enukleacji. Morfologia RPE nie ulega zmianie w tym przedziale czasowym.

2. Przygotowanie formy silikonowej

1. Odetnij dolne 20 mm probówki okrągłodnej o średnicy 25 mm. Umieść ją u podstawy kwadratowej łódki wagowej (81 mm x 81 mm x 25 mm).
2. Wymieszaj dwa składniki zestawu do elastomeru silikonowego w stosunku 10:1, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Wlej mieszaninę do łódki wagowej zawierającej sferyczny fragment probówki okrągłodnej.
3. Utwardzaj silikon w temperaturze pokojowej przez noc. Usuń łódkę wagową oraz probówkę okrągłodną z utwardzonej formy silikonowej.

3. Disekcja RPE

1. Oczyść twardówkę świeżego gałki ocznej z mięśni i tkanki łącznej. Przymocuj oko do formy silikonowej za pomocą igieł 27 G przełożonych przez twardówkę. Wypełnij jamę formy roztworem DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺.
   UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić komory oka. Igły powinny przechodzić wyłącznie przez twardówkę.
2. Używając strzykawki 1 mL i igły 21 G, wstrzyknij ~400 µL roztworu D-mannitolu o stężeniu 1 700 mOsm do ciała szklistego. Wprowadź igłę przez pars plana, aby uniknąć przebicia przedniej komory oka. Pozostaw oko w temperaturze pokojowej przez ~45 min.
3. Rozetnij przednią komorę na poziomie pars plana, używając precyzyjnych nożyczek i pęsety. Wypełnij tylną komorę oka roztworem DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Pod stereomikroskopem zlokalizuj plamkę żółtą (żółty punkt na siatkówce).
4. Jeśli dostępny jest chirurgiczny witrektom, usuń ciało szkliste i zastąp je roztworem DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Alternatywnie, spróbuj unieść ciało szkliste pęsetą i odciąć je precyzyjnymi nożyczkami.
5. Uważając na zachowanie obszaru plamki, podziel oko na kwadranty: nosowy, skroniowy, górny i dolny. Usuń igły, jeśli utrudniają one pracę.
6. Przenieś rozpostartą tylną komorę oka do szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Przed usunięciem siatkówki oznacz płatek zawierający plamkę, wykonując niewielkie nacięcie (w kształcie litery V) na brzegu rzęskowym. Unieś i odetnij całe ciało szkliste zalegające na siatkówce.
7. Delikatnie unieś siatkówkę z kilku stron za pomocą zakrzywionej szpatułki lub pęsety, aby sprawdzić, czy siatkówka oddzieliła się od RPE oraz aby umożliwić przepływ płynu między tymi dwiema warstwami.
   UWAGA: Siatkówka nadal będzie przytwierdzona na samej peryferii (brzegi rzęskowe) oraz przy nerwie wzrokowym.
8. Odetnij siatkówkę od brzegów rzęskowych we wszystkich płatkach, dbając o to, aby nie porysować RPE. Umieść tkankę w 4% PFA i inkubuj przez ~1 h. Przemyj 3x roztworem DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Przenieś tkankę do pojemnika wypełnionego DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ i przechowuj w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Na tym etapie siatkówka jest przytwierdzona jedynie do nerwu wzrokowego. Jest to punkt przerwania w tym eksperymencie.
9. Przenieś próbkę do szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Wybij głowę nerwu wzrokowego za pomocą bioptera 1,5 mm i pobierz siatkówkę. Przechowuj siatkówkę neuronalną w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Przed wycięciem głowy nerwu wzrokowego należy odciąć nerw wzrokowy jak najdalej po stronie twardówki. Zwiększy to precyzję wycinania. Wycięcie nerwu wzrokowego po utrwaleniu preparatu flatmount w 4% PFA zmniejsza uszkodzenia komórek RPE zlokalizowanych wokół nerwu wzrokowego.
10. Oddziel twardówkę od RPE/brodawki naczyniówkowej, delikatnie unosząc warstwę RPE/naczyniówki od peryferii i przecinając naczynia naczyniówkowe oraz tkankę łączną znajdujące się między twardówką a RPE za pomocą sprężynowych nożyczek Vannasa. Po całkowitym oddzieleniu RPE/naczyniówki od twardówki pobierz warstwę RPE/naczyniówki. Przenieś tkankę do pojemnika wypełnionego DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ i przechowuj w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Na tym etapie eksperyment można przerwać.

4. Barwienie

1. Przenieś preparat RPE/naczyniówki do jednego dołka płytki 6-dołkowej. Przeprowadź blokowanie i permeabilizację próbki w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ z dodatkiem 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5% Tween 20 oraz 0,5% Triton X-100 przez 1 h w temperaturze pokojowej.
2. Inkubuj próbkę z falloidyną sprzężoną z fluorophorem 647 w rozcieńczeniu 1:250 w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺ z 1% BSA, 0,5% Tween 20 i 0,5% Triton X-100 przez 1 h w temperaturze pokojowej. Przemyj 3x w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺.
3. Przenieś próbkę RPE/naczyniówki na szkiełko przedmiotowe o wymiarach 50 mm x 75 mm i rozprostuj ją. Przetnij każdy „płatek” na pół, aby próbka była bardziej płaska. Zwróć uwagę na plamkę żółtą (macula). Obrysuj kontur preparatu typu flatmount za pomocą pisaka hydrofobowego.
4. Aby wygasić autofluorescencję lipofuscyny, dodaj 500 µL roztworu wygaszacza autofluorescencji rozcieńczonego 1:20 w 70% etanolu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 min.
5. Przemyj dokładnie (co najmniej 3x) w DPBS 1x z Ca²⁺ i Mg²⁺. Usuń DPBS i dodaj medium montażowe. Połóż szkiełko nakrywkę na preparacie typu flatmount i zabezpiecz lakierem do paznokci.
6. Wykonaj obrazowanie preparatu typu flatmount za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (najlepiej przy użyciu obiektywu 10x lub 20x).

5. Analiza REShAPE

UWAGA: Ponieważ algorytm REShAPE oparty na sztucznej inteligencji był trenowany na obrazach przy powiększeniu 10x i 20x, wysoce zaleca się stosowanie obiektywu 10x lub 20x podczas obrazowania. W przeciwnym razie obrazy będą wymagały odpowiedniego przeskalowania.

1. Jeśli obrazy zostały pozyskane przy użyciu więcej niż jednego kanału fluorescencyjnego, wyizoluj kanał służący do obrazowania granic komórek. Wyeksportuj obrazy jako 16-bitowe skalami szarości pliki TIF.
   UWAGA: Obrazy pozyskane z rozszerzeniem pliku .czi nie muszą być eksportowane do plików TIF, ale kanał zawierający granice komórek nadal musi zostać wyizolowany.
2. Zainstaluj oprogramowanie na platformach Windows x64 lub Linux (Centos 7).
   UWAGA: Oprogramowanie oraz instrukcje instalacji znajdują się pod adresem https://github.com/nih-nei/REShAPE.
3. Uruchom oprogramowanie (Rycina 1).
4. W karcie Directories wybierz foldery wejściowe i wyjściowe. W polu input directory wybierz folder zawierający obrazy. W polu output directory pozwól oprogramowaniu automatycznie zmienić ścieżkę na „input directory/Processed”. Alternatywnie zmień katalog wyjściowy ręcznie.
   UWAGA: Oprogramowanie przetworzy wszystkie obrazy zawarte w folderze wejściowym.
5. W karcie NN Segmentation Options wybierz następujące ustawienia segmentacji obrazu:
   1. Batch Size: Wpisz w polu tekstowym wartość 20 jako dobry punkt wyjścia, ale zmniejsz ją, jeśli system wyczerpie zasoby jednostek przetwarzania graficznego (GPU).
      UWAGA: Oryginalny obraz jest dzielony na mniejsze kafelki w celu ich przetworzenia. Rozmiar partii określa, ile kafelków może być przetwarzanych jednocześnie.
   2. Use GPU?: Jeśli system nie posiada wystarczających zasobów GPU, zaznacz pole No.
   3. Internal Scale: Korzystając z menu rozwijanego, zmień wewnętrzne skalowanie z opcji None w przypadkach, gdy obrazy nie były pozyskane przy użyciu obiektywu 10x lub 20x. Na przykład, zmniejsz skalę obrazów 40x do połowy rozmiaru za pomocą przycisku 1/2 . Dostępne w menu rozwijanym opcje zmiany skali są następujące: 5x, 2x, None, 1/2, 1/5.
      UWAGA: Algorytm uczenia maszynowego był trenowany na obrazach 10x i 20x. Może on nie rozpoznać granic komórek na obrazach wykonanych przy innych powiększeniach. W takim przypadku obrazy binarne będą całkowicie czarne.
   4. Arti Filter: Użyj karty filtra artefaktów, aby usunąć bardzo jasne cząstki (zanieczyszczenia lub małe fragmenty siatkówki lub tkanki łącznej wokół nerwu wzrokowego), które mogą występować na obrazie i mogą zakłócać segmentację granic komórek. Domyślnie żaden filtr nie jest stosowany. Opcje filtra artefaktów w menu rozwijanym to: Regular, Strong oraz Weak.
6. W karcie Tiled Image Option wprowadź wartość w polu tekstowym, aby określić zakres nakładania się kafelków obrazu, dostosowując parametr Pad Tiles By . Zakładka o szerokości 100 pikseli zazwyczaj sprawdza się dobrze.
7. W karcie Output Graphic Options dostrój ustawienia generowania map ciepła:
   1. Reconstruct Tiled Images?: jeśli system nie posiada wystarczających zasobów do analizy dużych obrazów, zaznacz pole No , aby umożliwić oprogramowaniu zakończenie analizy poprzez zapisywanie poszczególnych kafelków bez rekonstruowania całego obrazu.
   2. Create Color Images: Aby wygenerować mapy ciepła, wybierz opcję All z menu rozwijanego.
   3. W przypadku Coloring wybierz dowolną z różnych palet kolorów dostępnych w menu rozwijanym: Thermal, Green, Mpl-magma, Phase, Fire, Jet, Cyan Hot.
   4. W przypadku Image Format zapisz obrazy jako TIF lub PNG, wybierając jedną z opcji w karcie.
   5. W odniesieniu do funkcji Use Manual Limits? zaznacz pole No, aby oprogramowanie korzystało z minimalnych i maksymalnych wartości wykrytych na każdym obrazie. Zaznacz pole Yes , aby ręcznie dostosować zakres wartości dla każdej mapy ciepła parametrów kształtu, a następnie kliknij przycisk Set Limits , aby wybrać zakresy dla poszczególnych parametrów, wpisując wartości w polach tekstowych. Po zmianie interesujących wartości kliknij Save. Kliknij Load Defaults, aby zresetować wszystkie limity.
      UWAGA: Używaj limitów ręcznych, jeśli mapy ciepła z wielu obrazów muszą zostać porównane, na przykład podczas porównywania wpływu różnych związków na kształt komórek. W ten sposób stosowany jest ten sam zakres wartości. Zestaw wartości wprowadzanych ręcznie różni się w zależności od rodzaju próbki. Zaleca się przeprowadzenie kilku iteracji w celu wybrania optymalnego zakresu.
8. W karcie Cell Size Restrictions for Analysis wybierz próg wielkości komórki dla analizy:
   1. W polu Lower Cell Size wpisz w polu tekstowym rozmiar najmniejszej komórki, która ma zostać uwzględniona w analizie.
   2. W polu Upper Cell Size wpisz w polu tekstowym rozmiar największej komórki, która ma zostać uwzględniona w analizie.
      UWAGA: Jednostka wielkości komórki zmienia się z pikseli na mikrometry kwadratowe w zależności od opcji wybranej w karcie Automated Unit Conversion.
9. W karcie Automated Unit Conversion wybierz preferowaną jednostkę analizy:
   1. W polu Convert pixels to real units? zaznacz pole No, aby przeprowadzić analizę w jednostkach pikseli. Zaznacz pole Yes , aby przeprowadzić analizę w mikrometrach.
   2. W polu Length of scale bar (Pixels) wprowadź wartość w pikselach w polu tekstowym.
   3. W polu Length of scale bar (Microns) wprowadź w polu tekstowym odpowiadającą odległość w mikrometrach.
10. Aby rozpocząć analizę, naciśnij Go For It.
    UWAGA: Oprogramowanie może również mierzyć żywotność komórek, gdy komórki są barwione 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) i jodkiem propidyny (karta CZI options), ale nie dotyczy to preparatów typu flatmount RPE.

Rycina 1: Graficzny interfejs użytkownika REShAPE. Interfejs GUI posiada różne karty służące do wyboru katalogów roboczych (karta Directories), modyfikacji opcji segmentacji (karty NN Segmentation Options oraz Tiled Image Options), określania parametrów analizy (karty Cell Size Restrictions for Analysis oraz Automated Unit Conversion) oraz generowania map ciepła (karta Output Graphics Options). Skrót: GUI = graficzny interfejs użytkownika. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie obrazu jednej płaszczyzny preparatu typu flatmount, w którym dla każdej prawidłowo zidentyfikowanej komórki RPE mierzone jest położenie komórki oraz 30 parametrów kształtu (Rysunek 2). Wewnątrz katalogu wejściowego automatycznie generowany jest folder o nazwie „Processed”. Folder ten zawiera cztery podkatalogi o nazwach „Analysis”, „Color Coded”, „Combined Files” i „Segmented Images”, a także pliki tymczasowe utworzone podczas analizy. Folder „Combined Files” zawiera arkusz kalkulacyjny ze wszystkimi pomiarami kształtu oraz arkusz z częstotliwością liczby sąsiadujących komórek dla wszystkich połączonych plików. Folder „Analysis” zawiera arkusz ze wszystkimi pomiarami kształtu oraz arkusz z częstotliwością liczby sąsiadujących komórek dla każdego obrazu osobno. Katalog „Segmented Images” zawiera końcowe maski binarne granic komórek RPE; można go wykorzystać do oceny jakości segmentacji. Katalog „Color Coded” zawiera mapy ciepła dla każdego pomiaru kształtu, aby zwizualizować wzorce kształtów na każdym obrazie. Definicje i skróty parametrów kształtu znajdują się w Tabeli 1.

Czasami preparaty RPE typu flatmount mogą zawierać pozostałości siatkówki, które nie zostały całkowicie usunięte, szczególnie w okolicy nerwu wzrokowego. Barwienie próbki faloidyną powoduje wystąpienie silnego sygnału pochodzącego z siatkówki, co może utrudniać segmentację granic komórek RPE. Niektóre kafelki mogą wydawać się całkowicie czarne, podczas gdy kafelki sąsiadujące będą wykazywać prawidłową segmentację. Inne jasne obiekty, które mogą znajdować się na obrazie, również mogą powodować powstawanie czarnych kafelków (Rycina 3). W takich przypadkach wybranie jednej z opcji filtrowania (Weak, Regular, Strong) dostępnych w menu rozwijanym Arti Filter zapobiegnie powstawaniu czarnych kafelków.

Program REShAPE przyjmuje jako dane wejściowe 8- lub 16-bitowe obrazy w skali szarości, ale nie obrazy RGB. Użycie obrazów RGB w analizie REShAPE spowoduje uzyskanie całkowicie czarnych obrazów binarnych. W takim przypadku konwersja obrazów RGB na skalę szarości pozwoli na uzyskanie prawidłowo segmentowanych obrazów binarnych (Rycina 4). W niektórych sytuacjach, gdy granice RPE nie są rozpoznawane prawidłowo, na przykład z powodu nieoptymalnego barwienia lub uszkodzenia próbki przez zarysowanie (Rycina 5A), duże skupiska komórek mogą zostać zidentyfikowane jako jedna, bardzo duża komórka (Rycina 5B). W takim przypadku duże obiekty można wykluczyć z analizy poprzez zmniejszenie progu rozmiaru komórek (Rycina 5C). Można to osiągnąć, wpisując niższą wartość w polu tekstowym Upper Cell Size. Spowoduje to jednak zmianę zakresu mapy ciepła. Jeśli badacz zdecyduje się na takie działanie, istnieje również możliwość zachowania oryginalnego zakresu mapy ciepła (Rycina 5D) poprzez zaznaczenie pola Yes w funkcji Use Manual Limits?. Następnie badacz musi kliknąć lewym przyciskiem myszy przycisk Set Limits i wprowadzić żądane wartości w polach tekstowych, aby określić limity ręczne.

Rysunek 2: Pełna analiza morfometryczna całej ludzkiej monowarstwy RPE. (A) Widok przy małym powiększeniu całego preparatu RPE/naczyniówki człowieka (magenta: faloidyna). (B) Powiększony widok komórek RPE barwionych faloidyną. (C) Segmentacja granic komórek RPE wygenerowana przez REShAPE dla całego preparatu RPE/naczyniówki człowieka i (D) odpowiadający mu powiększony widok. (E) Wygenerowana programowo mapa ciepła ilustrująca powierzchnię poszczególnych komórek RPE w całym ludzkim preparacie. Skala termiczna w górnym lewym rogu pokazuje zakres użytych wartości. (F) Odpowiedni widok powiększony, przedstawiający poszczególne komórki RPE pokolorowane według powierzchni. Paski skali = (B,D,F) 50 µm, (A,C,E) 5 mm. Skrót: RPE = nabłonek pigmentowy siatkówki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Filtrowanie jasnych artefaktów. (A) Preparat flatmount RPE człowieka barwiony na granice komórek (magenta: faloidyna) może zawierać jasne obszary (zielone prostokąty), które utrudniają segmentację. (B) Segmentacja granic komórek RPE całego preparatu flatmount zawiera trzy całkowicie czarne kafelki (zielone strzałki), odpowiadające jasnym obszarom fluorescencji. (C,E) Dwa z czarnych kafelków odpowiadają obszarom zawierającym jasne punkty, które prawdopodobnie są pozostałościami zanieczyszczeń. (D) Jeden z czarnych kafelków powstał w wyniku obecności fragmentu siatkówki neuronowej wokół nerwu wzrokowego, który nie został prawidłowo usunięty. Fragmenty siatkówki neuronowej są znacznie jaśniejsze niż warstwa RPE i utrudniają segmentację komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 4: Wymagania dotyczące obrazu wejściowego. Komórki RPE barwione na granice komórkowe zostały zapisane jako (A) obrazy RGB lub jako (B) 16-bitowe obrazy w skali szarości do analizy REShAPE. (C) Wynikiem analizy obrazu RGB jest czarny obraz binarny, (D) natomiast analiza obrazu w skali szarości daje prawidłowo segmentowany obraz binarny granic komórek. Program REShAPE może analizować wyłącznie obrazy w skali szarości 8-bitowe lub 16-bitowe. Paski skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Wyniki nieoptymalne. (A) Obraz fragmentu monowarstwy RPE, w której komórki barwione falloidyną zostały przypadkowo zarysowane. (B) Mapa ciepła komórek RPE pokolorowana według wymiaru pola powierzchni komórek. Wysoki górny próg wielkości komórek powoduje włączenie dużych obiektów do analizy. (C) Mapa ciepła pola powierzchni komórek, w której wybrano niższy górny próg wielkości komórek, aby wykluczyć duże obiekty z analizy. (D) Mapa ciepła pola powierzchni komórek, w której wybrano niższy górny próg wielkości komórek i ustawiono ręczne limity, aby zachować pierwotny zakres mapy ciepła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Parametry REShAPE. Tabela zawiera definicję każdego parametru oraz skróty użyte w arkuszach danych surowych (pliki „_Data.csv”) i na mapach ciepła. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

Dyskusja

Za pomocą tego protokołu można osiągnąć konsekwentne i skuteczne oddzielanie ludzkiego RPE od siatkówki. Metoda ta pozwala na badanie regionalnych różnic w kształcie RPE w całej siatkówce^człowieka5. Kluczowym krokiem w protokole jest fizyczne oddzielenie RPE od siatkówki. Jeśli obie tkanki nie są całkowicie oderwane w niektórych obszarach, należy delikatnie unieść siatkówkę, uważając, aby nie uszkodzić tkanek. Analiza REShAPE dużych płaskich uchwytów może wymagać użycia systemów o znacznych zasobach pamięci RAM. W takim przypadku ponowny montaż całego obrazu można wyłączyć, aby oprogramowanie mogło pomyślnie zakończyć analizę pomimo braku zasobów przetwarzania.

Głównym ograniczeniem stosowania REShAPE do segmentacji płaskich uchwytów RPE u ludzi jest to, że algorytm sztucznej inteligencji został w większości przeszkolony na obrazach indukowanych pluripotencjalnych RPE pochodzących z komórek macierzystych. W związku z tym segmentacja płaskich uchwytów RPE dla ludzi jest mniej dokładna. Komórki RPE od starzejących się dawców zawierają dużą ilość lipofuscyny⁷, a szerokie spektrum jej autofluorescencji zakłóca segmentację granic komórek. W przyszłości więcej obrazów płaskich mocowań RPE zostanie wykorzystanych w celu poprawy segmentacji granic komórek w tego rodzaju próbce. Pomimo tego ograniczenia, REShAPE został specjalnie przeszkolony w rozpoznawaniu i segmentacji granic komórek RPE i działa lepiej niż inne istniejące metody, takie jak segmentacja komórek RPE Voronoi⁸ i CellProfiler⁹ .

Co więcej, w porównaniu z ręczną segmentacją¹⁰, REShAPE ma tę zaletę, że szybko analizuje duże obrazy (przetestowano ~130 000 pikseli x 130 000 pikseli). Podsumowując, ta metoda preparacji jest wysoce powtarzalna i może być łatwo rozszerzona na inne modele zwierzęce. Ponadto oprogramowanie może być wykorzystywane do badania kształtu RPE w płaskich mocowaniach oczu lub w modelach hodowli komórkowych w celu zbadania efektu niektórych zabiegów. Wreszcie, wszechstronność REShAPE sprawia, że ma on szerokie zastosowanie do analizy innych typów komórek nabłonkowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dziurkacz do biopsji 1,5 mm	Acuderm Inc.	P1525
Albumina bydlęca	MP Biomedicals	160069
Szkło nakrywkowe 50 x 75 mm, grubość #1,5	Laboratoria Badań Mózgu	5075-1.5D
Zakrzywiona szpatułka	Katena	K3-6600
D-Mannitol	Sigma	M9546
DPBS 1x z Ca2+ i Mg2+	Gibco	14040-133
Drobne nożyczki	Narzędzia do nauki	14558-11
Fluormount-G	Southern Biotech	0100-01
Kleszcze - Dumont #5	Fine Science Tools	11252-23
Szkiełka mikroskopowe 50 x 75 x 1,2 mm	Laboratoria Badań Mózgu	5075
Igły 21 G x 1-1/2" podskórne	Becton Dickinson (BD)	305167
Igły 27 G x 1-1/4" podskórne	Becton Dickinson (BD)	305136
Paraformaldehyd 16%	Mikroskopia elektronowa	15710
Szalka Petriego 100 mm	Corning	430167
Phalloidin-iFluor 647	Abcam	ab176759
Żyletki	PAL (Personna)	62-0177
Probówki z okrągłym dnem 50 ml	Newegg	9SIA4SR9M88854
Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning Corporation	4019862
Kwadratowa łódź wagowa (81 mm x 81 mm x 25 mm)	Sigma	W2876
System do witrektomii chirurgicznej	BD Visitrec	585100	opcjonalna
strzykawka 1 ml	Becton Dickinson (BD)	309659
Triton X-100	Sigma	T9284
TrueBlack	Biotium	23007	wygaszanie autofluorescencji
Tween 20	Affymetrix	20605
Vannas Nożyczki sprężynowe - 3 mm krawędź tnąca	Fine Science Tools	15000-10