Protokół przestrzegał australijskiego kodeksu Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych18. Komitet ds. Etyki Zwierząt Uniwersytetu Australii Zachodniej prospektywnie zatwierdził protokół (RA3/100/1596). Owce pochodziły z farmy Uniwersytetu Australii Zachodniej (UWA) Ridgefield (2018-2020). Owce zostały wprowadzone do akredytowanego przez AAALAC UWA Large Animal Facility 2-3 tygodnie przed interwencją chirurgiczną. Owce były początkowo trzymane w pomieszczeniach zamkniętych we wspólnych kojcach z podniesioną podłogą, z pojedynczymi kojcami używanymi w okresie okołooperacyjnym. Owce karmiono granulatem, plewami owsianymi i łubinem z mieszanką mineralną liczoną na masę ciała. Pomieszczenia były kontrolowane pod względem temperatury (20,5-21,5 °C) i utrzymywane w cyklu 12:12 godzina światło i ciemność. Ból i samopoczucie oceniano w okresie pooperacyjnym dwa razy dziennie przez 7 dni, a następnie codziennie aż do zakończenia badania. Monitorowane parametry pooperacyjne obejmowały objawy bólu, zaciśnięcie oczodołu, wysiłek oddechowy, temperaturę, tętno, miejsce operacji, apetyt i spożycie wody, aktywność, kulawiznę, stan sierści, konsystencję kału, poród przedwczesny, zachowanie i objawy toksemii ciążowej. Punkty przypisane do każdego parametru uruchamiały interwencję w razie potrzeby.
UWAGA: Wymagane były dwie procedury chirurgiczne: przygotowanie owcy, podejście chirurgiczne i zamknięcie, oraz rekonwalescencja owcy są takie same dla obu procedur chirurgicznych. Pierwszym zabiegiem jest chirurgiczne stworzenie przepukliny przeponowej u płodu jagnięcia. Druga procedura polega na umieszczeniu urządzenia do interwencji płodu i monitorowania ciśnienia. Projekt badania wymagał przeprowadzenia dwóch operacji przeżycia, aby umożliwić przemieszczenie się treści brzusznej do jamy klatki piersiowej po wytworzeniu przepukliny przeponowej tak, aby hipoplazja płuc mogła rozwinąć się przed kolejną operacją interwencyjną.
1. Chirurgiczne stworzenie przepukliny przeponowej u płodu jagniąt
- Przygotowanie owiec
- W ~ 80 dniu ciąży należy premedykować owcę za pomocą domięśniowego wstrzyknięcia acepromazyny (0,04 mg / kg) i morfiny (0,3 mg / kg).
- Znieczulenie należy podać dożylnie ketaminą (5 mg/kg) i midazolamem (0,25 mg/kg).
- Zaintubować tchawicę owcy owcy rurką dotchawiczą (średnica wewnętrzna 8 mm [ID]). Utrzymuj znieczulenie izofluranem (1%-3% tlenu) dostarczanym przez wentylację nadciśnieniową (10-12 oddechów/min, objętość oddechowa 8-10 ml/kg).
- Ustal monitorowanie owcy za pomocą elektrokardiogramu (EKG), inwazyjnego ciśnienia tętniczego krwi za pomocą cewnika tętniczego ucha, wygasłego CO2, obwodowego wysycenia tlenem i temperatury podczas operacji.
- Umieść owcę na wznak na noszach. Owiń liny wokół nóg owcy i delikatnie przymocuj do stołu.
- Odetnij wełnę od brzucha i boku owcy, a następnie przypnij ją do skóry.
- Usuń brud i lanolinę z brzucha, boku i pachwiny owcy wodą z mydłem.
- Podawać cefazolinę (20 mg/kg) dożylnie co 90 minut podczas zabiegu.
- Przenieś owcę na salę operacyjną na noszach.
- Przenieś owcę z noszy transportowej na stół operacyjny.
- Umieść owcę w pozycji leżącej grzbietowej na stole operacyjnym.
- Przymocuj wszystkie kończyny do stołu operacyjnego za pomocą miękkich opasek linowych.
- Aseptyczne przygotowanie odsłoniętego brzucha: Przemyć 3 razy 4% peelingiem chirurgicznym z chlorheksydyną, usuwając zanieczyszczony roztwór między każdym myciem 70% alkoholem.
- Kompletny sterylny preparat poprzez lekkie rozpylenie 10% roztworu jodu na brzuch, bok i pachwiny.
- Przykryj owcę sterylną zasłoną chirurgiczną z okienkami, tak aby odsłonięte było tylko miejsce nacięcia brzucha. Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne, cewniki, strzykawki i roztwory używane podczas operacji są sterylne.
- Dostęp chirurgiczny
- Ustalić znieczulenie miejscowe z blokadą liniową poprzez miejscowe podskórne i mięśniowe naciekanie bupiwakainy (5%; 9,5 ml) za pomocą strzykawki 10 ml i igły 22 G.
- Odsłoń macicę przez nacięcie brzuszne w linii środkowej (8-11 cm) przez skórę owcy, tkankę podskórną i linię białą wykonaną za pomocą ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10 z kauteryzacją zgodnie z wymaganiami, aby zminimalizować krwawienie z nacięcia.
- Tworzenie przepukliny przeponowej
- Zlokalizuj głowę/klatkę piersiową płodu za pomocą badania palpacyjnego.
- Przykryj macicę sterylną folią.
- Użyj nożyczek chirurgicznych, aby zrobić okienko (6 cm x 4 cm) w folii.
- Wykonaj 5-7 cm nacięcie macicy przez macicę i worek owodniowy z cięciem kauterycznym, omijając naczynia krwionośne macicy i liścienie łożyskowe.
- Zewnętrznie zewnętrzizować głowę i kończyny przednie płodu.
- Użyj zacisków macicy Babcock, aby uszczelnić krawędzie nacięcia macicy i sterylnego plastiku szczelnie owinąć wokół brzucha płodu, aby zapobiec utracie płynu owodniowego.
- Ułóż płód na prawym boku i przykryj drugą sterylną folię na zewnątrz płodu, aby zmniejszyć utratę ciepła i wilgoci. Zidentyfikuj przestrzeń międzyżebrową między 9. a 10. żebrem po lewej stronie i wytnij otwór w plastikowej folii nożyczkami chirurgicznymi, aby uzyskać dostęp do zamierzonego miejsca nacięcia płodu.
- Ustalić znieczulenie miejscowe blokowe u płodu poprzez miejscowe podskórne i mięśniowe naciekanie bupiwakainy (5%; 0,25 ml rozcieńczone do 0,5 ml jałowym roztworem soli fizjologicznej; 1 ml sterylnej strzykawki i igły 27 G) w 9. przestrzeni międzyżebrowej bezpośrednio przylegającej do górnej granicy 10. żebra, aby uniknąć naczyń podżebrowych.
- Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 60 ml, aby wykąpać odsłoniętą skórę płodu ciepłym roztworem Hartmanna (5-10 ml co 5-10 minut), aby utrzymać wilgotność skóry płodu podczas kolejnych etapów.
- Wykonać torakotomię lewą tylno-boczną, wykonując 2-4 cm nacięcie skóry z elektrokoagulacją w 9. przestrzeni międzyżebrowej bezpośrednio przylegającej do granicy czaszki 10. żebra.
- Użyj hemostatów komarów, aby tępo wypreparować tkankę podskórną, mięśnie międzyżebrowe i błonę opłucnową, aby uzyskać dostęp do przepony.
- Użyj dwóch małych hemostatów komara, aby podnieść przeponę na każdym końcu zamierzonego miejsca przepukliny o długości 1 cm i podnieś przeponę czaszkowo, aby utrzymać ją z dala od leżącego poniżej żołądka, wątroby i śledziony.
- Wykonaj 1 cm nacięcie między dwoma hemostatykami za pomocą małych kątowych nożyczek.
- Zwolnij hemostatyki przytrzymujące membranę.
- Użyj atraumatycznych kleszczy Pottsa, aby przeciągnąć żołądek przez otwór w przeponie.
- Użyj pojedynczego opaski z wchłanialnego monofilamentu 5-0 polidioksanonu (igła stożkowa RB-1), aby ostrożnie owinąć 9. i 10. żebro, aby przeciwstawić żebra płodu, unikając leżącego poniżej płuca.
- Zamknij nacięcie torakotomii szwem materacowym (wchłanialna żyłka 5-0 polidioksanonu).
- Zamknięcie chirurgiczne
- Zwróć płód do worka owodniowego.
- Meloksykam śródoperacyjny (0,25 mg/kg; podskórnie) należy podać owcy w celu znieczulenia pooperacyjnego.
- Utracony płyn owodniowy zastąpić podgrzanym roztworem Hartmanna (~50 ml) wraz z doowodniową piperacyliną/tazobaktamem (1000 mg/125 mg).
- Przyłóż przeciwległe powierzchnie kosmówki i przyległych ścian macicy i użyj wchłanialnego nici 2-0 w oplocie poliglaktyny 910 z odwróconym szwem materacowym, aby zamknąć razem macicę i worek owodniowy.
- Zamknij kresę białą maciorki, tkankę podskórną i skórę (odpowiednio wchłanialna żyłka polidioksanonowa 1, wchłanialna poligłakapron 25 monofilament 3-0 i niewchłanialna żyłka polipropylenowa 2-0).
- Odzyskiwanie i monitorowanie owiec
- Spryskaj ranę brzuszną po operacji wodoodporną taśmą przytrzymującą opatrunek i przykryj opatrunkiem, aby zmniejszyć ryzyko zakażenia rany pooperacyjnej.
- Nałóż transdermalny plaster z fentanylem (100 μg/h) na pachwinę w celu dodatkowego znieczulenia pooperacyjnego.
- Odzyskaj owcę i ekstubuj się podczas spontanicznego oddychania, a następnie pozwól mu się obudzić.
- Monitoruj owce codziennie, aż do porodu w celu przeprowadzenia operacji interwencji płodu.
- Zdejmij szwy po 14 dniach.
2. Umiejscowienie urządzenia do interwencji płodu i monitorowania ciśnienia
- Przygotowanie owcy do zabiegu interwencyjnego płodu w 101 dniu ciąży
- Medroksyprogesteron (1 ml) należy wstrzyknąć domięśniowo po ~85 dniu ciąży (termin ~147 dni), aby zmniejszyć ryzyko przedwczesnego porodu.
- Użyj tej samej procedury znieczulenia i przygotowania chirurgicznego, która jest używana do początkowej operacji tworzenia przepony.
- Postępuj zgodnie z podejściem chirurgicznym w krokach 2.1.2.2 i 2.1.2.3, podobnie jak w krokach 1.2.1-1.2.2.
- Ustalić znieczulenie miejscowe blokowe poprzez miejscowe podskórne i mięśniowe naciekanie bupiwakainy (5 %; 9,5 ml) za pomocą strzykawki 10 ml i igły 22 G.
- Z nacięciem brzusznym w linii środkowej (8 - 11 cm) przylegającym do miejsca nacięcia jamy brzusznej używanego do operacji tworzenia przepony, należy odsłonić macicę przez skórę owcy, tkankę podskórną i linea alba wykonaną za pomocą ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10 z kauteryzacją zgodnie z wymaganiami, aby zminimalizować krwawienie z nacięcia.
- Dodatkowo należy podać domięśniowo oksytetracyklinę (20 mg/kg) maciorce, aby zapewnić ochronę przeciwbakteryjną płodu przed przewlekle wszczepionym urządzeniem monitorującym.
- Aktywacja urządzenia
- Aktywuj urządzenie do pomiaru ciśnienia19.
- Rurka do pomiaru ciśnienia cęgowego z hemostatykami.
- Umieść całe urządzenie w sterylnej misce zawierającej mieszaninę 0,08% kwasu nadoctowego i 1% nadtlenku wodoru na co najmniej 1 godzinę, upewniając się, że całe urządzenie jest przykryte.
- Za pomocą sterylnego zacisku przenieś urządzenie do sterylnej miski zawierającej sterylną wodę na co najmniej 10 minut przed implantacją płodu. Upewnij się, że całe urządzenie jest pokryte sterylną wodą.
- Dostęp chirurgiczny i interwencja płodu
- Egzeryoryzację głowy płodu za pomocą histerotomii przy użyciu tego samego podejścia chirurgicznego, które zastosowano przy początkowej operacji, ale z sąsiednimi nacięciami macicy (kroki 1.1-2.2).
- Zewnętrzną głowę i szyję płodu należy owinąć sterylną plastikową zasłoną, aby zminimalizować utratę temperatury i płynów.
- Oprzyrząduj tchawicę cewnikiem do pomiarów ciśnienia (Rysunek 1).
- W przypadku tchawicy bez tchawicy wykonaj kroki 2.3.3.2-2.3.3.3.
- Zaintubować płod jagniąt za pomocą 5 francuskich cewników ssących (1,67 mm ID) z wyjętym łącznikiem ssącym na głębokość 14 cm w kąciku ust jagnięcia.
- Podłącz zewnętrzny koniec cewnika za pomocą złącza 1.59 mm (średnica zewnętrzna, średnica zewnętrzna) do 3.18 mm (OD) do rurki silikonowej 3.18 mm (ID) o długości 30 cm.
- W przypadku tchawicy z zamknięciem wykonaj kroki 2.3.3.5-2.3.3.6.
- Zaintubuj płod jagniąt za pomocą rurki intubacyjnej z mikromankietem 3,0 z łącznikiem usuniętym na głębokość 14 cm do kącika ust jagnięcia.
- Połącz zewnętrzny koniec cewnika za pomocą złącza 3.18 mm (OD) do 3.18 mm (OD) (OD) do 30 cm rurki silikonowej 3.18 mm (ID).
- Podłącz drugi koniec rurki silikonowej o długości 30 cm i średnicy wewnętrznej 3.18 mm (ID) do urządzenia do pomiaru ciśnienia za pomocą złącza 3.18 mm (OD) do 1.59 mm (OD) na urządzeniu do pomiaru ciśnienia.
- Zszyj cewnik w kąciku pyska i szyi jagnięciny (niewchłanialna żyłka nylonowa 4-0).
- Przymocuj urządzenie do pomiaru ciśnienia do skóry jagnięcej na klatce piersiowej (niewchłanialna żyłka nylonowa 4-0) (Rysunek 2).
- Zamknij nacięcia chirurgiczne płodu i owcy zgodnie z początkową operacją tworzenia przepukliny przeponowej (kroki 1,4-1,5).
- Urządzenie testowe
- Sprawdź, czy urządzenie przesyła sygnał19.
- Odzyskiwanie i monitorowanie owiec
- Odzyskaj owcę zgodnie z początkową operacją.
- Monitoruj owce codziennie aż do porodu.
- Podaj drugą dawkę medroksyprogesteronu (0,5 ml) domięśniowo w ~120 dniu ciąży.
- Podawać betametazon (5,7 mg) domięśniowo 48 godzin i 24 godziny przed cesarskim cięciem, aby przyspieszyć dojrzewanie płodu do opieki poporodowej.
- Dostawa jagnięciny
- W ~142 dniu ciąży (termin ~147-150 dni) premedykuj owce przez domięśniowe wstrzyknięcie acepromazyny (0,03 mg / kg) i morfiny (0,3 mg / kg).
- Indukować znieczulenie dożylnie tiopentalem (10-15 mg/kg), intubować owcę rurką dotchawiczą (rozmiar 8,5 mm) i utrzymywać znieczulenie izofluoranem przy odpowiednim monitorowaniu zgodnie z wcześniejszymi środkami znieczulającymi.
- Kontynuuj chirurgiczny poród płodu przez histerotomię, jak w poprzednich operacjach, z owcą w pozycji grzbietowej (kroki 1.1 - 2.2).
- Usuń urządzenie monitorujące. Wyczyść urządzenie wodą i 70% etanolem.
- Humanitarnie zabić owcę za pomocą dożylnego wstrzyknięcia 160 mg/kg roztworu pentobarbitonu sodu.
- Resuscytować i przewietrzyć jagnię przez 2-3 godziny, a następnie humanitarnie zabić (160 mg/kg roztworu pentobarbitonu sodu, wstrzyknięcie dożylne).
- dane
- Pobierz dane na laptopa i przeanalizuj19. Przefiltruj dane dotyczące ciśnienia za pomocą 6-godzinnego okna. Oblicz różnicę ciśnień między ciśnieniem owodniowym a ciśnieniem tchawicy.