W systemie kokultury zwojów korzenia grzbietowego i komórek Schwanna, mielinizacja obwodowego układu nerwowego może być badana. Model ten zapewnia eksperymentalne możliwości obserwacji i ilościowego określenia mielinizacji obwodowej oraz zbadania wpływu związków będących przedmiotem zainteresowania na osłonkę mielinową.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Proces mielinizacji jest niezbędny, aby umożliwić szybką i wystarczającą transdukcję sygnału w układzie nerwowym. W obwodowym układzie nerwowym neurony i komórki Schwanna angażują się w złożoną interakcję w celu kontrolowania mielinizacji aksonów. Zaburzenia tej interakcji i rozpad osłonki mielinowej są cechami charakterystycznymi neuropatii zapalnych i występują wtórnie w zaburzeniach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu przedstawiamy model kokultury eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego i komórek Schwanna, który rozwija solidną mielinizację aksonów obwodowych w celu zbadania procesu mielinizacji w obwodowym układzie nerwowym, zbadania interakcji akson-komórka Schwanna i oceny potencjalnego wpływu środków terapeutycznych na każdy typ komórki z osobna. Metodologicznie, gangliony korzenia grzbietowego zarodków szczurów (E13.5) zostały pobrane, oddzielone od otaczających ich tkanek i hodowane jako całe eksplantaty przez 3 dni. Komórki Schwanna wyizolowano od 3-tygodniowych dorosłych szczurów, a nerwy kulszowe zostały trawione enzymatycznie. Powstałe w ten sposób komórki Schwanna oczyszczono przez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie i hodowano w warunkach wzbogaconych w neuregulinę i forskolinę. Po 3 dniach hodowli eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego, 30 000 komórek Schwanna dodano do jednego eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego w pożywce zawierającej kwas askorbinowy. Pierwsze oznaki mielinizacji wykryto w 10 dniu kohodowli, poprzez rozproszone sygnały dla podstawowego białka mieliny w barwieniu immunocytochemicznym. Od 14 dnia formowały się osłonki mielinowe i rozmnażały się wzdłuż aksonów. Mielinizację można określić ilościowo za pomocą barwienia podstawowym białkiem mieliny jako stosunku obszaru mielinizacji do obszaru aksonu, aby uwzględnić różnice w gęstości aksonów. Model ten zapewnia eksperymentalne możliwości badania różnych aspektów mielinizacji obwodowej in vitro, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patologii i możliwych możliwości leczenia demielinizacji i neurodegeneracji w chorobach zapalnych i neurodegeneracyjnych obwodowego układu nerwowego.
Wprowadzenie
W obwodowym układzie nerwowym (PNS) szybka transdukcja informacji odbywa się za pośrednictwem aksonów owiniętych mieliną. Mielinizacja aksonów jest niezbędna, aby umożliwić szybką propagację impulsów elektrycznych, ponieważ prędkość przewodzenia włókien nerwowych koreluje ze średnicą aksonu i grubością mieliny1. Sygnalizacja czuciowa z obwodu do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) opiera się na aktywacji neuronów czuciowych pierwszego rzędu, które znajdują się w powiększeniach korzenia grzbietowego, zwanych zwojami korzenia grzbietowego (DRG). Do tworzenia i utrzymywania mieliny niezbędna jest ciągła komunikacja między aksonami a komórkami Schwa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich w sprawie opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Hodowla komórek Schwanna
- Powłoka do hodowli komórek Schwanna
- Pokryj szalki z kulturami komórkowymi w sterylnych warunkach. Nałożyć 2 ml 0,01% poli-L-lizyny (PLL) na dwie szalki do hodowli tkankowych (TC) o średnicy 60 mm każda i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Usunąć PLL, umyć naczynia TC 2x wodą destylowaną i inkubować z 2 ml 1 μg/cm2 lamininy przez noc w temperaturze 4 °C. Umyć naczynia TC 2x aqua dest i pozostawić płytk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Mielinizację w kokulturze oceniano w dniach 10, 12, 14, 16, 18 i 20. Eksplanty DRG oraz komórki Schwanna barwiono na MBP, βIII-tubulinę i DAPI. Sieć aksonalna w kokulturze była gęsta i nie ulegała widocznym zmianom w czasie obserwacji. Pierwsze oznaki mieliny w postaci małych fragmentów były wykrywalne w 10. dniu i zwiększyły się w 12. dniu (Rysunek 2). Obszary MBP-dodatnie zwiększały się z czasem aż do 20. dnia hodowli. Mielinizację ilościowano jako stosunek obszarów MBP-dodatnich do obszar.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy szybki i łatwy protokół generowania mielinizacji in vitro poprzez połączenie dwóch oddzielnych kultur typu komórkowego, komórek Schwanna i eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego.
Krytycznym etapem protokołu jest uprawa eksplantatów DRG, zwłaszcza w pierwszych dniach hodowli. DRG są bardzo delikatne przed zbudowaniem silnej sieci aksonalnej i muszą być traktowane bardzo ostrożnie, na przykład po wyjęciu z inkubatora lub podczas zmiany podłoża. DRG, które .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Prof. Dr. Ralfowi Goldowi i PD Dr. Gisie Ellrichmann za ich rady i wsparcie.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Anty-MBP, królik | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anty-ß III-tubulina, mysz | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Kwas askorbinowy | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | A4403-100MG | |
| B27-suplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | 17504-044 | |
| Końcówka filtra biosfery, 100 &mikro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Końcówka filtra biosfery, 1250 i mikro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Końcówka filtra biosfery, 20 i mikro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Końcówka filtra biosfery, 300 i mikro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Albumina surowicy bydlęcej | Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy | 8076.4 | |
| Sitko do komórek, 100 &mikro; M | BD Bioscience, Heidelberg, Niemcy | 352360 | |
| Wirówka 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy | 5811000015 | |
| Inkubator CO2 Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Niemcy | ||
| Szkiełka nakrywkowe 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy | P231.1 | |
| Zakrzywione kleszcze drobnoziarniste | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Niemcy | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | ||
| Woda destylowana (system oczyszczania wody) | Millipore, Molsheim, Francja | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | ||
| DPBS (bez Ca2+ i bez Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | D8537-6X500ML | |
| Etanol | VWR, Radnor, Stany Zjednoczone | ||
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | F7524 | FCS musi być przetestowany pod kątem hodowli komórek Schwanna |
| Drobne kleszcze (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 11252-20 | |
| Kleszcze | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | G1393-20ML | |
| Gentamycyna | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | 5710064 | |
| Kozia anty-mysia IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | A11036 | |
| Kozia anty-królicza IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | A11001 | |
| HBSS (bez Ca2+ i bez Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | ||
| Inkubator HERAcell | Heraeus Instruments, Hanau, Niemcy | ||
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | ||
| Surowica dla koni | Pan-Biotech, Aidenbach, Niemcy | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | L2020-1MG | |
| Leibovitz´ s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | ||
| L-Glutamina 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | ||
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 15000-08 | |
| Mikroskop | Motic, Wetzlar, Niemcy | Motic BA 400 | |
| Mikroskop Obserwator Axio 7 | Zeiss, Oberkochen, Niemcy | 491917-0001-000 | |
| Szkiełko mikroskopowe | VWR, Radnor, Stany Zjednoczone | 630-1985 | |
| Separator MiniMACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130091632 | |
| kolumny MS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130-042-201 | |
| Komora licząca Neubauer | Asystent, Erlangen, Niemcy | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Podłoże neurobazalne | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | ||
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | N1408 | |
| Normalna surowica kozia | Biozol, Eching, Niemcy | S-1000 | |
| Nunclon & Delta; multidish, 4 | dołki Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | D6789 | |
| Paraformaldehyd | Acros Organics, New Jersey, Stany Zjednoczone | ||
| Penicylina/Streptomycyna | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy | 4430000018 | |
| Pipety | Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | P4707-50ML | |
| Probówki reakcyjne, 15 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Probówki reakcyjne, 50 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Naczynia reakcyjne, 1,5 ml | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| 72690001 Szafa bezpieczeństwa S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | ||
| Nożyczki | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 14083-08 | |
| Pipeta serologiczna, 10 ml | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Pipeta serologiczna, 25 ml | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Pipeta serologiczna, 5 ml | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Niemcy | Numer telefonu 495015-0012-000 | |
| Nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 14007-14 | |
| TC dish 100, komórka + | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| szalka TC 35, komórka + | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| szalka TC 60, komórka + | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | ||
| Mikrogranulki Thy-1 (zestaw MACS) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | X100-500ML | |
| Roztwór błękitu trypanowego 0,4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | ||
| Trypsyna (2,5%), bez czerwieni fenolowej | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | 15090-046 | |
| Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy | 25300-054 | |
| Typ I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy | C1639 | |
| Łaźnia wodna typ 1008 | GFL, Burgwedel, Niemcy | Numer katalogowy: 4285 |
Bibliografia
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
