Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64768

⸱

10 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Ruhr-University Bochum, St. Josef Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

W systemie kokultury zwojów korzenia grzbietowego i komórek Schwanna, mielinizacja obwodowego układu nerwowego może być badana. Model ten zapewnia eksperymentalne możliwości obserwacji i ilościowego określenia mielinizacji obwodowej oraz zbadania wpływu związków będących przedmiotem zainteresowania na osłonkę mielinową.

Streszczenie

Proces mielinizacji jest niezbędny, aby umożliwić szybką i wystarczającą transdukcję sygnału w układzie nerwowym. W obwodowym układzie nerwowym neurony i komórki Schwanna angażują się w złożoną interakcję w celu kontrolowania mielinizacji aksonów. Zaburzenia tej interakcji i rozpad osłonki mielinowej są cechami charakterystycznymi neuropatii zapalnych i występują wtórnie w zaburzeniach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu przedstawiamy model kokultury eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego i komórek Schwanna, który rozwija solidną mielinizację aksonów obwodowych w celu zbadania procesu mielinizacji w obwodowym układzie nerwowym, zbadania interakcji akson-komórka Schwanna i oceny potencjalnego wpływu środków terapeutycznych na każdy typ komórki z osobna. Metodologicznie, gangliony korzenia grzbietowego zarodków szczurów (E13.5) zostały pobrane, oddzielone od otaczających ich tkanek i hodowane jako całe eksplantaty przez 3 dni. Komórki Schwanna wyizolowano od 3-tygodniowych dorosłych szczurów, a nerwy kulszowe zostały trawione enzymatycznie. Powstałe w ten sposób komórki Schwanna oczyszczono przez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie i hodowano w warunkach wzbogaconych w neuregulinę i forskolinę. Po 3 dniach hodowli eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego, 30 000 komórek Schwanna dodano do jednego eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego w pożywce zawierającej kwas askorbinowy. Pierwsze oznaki mielinizacji wykryto w 10 dniu kohodowli, poprzez rozproszone sygnały dla podstawowego białka mieliny w barwieniu immunocytochemicznym. Od 14 dnia formowały się osłonki mielinowe i rozmnażały się wzdłuż aksonów. Mielinizację można określić ilościowo za pomocą barwienia podstawowym białkiem mieliny jako stosunku obszaru mielinizacji do obszaru aksonu, aby uwzględnić różnice w gęstości aksonów. Model ten zapewnia eksperymentalne możliwości badania różnych aspektów mielinizacji obwodowej in vitro, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patologii i możliwych możliwości leczenia demielinizacji i neurodegeneracji w chorobach zapalnych i neurodegeneracyjnych obwodowego układu nerwowego.

Wprowadzenie

W obwodowym układzie nerwowym (PNS) szybka transdukcja informacji odbywa się za pośrednictwem aksonów owiniętych mieliną. Mielinizacja aksonów jest niezbędna, aby umożliwić szybką propagację impulsów elektrycznych, ponieważ prędkość przewodzenia włókien nerwowych koreluje ze średnicą aksonu i grubością mieliny1. Sygnalizacja czuciowa z obwodu do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) opiera się na aktywacji neuronów czuciowych pierwszego rzędu, które znajdują się w powiększeniach korzenia grzbietowego, zwanych zwojami korzenia grzbietowego (DRG). Do tworzenia i utrzymywania mieliny niezbędna jest ciągła komunikacja między aksonami a komórkami Schwanna, które są mielinizującymi komórkami glejowymi w PNS2.

Wiele chorób PNS zakłóca transdukcję informacji poprzez pierwotne uszkodzenie aksonalne lub demielinizacyjne, co prowadzi do hiestezji lub dysestezji. Neurony czuciowe pierwszego rzędu mają zdolność do regeneracji do pewnego stopnia po uszkodzeniu neuronów, poprzez złożoną interakcję między neuronem a otaczającymi komórkami Schwanna3. W tym przypadku komórki Schwanna mogą przejść przeprogramowanie komórkowe w celu usunięcia resztek aksonalnych i mielinowych oraz promowania regeneracji aksonów, co skutkuje remielinizacją4. Zrozumienie mechanizmów mielinizacji w zdrowiu i chorobie jest ważne, aby znaleźć możliwe opcje leczenia zaburzeń demielinizacyjnych PNS. Mielina może być również uszkodzona przez ostry uraz neurologiczny, a podejścia do promowania mielinizacji w celu przyspieszenia funkcjonalnego powrotu do zdrowia po uszkodzeniu nerwów obwodowych są badane5.

Nasza wiedza na temat mielinizacji obwodowej skorzystała głównie z mielinizujących się kokultur komórek Schwanna i neuronów czuciowych. Od czasu zastosowania pierwszych podejść6,7,8, mielinizacja była intensywnie badana przy użyciu różnych systemów kokulturowych9,10,11. W tym miejscu zapewniamy szybki i łatwy protokół do solidnej mielinizacji in vitro aksonów zwoju korzenia grzbietowego. Protokół przygotowania komórek Schwanna jest oparty na protokole Andersena i wsp.12, wcześniej opublikowanym w Pitarokoili et al.13. Do kokultury używamy komórek Schwanna pochodzących od młodych szczurów i embrionalnych kultur eksplantatów DRG, w których mielinizacja następuje około 14 dnia. Celem metody jest dostarczenie systemu do badania powstawania mieliny w wyniku bezpośredniej interakcji akson-komórka Schwanna oraz zbadanie modulatorów mielinizacji PNS. W porównaniu ze zdysocjowanymi hodowlami komórek neuronalnych, eksplantaty DRG są bardziej zachowane anatomicznie i tworzą długie wyrostki aksonalne. Kwantyfikacja obszaru zmielinizowanego aksonu zapewnia wystarczający odczyt dla mielinizacji w kokulturze. Metoda ta jest cennym narzędziem do badań przesiewowych związków terapeutycznych pod kątem ich potencjalnego wpływu na mielinizację PNS, a także może być stosowana jako dodatek do badań in vivo na modelach zwierzęcych14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich w sprawie opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Hodowla komórek Schwanna

  1. Powłoka do hodowli komórek Schwanna
    1. Pokryj szalki z kulturami komórkowymi w sterylnych warunkach. Nałożyć 2 ml 0,01% poli-L-lizyny (PLL) na dwie szalki do hodowli tkankowych (TC) o średnicy 60 mm każda i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Usunąć PLL, umyć naczynia TC 2x wodą destylowaną i inkubować z 2 ml 1 μg/cm2 lamininy przez noc w temperaturze 4 °C. Umyć naczynia TC 2x aqua dest i pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu.
  2. Preparat do hodowli komórek Schwanna
    1. Przygotuj 50 ml pożywki z komórek Schwanna, dodając 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 μM forskoliny, 10 nM neureguliny i 50 μg/ml gentamycyny do zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle′s Medium (DMEM)/F-12 (wysoka glukoza) w sterylnych warunkach.
    2. Przygotować 70 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz z 50 μg/ml gentamycyny w sterylnych warunkach.
  3. Preparat nerwu kulszowego
    UWAGA: Wszystkie etapy przygotowania nerwu kulszowego są wykonywane pod czystą ławką.
    1. Przygotuj jedno naczynie TC o średnicy 100 mm z 5 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco bez Ca2+ i Mg2+, jedno naczynie TC o średnicy 100 mm z 5 ml lodowatego podłoża L-15 firmy Leibovitz i jedno naczynie TC o średnicy 100 mm z 5 ml lodowatej pożywki L-15 firmy Leibovitz i 50 μg/ml gentamycyny.
    2. Oczyść wszystkie narzędzia przez autoklawowanie. Spryskaj instrumenty i obszar roboczy 70% etanolem.
    3. Poddaj eutanazji pięć 3-tygodniowych samców szczurów Sprague Dawley za pomocą inhalacji CO2 i dekapitacji. Spryskaj tułów szczura 70% etanolem.
    4. Otwórz nożyczkami grzbietową dolną kończynę lewą i ostrożnie usuń mięsień dwugłowy uda. Rozluźnij nerw kulszowy poprzez płynne uniesienie za pomocą zakrzywionych kleszczy, upewniając się, że nie posiniaczysz nerwu.
    5. Przytrzymaj najbardziej proksymalną część nerwu zakrzywionymi kleszczami, aby wyprostować nerw i przyciąć nerw tak wysoko, jak to możliwe za pomocą nożyczek. Następnie przytnij nerw blisko splotu krzyżowego i łapy nożyczkami. Powtórz kroki 1.3.4-1.3.5 dla prawej strony.
      UWAGA: Podczas otwierania kończyny należy uważać, aby nie posiniaczyć żadnych naczyń krwionośnych.
    6. Za pomocą kleszczy umieść lewy i prawy nerw kulszowy w naczyniu TC o średnicy 100 mm z lodowatym DPBS.
  4. Odbudowa nerwu kulszowego
    1. Za pomocą kleszczy przenieś wszystkie nerwy do naczynia TC o średnicy 100 mm z lodowatą pożywką L-15 firmy Leibovitz i 50 μg/ml gentamycyny. Kontynuuj korzystanie z mikroskopu stereoskopowego i usuń tłuszcz, mięśnie i naczynia krwionośne z nerwów za pomocą dwóch par cienkich kleszczy. Chwyć nerwy kleszczami i przenieś je do 100-milimetrowej płytki TC z lodowatym podłożem L-15 firmy Leibovitz.
    2. Zidentyfikuj bliższe i dystalne końce nerwu kulszowego. Usuń epineurium za pomocą jednej pary cienkich kleszczy w kierunku od bliższego do dalszego, jednocześnie przytrzymując proksymalny koniec nerwu drugą parą cienkich kleszczyków.
    3. Przenieś oczyszczone nerwy do naczynia TC o średnicy 100 mm z lodowatym podłożem L-15 firmy Leibovitz i 50 μg/ml gentamycyny. Drażnij izolowane pęczki nerwowe, aby oddzielić i wyizolować pojedyncze włókna nerwowe za pomocą dwóch par cienkich kleszczy.
    4. Przenieść włókna nerwowe do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i pobrać jak najmniej pożywki. Dodać 50 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz z 50 μg/ml gentamycyny do włókien nerwowych i kilkakrotnie ubić w probówce o pojemności 50 ml.
  5. Trawienie enzymatyczne nerwu kulszowego
    UWAGA: Kolejne kroki (kroki 1.5-1.8, 2.1 i 2.2) są wykonywane w sterylnych warunkach.
    1. Przygotować enzymatyczny roztwór wytrawiający zawierający 0,25% dyspazy II, 0,05% kolagenazy typu I i 50 μg/ml gentamycyny w 10 ml DMEM (wysoka glukoza).
    2. Odwirować probówkę o stężeniu 188 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i przenieść osad z pozostałą pożywką L-15 Leibovitza do naczynia TC o średnicy 60 mm za pomocą pipety o pojemności 1 000 ml.
    3. Przepłukać probówkę o pojemności 50 ml 10 ml roztworu do trawienia enzymatycznego i dodać go do naczynia zawierającego włókna nerwowe. Ostrożnie rozprowadź tkankę w naczyniu końcówką pipety, aby zmaksymalizować dostępną powierzchnię do trawienia.
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 18 godzin i zatrzymać trawienie, dodając 10 ml 40% FCS do zbilansowanego roztworu soli Hanksa, bez Ca2 i Mg2+ (HBSS).
  6. Separacja komórek
    1. Przenieść strawione nerwy do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej i odwirować przy 188 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM zawierającym 10% FCS i 50 μg/ml gentamycyny. Zawiesić osad 20 razy, używając końcówki do pipety o pojemności 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml i 200 μl.
    2. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 100 μm i odwirować przy 188 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 4 ml DMEM zawierającego 10% FCS i 50 μg/ml gentamycyny.
    3. Dodać 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch płytek TC o średnicy 60 mm pokrytych PLL i lamininą i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Płytki należy pozostawić nietknięte przez 2 dni w inkubatorze, aby chronić komórki przed naprężeniami mechanicznymi i wspomóc przyleganie.
  7. Różnicowanie komórek Schwanna
    1. Po 2 dniach usuń pożywkę i ostrożnie spłucz płytki 2x DMEM (wysoka glukoza), 10% FCS i 50 μg/ml gentamycyny. Następnie dodaj 2 ml pożywki z komórek Schwanna. Wymieniaj pożywkę z komórkami Schwanna co 2dni i obserwuj wygląd i zbieżność komórek za pomocą mikroskopu.
      UWAGA: Komórki Schwanna i eksplantaty DRG muszą być przygotowane w sposób terminowy i skoordynowany dla kokultury. Upewnij się, że szczur z zarodkami w E 13,5 jest dostępny do przygotowania DRG, gdy komórki Schwanna są bliskie zbiegu 80%.
  8. Trypsyna komórek i separacja magnetyczna
    UWAGA: Przykładowe zdjęcia różnych etapów hodowli komórek Schwanna znajdują się na rysunku uzupełniającym 1.
    1. Gdy komórki osiągną zbieżność około 80% (6-12 dni hodowli), ostrożnie umyj płytki 2x 3 ml DPBS i inkubuj z 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA (wstępnie podgrzanej do 37 °C) przez 3 min. Gdy komórki oderwą się od dna płytki, dezaktywuj trawienie przez dodanie 2 ml DMEM z 10% FCS i 50 μg/ml gentamycyny.
      UWAGA: Trzymaj się czasu trypsynizacji wynoszącego ściśle 3 minuty, a następnie postępuj szybko.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu do magnetycznej separacji komórek zawierającego DPBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 2 nM EDTA. Połączyć 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego i policzyć komórki za pomocą komory barwiącej.
    3. Odwirować zawiesinę komórek o sile 188 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórkowy w 90 μl buforu do magnetycznego rozdzielania komórek na 1 x10 7 komórek. Dodać 10 μl mikrogranulek Thy-1 na 1 x 107 komórek. Zawiesić roztwór kilka razy i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 8 °C.
    4. Dodać 2 ml buforu do magnetycznego rozdzielania komórek do zawiesiny komórek i wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do magnetycznego rozdzielania komórek.
    5. Zwilżyć magnetyczną kolumnę do separacji komórek 1 ml buforu do rozdzielania komórek magnetycznych. Umieść kolumnę separacji komórek magnetycznych w separatorze magnetycznym. Zastosuj komórki do kolumny magnetycznej separacji komórek. Zebrać przepływ i odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
      UWAGA: Fibroblasty są wybierane pozytywnie i pozostają w kolumnie, podczas gdy komórki Schwanna przechodzą przez kolumnę. Fibroblasty mogą być zbierane za pomocą stempla (np. jako kontrola negatywna dla protokołów barwienia komórek Schwanna).
    6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki do kokultury (patrz krok 3.1.1). Policz komórki po zabarwieniu błękitem trypanowym i komorą barwiącą.

2. Hodowla eksplantatów DRG

  1. Przygotowanie podłoża wzrostowego DRG
    1. Przygotuj pożywkę wzrostową DRG, dodając 2% witaminy B27, 2% surowicy końskiej, 1% L-glutaminy, 0,5% penicyliny/streptomycyny i 10 ng/ml czynnika wzrostu nerwów (NGF) do podłoża neurobazalnego. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Pożywkę można stosować przez 2 dni.
  2. Powłoka do eksplantatów DRG
    1. Inkubować szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu przez 1 godzinę i umieścić w dołkach 4-dołkowych szalek za pomocą zakrzywionych kleszczyków. Po wyschnięciu etanolu nanieść 300 μl 0,2 mg/ml poli-D-lizyny (PDL) na studzienkę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Szkiełka nakrywkowe należy myć kolejno 3 razy po 5 minut za pomocą DPBS. Zdjąć DPBS, nanieść 300 μl 1 μg/ml lamininy na szkiełka nakrywkowe i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Po trzech etapach mycia DPBS przez 5 minut, zastąp DPBS 190 μl pożywki wzrostowej DRG. Umieścić 4-dołkowe płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Przygotowanie DRG
    UWAGA: Zbierz DRG embrionalnych szczurów pod czystą ławką.
    1. Przed przygotowaniem wyczyść wszystkie narzędzia 70% etanolem. Napełnij 10 (dwie na zarodek) szalek TC o średnicy 35 mm 2 ml lodowatego HBSS na miskę, a dwie szalki TC o średnicy 100 mm 5 ml lodowatego HBSS na miskę.
    2. Eutanazja ciężarnych szczurów (dorosłe samice szczurów Sprague Dawley, E13.5) poprzez wdychanie CO2 i dekapitację.
    3. Spryskaj ciało 70% etanolem i otwórz brzuszną część tułowia szczura. Ostrożnie wyjmij macicę i umieść ją w naczyniu TC o średnicy 100 mm z lodowatym HBSS.
    4. Przytrzymaj macicę za pomocą zakrzywionych kleszczy i otwórz ścianę macicy cienkimi kleszkami. Usuń jeden worek owodniowy i otwórz go ostrożnie, ściskając otwór drobnymi kleszkami.
    5. Usuń zarodek z otaczających tkanek, przetnij pępowinę i odetnij zarodek za pomocą cienkich kleszczy. Umieść tułów w naczyniu TC o średnicy 100 mm wypełnionym HBSS za pomocą zakrzywionych kleszczyków i szpatułki.
    6. Szybko usuń wszystkie zarodki z macicy i przenieś je do jednej 100-milimetrowej płytki TC wypełnionej HBSS. Jeśli jest więcej niż pięć zarodków, należy przygotować dodatkowe naczynie TC o średnicy 35 mm z 2 ml HBSS, zgodnie z krokiem 2.3.1.
    7. Delikatnie umieść tułów zarodka w naczyniu TC o średnicy 35 mm wypełnionym HBSS za pomocą szpatułki i zakrzywionych kleszczyków. Pod mikroskopem stereoskopowym otwórz grzbietową część tułowia, aby podzielić zarodek na dwie połówki za pomocą cienkich kleszczyków i mikronożyczek. Obróć jedną połowę na bok i zidentyfikuj pasmo DRG znajdujące się w linii w grzbietowej części zarodka.
    8. Wytnij DRG jako całe pasmo za pomocą cienkich kleszczy i mikronożyczek. Umieść DRG w świeżym naczyniu TC o średnicy 35 mm wypełnionym 2 ml HBSS i oddziel pojedynczy DRG od pozostałej tkanki za pomocą cienkich kleszczyków i mikronożyczek.
  4. Hodowla komórkowa DRG
    1. Pobrać 4-dołkowe płytki zawierające 190 μl pożywki wzrostowej DRG z inkubatora do czystej ławki, na której ma być przygotowany DRG. Ostrożnie przenieś pojedynczy DRG do jednego dołka 4-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą cienkich kleszczyków i szpatułki. Umieść DRG na środku każdej studzienki, ponieważ centralna pozycja jest ważna dla zamocowania DRG.
    2. Od teraz pracuj w sterylnych warunkach. Umieścić kultury eksplantatów w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Następnego dnia ostrożnie dodaj 50 μl pożywki wzrostowej DRG do każdego dołka za pomocą pipety o pojemności 100 ml.
    3. Codziennie obserwuj przyleganie eksplantatu DRG i wzrost aksonów za pomocą mikroskopu i wyrzucaj eksplantaty DRG, które oderwały się od szkiełka nakrywkowego lub nie wyrosły z aksonów w 3 dniu hodowli.
      UWAGA: Eksplantaty DRG są bardzo delikatne w pierwszych dniach hodowli i należy obchodzić się z nimi ostrożnie, zwłaszcza podczas wkładania i wyjmowania płytek z inkubatora po zmianie podłoża, a nawet podczas zamykania drzwi inkubatora. Dokładna objętość 190 μl podłoża na studzienkę ma kluczowe znaczenie dla utrzymania eksplantatów DRG na miejscu podczas pierwszego dnia hodowli. Luźne eksplantaty DRG można łatwo zidentyfikować podczas codziennej kontroli, ponieważ pływają w podłożu zamiast przylegać do szkiełka nakrywkowego.

3. Kultura

  1. Przeniesienie komórek Schwanna do hodowli eksplantatów DRG
    1. Przygotować pożywkę do kokultury, dodając 0,1% kwasu askorbinowego do pożywki wzrostowej DRG.
    2. W 3 dniu hodowli eksplantatów DRG ostrożnie zastąp pożywkę wzrostową DRG 250 μl pożywki kokulturowej zawierającej 30 000 komórek Schwanna (od etapu 1.8) na studzienkę.
    3. Kokulturę eksplantatów DRG i komórek Schwanna należy przechowywać przez okres do 22 dni. Wymieniać ostrożnie 250 μl pożywki do kokultury co drugi dzień i obserwować wygląd komórek pod mikroskopem.
      UWAGA: Przykład aksonów DRG i komórek Schwanna w kokulturze w pierwszych dniach hodowli znajduje się w Rysunek 1.
  2. Barwienie immunocytochemiczne
    UWAGA: Podczas barwienia należy obchodzić się z próbkami kokultury bardzo ostrożnie, ponieważ mogą one łatwo ulec uszkodzeniu.
    1. Aby utrwalić komórki na szkiełkach nakrywkowych, należy powoli usunąć podłoże, dokładnie przemyć 3x DPBS i inkubować w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 10 minut. Zastąp PFA DPBS i przechowuj utrwalone komórki w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z 4% PFA należy nosić zalecane środki ochrony osobistej.
    2. Przemyj szkiełka nakrywkowe 3x DPBS przez 5 minut, a następnie zablokuj roztworem blokującym (10% surowicy koziej, 10% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 0,1% żelatyny i 0,05% Triton X-100) w DPBS przez 1 godzinę. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała βIII-tubulinę (1:7,500) i podstawowe białko mielinowe (MBP) (1:750) w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Przemyj komórki 3x DPBS przez 5 minut. Użyj fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z barwnikiem w rozcieńczeniu 1:1,000 w roztworze blokującym i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Przemyj komórki 3x DPBS przez 5 minut i zamontuj komórki na szkiełkach mikroskopowych z fluorescencyjnym podłożem montażowym, w tym 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania dokumentacji mikroskopowej.
      UWAGA: Podczas pracy z fluorescencyjnym medium montażowym należy nosić zalecane środki ochrony osobistej.
  3. analiza
    1. Zrób zdjęcia ośmiu zdefiniowanych obszarów otaczających eksplantat DRG w środku, używając odwróconego mikroskopu.
    2. Użyj aplikacji do analizy obrazu, aby określić ilościowo obszary dodatnich aksonów βIII-tubuliny i mielinizacji wybarwionych MBP.
    3. Oblicz procent mielinizacji jako stosunek aksonów zmielinizowanych i niezmielinizowanych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mielinizację w kokulturze oceniano w dniach 10, 12, 14, 16, 18 i 20. Eksplanty DRG oraz komórki Schwanna barwiono na MBP, βIII-tubulinę i DAPI. Sieć aksonalna w kokulturze była gęsta i nie ulegała widocznym zmianom w czasie obserwacji. Pierwsze oznaki mieliny w postaci małych fragmentów były wykrywalne w 10. dniu i zwiększyły się w 12. dniu (Rysunek 2). Obszary MBP-dodatnie zwiększały się z czasem aż do 20. dnia hodowli. Mielinizację ilościowano jako stosunek obszarów MBP-dodatnich do obszar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy szybki i łatwy protokół generowania mielinizacji in vitro poprzez połączenie dwóch oddzielnych kultur typu komórkowego, komórek Schwanna i eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego.

Krytycznym etapem protokołu jest uprawa eksplantatów DRG, zwłaszcza w pierwszych dniach hodowli. DRG są bardzo delikatne przed zbudowaniem silnej sieci aksonalnej i muszą być traktowane bardzo ostrożnie, na przykład po wyjęciu z inkubatora lub podczas zmiany podłoża. DRG, które ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Prof. Dr. Ralfowi Goldowi i PD Dr. Gisie Ellrichmann za ich rady i wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-MBP, królikNovus Biologicals, Centannial, USAABIN446360
Anty-ß III-tubulina, mysz Biolegend, San Diego, USA657402
Kwas askorbinowy Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy A4403-100MG
B27-suplementThermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 17504-044
Końcówka filtra biosfery, 100 &mikro; LSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
Końcówka filtra biosfery, 1250 i mikro; LSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
Końcówka filtra biosfery, 20 i mikro; LSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
Końcówka filtra biosfery, 300 i mikro; LSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
Albumina surowicy bydlęcejCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy 8076.4
Sitko do komórek, 100 &mikro; MBD Bioscience, Heidelberg, Niemcy352360
Wirówka 5810-REppendorf AG, Hamburg, Niemcy5811000015
Inkubator CO2 HeracellHeraeus Instruments, Hanau, Niemcy 
Szkiełka nakrywkowe 12 mmCarl Roth, Karlsruhe, Niemcy P231.1
Zakrzywione kleszcze drobnoziarniste Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy11370-42
DAPI fluoromount-G(R)Biozol, Eching, NiemcySBA-0100-20
Dispase IISigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy 
Woda destylowana (system oczyszczania wody) Millipore, Molsheim, FrancjaZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAXThermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 
DPBS (bez Ca2+ i bez Mg2+)Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy D8537-6X500ML
Etanol VWR, Radnor, Stany Zjednoczone 
FCSSigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy F7524FCS musi być przetestowany pod kątem hodowli komórek Schwanna
Drobne kleszcze (Dumont #5)Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy11252-20
KleszczeFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy11370-40
ForskolinSigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy F6886-10MG
GelatinSigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy G1393-20ML
GentamycynaThermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy5710064
Kozia anty-mysia IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy A11036
Kozia anty-królicza IgG Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy A11001
HBSS (bez Ca2+ i bez Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 
Inkubator HERAcellHeraeus Instruments, Hanau, Niemcy 
Heraguard ECO 1.2Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 
Surowica dla koniPan-Biotech, Aidenbach, NiemcyP30-0712
Image J SoftwareHIH, Bethesda, USA
LamininSigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy L2020-1MG
Leibovitz´ s L-15 MediumThermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 
L-Glutamina 200 mM Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 
MACS Multistand Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy130042303
MicroscissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy15000-08
Mikroskop Motic, Wetzlar, NiemcyMotic BA 400
Mikroskop Obserwator Axio 7Zeiss, Oberkochen, Niemcy 491917-0001-000
Szkiełko mikroskopoweVWR, Radnor, Stany Zjednoczone 630-1985
Separator MiniMACSMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy130091632
kolumny MSMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy130-042-201
Komora licząca Neubauer Asystent, Erlangen, Niemcy40441  
NeuregulinPeprotech, Rocky Hill, USA100-03
Podłoże neurobazalne Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 
NGFSigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy N1408
Normalna surowica koziaBiozol, Eching, NiemcyS-1000
Nunclon & Delta; multidish, 4dołki Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy D6789
ParaformaldehydAcros Organics, New Jersey, Stany Zjednoczone 
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 15140-122
PipetboyEppendorf AG, Hamburg, Niemcy4430000018 
PipetyEppendorf AG, Hamburg, Niemcy2231300004
Poly-D-LysinSigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy P6407-5MG
Poly-L-LysinSigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy P4707-50ML
Probówki reakcyjne, 15  mLSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
Probówki reakcyjne, 50  mLSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
Naczynia reakcyjne, 1,5 mlSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
72690001 Szafa bezpieczeństwa S2020 1.8Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 
NożyczkiFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy14083-08
Pipeta serologiczna, 10 mlSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
Pipeta serologiczna, 25 mlSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
Pipeta serologiczna, 5 mlSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
SpatulaFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8Zeiss, Oberkochen, Niemcy Numer telefonu 495015-0012-000 
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy14007-14
TC dish 100, komórka +Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
szalka TC 35, komórka +Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
szalka TC 60, komórka +Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy 
Mikrogranulki Thy-1 (zestaw MACS)Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy130-094-523
Triton X-100 Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy X100-500ML
Roztwór błękitu trypanowego 0,4% Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 
Trypsyna (2,5%), bez czerwieni fenolowejThermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 15090-046
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy 25300-054
Typ I CollagenaseSigma Aldrich GmbH, Steinheim, Niemcy C1639
Łaźnia wodna typ 1008GFL, Burgwedel, Niemcy Numer katalogowy: 4285
70760212701186210701114210707652105101786549420780013133109310098625001417013851017865510298821141506425030024211030491034224362554502625472545102664086125402586168500186125300183390230083390030083390130015250061

Bibliografia

  1. Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
  2. Taveggia, C. Schwann cells-axon interaction in myelination. Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).
  3. Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652(2020).
  4. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
  5. Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
  6. Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
  7. Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
  8. Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
  9. Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
  10. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  11. Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
  12. Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781(2016).
  13. Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58(2019).
  14. Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145(2020).
  15. Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
  16. Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255(2016).
  17. Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
  18. Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model kokulturypodstawowe bia ko mielinybarwienie immunocytochemiczneanaliza ekspresji gen wmagnetyczna separacja kom rekinterakcja akson kom rka Schwanna
Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.