Artykuł metodologiczny

Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64777

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agronomy, Center for Plant Biology, Purdue University, 2Department of Biology, Purdue University, 3Department of Horticulture, Faculty of Agricultural Sciences, University of the Punjab, 4Department of Botany and Plant Pathology, Center for Plant Biology, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

Ze względu na jej wszechstronne zastosowanie jako gatunku modelowego w różnych dziedzinach nauki, istnieje potrzeba stworzenia zestawu narzędzi do transformacji genetycznej u babki lancetowatej (Plantago lanceolata). Tutaj, przy użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, przedstawiono protokół, w wyniku którego powstają stabilne linie transgeniczne o wydajności transformacji wynoszącej 20%.

Streszczenie

Gatunki z rodzaju Plantago mają kilka unikalnych cech, które doprowadziły do tego, że zostały zaadaptowane jako rośliny modelowe w różnych dziedzinach nauki. Jednak brak systemu manipulacji genetycznej uniemożliwia dogłębne badanie funkcji genów, co ogranicza wszechstronność tego rodzaju jako modelu. W tym miejscu przedstawiono protokół transformacji dla Plantago lanceolata, najczęściej badanego gatunku Plantago. Za pomocą transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, 3-tygodniowe korzenie asepcie uprawianych roślin P. lanceolata zostały zakażone bakteriami, inkubowane przez 2-3 dni, a następnie przeniesione na pożywkę indukcyjną pędów z odpowiednim doborem antybiotyków. Pędy zwykle wyłaniały się z podłoża po 1 miesiącu, a korzenie rozwijały się 1-4 tygodnie po przeniesieniu pędów do podłoża do indukcji korzeni. Rośliny zostały następnie zaaklimatyzowane w środowisku glebowym i przetestowane pod kątem obecności transgenu za pomocą testu reporterowego β-glukuronidazy (GUS). Wydajność transformacji obecnej metody wynosi ~20%, przy czym na 10 przekształconych tkanek korzeniowych pojawiają się dwie rośliny transgeniczne. Ustanowienie protokołu transformacji dla babki wąskolistnej ułatwi przyjęcie tej rośliny jako nowego gatunku modelowego na różnych obszarach.

Wprowadzenie

Koncepcja wykorzystania gatunków modelowych do badania wielu aspektów biologii roślin pojawiła się wraz z powszechnym zastosowaniem Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis został początkowo wybrany, ponieważ ma cechy wspólne z wieloma innymi roślinami kwitnącymi i ma wiele cech, które ułatwiają badanie w środowisku laboratoryjnym, takich jak mały rozmiar i krótki cykl pokoleniowy. Duża liczba opublikowanych prac naukowych z jego tematem, wraz z jego małym rozmiarem genomu i łatwością transformacji genetycznej2, pozwalają mu przetrwać jako szeroko stosowany organizm eksperymentalny. Jednak Arabidopsis może być ograniczony jako model dla gatunków o różnych cechach lub unikalnych cechach3. Skłoniło to do opracowania nowych systemów modelowych, takich jak kukurydza (Zea mays), ważna roślina dla genetyki rozwojowej w monocots4, oraz pomidor (Solanum lycopersicum), który jest ważnym modelem dla badań ewolucyjnych, rozwoju i produkcji owoców, a także jest dobrą reprezentacją dla upraw warzyw5. Metoda transformacji genetycznej jest warunkiem wstępnym, aby gatunek rośliny mógł służyć jako organizm modelowy2. Transformacja, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, jest niezawodnym narzędziem w biologii roślin; został wykorzystany do przekształcenia kilku gatunków modelowych i głównych upraw, w tym tytoniu (Nicotiana tabacum)6, ryżu (Oryza sativa)7, bawełny (Gossypium hirsutum)8, soi (Glycine max)9, ziemniaka (Solanum tuberosum)10 i rzepaku (Brassica napus)11. Gatunki roślin są bardzo zróżnicowane pod względem skuteczności reakcji na zakażenie A. tumefaciens, a protokoły transformacji często muszą być indywidualnie dostosowane do każdego gatunku6,12.

Rodzaj Plantago obejmuje łącznie 256 gatunków roślin, szeroko rozpowszechnionych na całym świecie13. Gatunki z tego rodzaju często mają unikalne cechy, które sprawiają, że są pożądane jako gatunki modelowe do badania genetyki, ekologii, fizjologii stresu, metabolitów wtórnych, chemii medycznej, interakcji roślina-mikroorganizm, rozwoju roślin i ewolucji. Babka lancetowata, zwana również babką wąskolistną lub babką lancetowatą, jest popularną rośliną od XIXwieku, kiedy to po raz pierwszy użyto jej do opisania zjawiska męskiej bezpłodności14. Podobnie jak inne rośliny z tego rodzaju, był używany w badaniach w różnych dziedzinach badawczych. Ostatnio został zaproponowany jako model dla biologii naczyniowej, ponieważ jego tkanka naczyniowa może być łatwo pobrana15. P. lanceolata jest najczęściej badanym gatunkiem z rodzaju Plantago; artykuł z 2021 r. informował, że w tym czasie było >1,400 publikacji zawierających lub związanych z tym gatunkiem16, a od początku 2022 r. opublikowano dodatkowe 102 artykuły, zgodnie z wyszukiwaniem PubMed przeprowadzonym 9grudnia 2022 r. Następna najczęściej badana roślina z rodzaju, P. major, jest tematem tylko 414 artykułów, gdy jest wyszukiwana przy użyciu tych samych kryteriów w tym samym dniu.

Pomimo zainteresowania badawczego P. lanceolata, badania, zwłaszcza nad charakterystyką funkcji genów, są często ograniczone przez brak zestawu narzędzi do manipulacji genetycznej dla tego gatunku. Pommerrienig et al. podjęli wysiłki w celu opracowania protokołu transformacji dla P. major przy użyciu techniki zanurzania kwiatów17. Jednak metoda ta nie może być zastosowana do P. lanceolata ze względu na męską bezpłodność charakterystyczną dla tego gatunku18,19. O ile nam wiadomo, nie istnieje żaden protokół transformacji P. lanceolata.

To badanie przedstawia prosty protokół transformacji P. lanceolata, w której pośredniczy A. tumefaciens. Celując w tkanki korzeniowe, w pełni rozwinięte rośliny transgeniczne mogą zostać wygenerowane w ciągu 3 miesięcy od transformacji.

Protokół

UWAGA: Kroki 1.4-1.8, 2.3-2.5, 3.3-3.6, 4.1-4.6, 5.1-5.7 i 6.1-6.3 muszą być wykonywane w warunkach aseptycznych, przy użyciu czystego kaptura, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

1. Rozmnażanie materiału roślinnego w celu transformacji

  1. Umieść dostępne w handlu nasiona babki lancetowatej typu dzikiego (WT) (patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml do linii 5 ml, w zależności od pożądanej liczby roślin.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml, gdy potrzebna jest niewielka liczba nasion, ale należy ją napełnić do objętości nie większej niż 0,1 ml, ponieważ zbyt duża liczba nasion może zmniejszyć skuteczność sterylizacji.
  2. Zanurz nasiona w 75% etanolu na 60 s.
  3. Wyrzuć etanol, a następnie zanurz nasiona w 20% podchlorynie sodu (20% NaClO, 80% sterylnej wody) na 40 minut, delikatnie odwracając probówkę, tak aby wszystkie nasiona miały kontakt z roztworem.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, roztwór podchlorynu sodu musi być świeżo przygotowany.
  4. Pod okapem z przepływem laminarnym wylej roztwór podchlorynu sodu, a następnie umyj nasiona wodą destylowaną (pięć razy). Dodaj niewielką ilość wody do nasion po ostatnim płukaniu, ponieważ może to pomóc w przemieszczaniu się roślin na talerze.
  5. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy przenieś nasiona na wstępnie przygotowane szalki Petriego o wymiarach 95 mm x 100 mm ze stałym podłożem MS (tabela 1). Rozłóż nasiona równomiernie na powierzchni płytki, zachowując około 1 cm odstępu między każdym nasionem, aby zapobiec przepełnieniu kiełkujących sadzonek (Rysunek 1A) .
  6. Uszczelnij płytki dwiema warstwami folii parafinowej, aby zapobiec zanieczyszczeniu, a następnie inkubuj w chłodnym białym świetle do uprawy (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej (22 °C przy 50 μmol m-2 s-1, 12 godzin dni). Nasiona kiełkują zwykle w ciągu 5-6 dni.
  7. Gdy sadzonki wykiełkują i są wystarczająco duże, aby je przenieść (Rysunek 1B), zwykle 2 lub 3 dni po wykiełkowaniu, użyj wysterylizowanych kleszczy, aby przenieść sadzonki do sterylnych pudełek z 50-100 ml pożywki MS (Tabela 1). Najlepiej sadzić tylko pięć sadzonek w pudełku, aby uzyskać korzenie najlepszej jakości.
  8. Uszczelnij pudełka taśmą chirurgiczną, a następnie pozwól roślinom rosnąć w chłodnym białym świetle (patrz Tabela Materiałów), w tych samych warunkach, jak w kroku 1.6. Rośliny powinny być gotowe do przemiany po około 3-4 tygodniach lub gdy główne korzenie osiągną około 2 cm długości, a korzenie boczne wydają się białe.
    UWAGA: Przepisy na preparaty podłoża i zapasy witamin znajdują się w Tabeli 1 i Tabeli 2.

2. Budowa plazmidu i transformacja E. Coli

UWAGA: Dokładna procedura budowy plazmidu różni się w zależności od interesującego genu. W tej procedurze enzymy restrykcyjne HindIII i SalII zostały użyte do wprowadzenia promotora 1,5 kb AtPP2 do binarnego plazmidu pBI101 (patrz tabela materiałów) z GUS, przy użyciu standardowej procedury klonowania20. AtPP2 (białko łyka 2) to gen, który ulega specyficznej ekspresji w łyku 21.

  1. Sklonuj promotor za pomocą par starterów 5'-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3' (do przodu) i 5'-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGATTATTTTTG-3' (do tyłu) z Arabidopsis. Rysunek 2 przedstawia schemat binarnego wektora plazmidu z insertem AtPP2:GUS.
  2. Po zbudowaniu plazmidu przekształć plazmidy w kompetentne komórki DH5a E. coli (patrz Tabela Materiałów) za pomocą metody szoku cieplnego22, a następnie inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (150 obr./min).
  3. Pobrać 150 μl każdej kultury transformacyjnej, rozłożyć ją na płytkach z pożywką agarową LB (Tabela 1) z odpowiednim doborem (50 mg/L kanamycyny dla szczepu użytego w tym protokole; patrz Tabela materiałów), a następnie inkubować płytki przez 16-24 godzin w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Szczep bakteryjny użyty w tym badaniu to A. tumefaciens GV3101.
  4. Następnie użyj PCR kolonii, aby przebadać kolonie pod kątem dodatnich rekombinantów23.
    UWAGA: W tym protokole do amplifikacji docelowego genu użyto następujących starterów; 5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3' (do przodu) i 5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCTGCC-3' (do tyłu).
    1. Przeprowadzić reakcję w termocyklerze (patrz tabela materiałów) w warunkach cyklicznych trwających 3 minuty w temperaturze 95 °C, a następnie 35 cykli: 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 55 °C, 2 minuty w temperaturze 72 °C i końcowy 10-minutowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C.
    2. Zaszczepić dodatnie kolonie w 6 ml bulionu LB (Tabela 1) odpowiednim antybiotykiem (50 mg/l kanamycyny) i rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc, przy 200-250 obr./min.
  5. Po całonocnym wzroście wyekstrahuj plazmidy z bakterii, stosując standardowe procedury24.

3. Transformacja A. tumefaciens z plazmidem

  1. Po ekstrakcji plazmidu użyj elektroporacji, aby przekształcić zmodyfikowany plazmid w pożądany szczep kompetentnych komórek. W zabiegu wykorzystano szczep A. tumefaciens GV3101. Postępuj zgodnie ze standardowymi metodami technik elektroporacji25.
  2. Po elektroporacji ponownie zawiesić właściwe komórki w 1 ml bulionu LB, a następnie inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze 28 °C przy 100 obr./min.
  3. Zebrać komórki przez wirowanie przy 6 800 x g przez 3 minuty w mikrowirówce stołowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej (22 °C), a następnie rozprowadzić 50-100 μl na płytce agarowej LB z odpowiednim środkiem selekcyjnym (50 mg/l kanamycyny dla plazmidu użytego w tym protokole).
  4. Po inkubacji komórek przez 2 dni w temperaturze 28 °C należy zidentyfikować dodatnie kolonie zawierające gen będący przedmiotem zainteresowania za pomocą PCR kolonii. W tym protokole należy użyć starterów i warunków wymienionych w kroku 2.4.
  5. Następnie użyj dodatnich kolonii, aby pokryć płytkę podstawową pożywką agarową LB + selekcja. Płytka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  6. Alternatywnie, w celu długotrwałego przechowywania, zaszczepić dodatnią kolonię niewielką objętością LB z odpowiednią selekcją. Wstrząsnąć zaszczepioną kulturą przez noc w temperaturze 28 °C przy 200 obr./min, a następnie przygotować wywar z glicerolem (50% w/v glicerolu w mieszance bakterii i glicerolu w proporcji 50:50), który może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do 10 lat.

4. Przygotowanie A. tumefaciens

  1. Smuga A. tumefaciens zawierająca pożądany plazmid na przygotowane płytki LB o wymiarach 95 mm x 100 mm z odpowiednim środkiem selekcyjnym. W protokole tym wykorzystano szczep bakteryjny GV3101 z wstawką plazmidową AtPP2:GUS, z dodatkiem 50 mg/L kanamycyny do selekcji.
  2. Uszczelnić płytki folią parafinową, a następnie inkubować w temperaturze 28 °C przez maksymalnie 48 godzin lub do momentu, gdy bakterie osiągną wystarczająco duże rozmiary, aby można je było zbierać.
  3. Użyj końcówki pipety, aby wybrać kolonię bakterii na 2 dni przed transformacją i zaszczepić ją w 15 ml okrągłej probówce zawierającej 6 ml płynnego LB z odpowiednim doborem. Wstrząsać z prędkością 200 obr./min w wytrząsarce stołowej o temperaturze 28 °C przez noc, aż OD600 osiągnie 0,6-0,7,
    UWAGA: Płytki i inokulację bakteryjną o pojemności 6 ml można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  4. Gdy bakterie osiągną prawidłowy OD600, użyj pipety, aby przenieść A. tumefaciens do sterylnej kolby zawierającej 100 ml płynnego LB ze środkiem selekcyjnym. Zazwyczaj do rozmnażania nadaje się 200 μl bakterii na 100 ml LB. Wstrząsać z prędkością 200 obr./min w temperaturze 28 °C przez noc, aż OD600 osiągnie 0,6-0,7.
  5. Przenieś bakterie do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i odwiruj przy 2 200 xg przez 10 minut w temperaturze pokojowej (22 °C) w wirówce stołowej w celu zebrania bakterii.
  6. Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić osad bakteryjny w 5 ml roztworu zawiesiny płynnej (SS) o temperaturze pokojowej (22 °C) (Tabela 1) przez pipetowanie, następnie dodać do 50 ml SS i kilkakrotnie odwrócić w celu wymieszania. Bakteria jest teraz gotowa do transformacji.
    UWAGA: Płynny SS musi być przygotowany na świeżo, w ciągu 1 tygodnia od przemiany.
    UWAGA: Wszystkie materiały, które mają kontakt z A. tumefaciens, należy wyrzucić do kosza na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Resztki płynów z kultur bakteryjnych można sterylizować podchlorynem sodu (wybielaczem) w stężeniu 20% lub wyższym.

5. Przemiana korzeni babki lancetowatej

  1. Kiedy rośliny osiągną idealny etap do transformacji (siewki mają 3 tygodnie) (Rysunek 1C), użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby oddzielić korzenie od reszty rośliny (Rysunek 3A). Wyrzuć materiał liści i łodyg.
  2. Natychmiast po ścięciu przenieś kawałki korzeni do sterylnych pudełek zawierających sterylną wodę za pomocą sterylnych kleszczy. Ten krok pozwala korzeniom pozostać nawilżonym, podczas gdy cała tkanka jest zbierana.
  3. Po odcięciu wszystkich korzeni wlać zawiesinę A. tumefaciens/SS do sterylnych jednorazowych szalek Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm. Przenieś korzenie do kultury A. tumefaciens i zaszczepiaj przez co najmniej 20 minut (Rysunek 3B).
  4. Podczas inkubacji za pomocą sterylnego skalpela z ostrym ostrzem pokrój korzenie na 1 cm fragmenty, oddzielając korzenie pierwotne od korzeni bocznych. Wykonaj cienkie, płytkie nacięcia na powierzchni korzeni, aby bakterie mogły zainfekować roślinę.
    UWAGA: Jeśli masz do czynienia z dużą liczbą roślin, przenieś kawałki korzeni do kultury bakteryjnej partiami, aby upewnić się, że wszystkie korzenie są zanurzone podczas inokulacji.
  5. Po inkubacji użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść kawałki korzeni na sterylne ręczniki papierowe, aby usunąć nadmiar bakterii. Unikaj suszenia korzeni przez ponad 60 sekund, ponieważ może to spowodować odwodnienie i uszkodzenie tkanki korzeniowej. Idealnie, 10-15 korzeni może być suszonych jednocześnie (Rysunek 3C).
  6. Przenieś wysuszone korzenie na przygotowane szalki Petriego o wymiarach 95 mm x 15 mm ze stałymi pożywkami do kohodowli (Tabela 1), około 10-20 korzeni na płytkę, w zależności od wielkości korzeni (Rysunek 3D).
  7. Uszczelnij płytki dwiema warstwami przezroczystej folii z tworzywa sztucznego, a następnie przykryj folią aluminiową. Inkubować w temperaturze pokojowej (22 °C) przez 3 dni. Ten krok daje czas bakteriom na zainfekowanie korzeni bez obecności selekcji antybiotyków (Rysunek 3E).

6. Selekcja i regeneracja całej rośliny

  1. Po inkubacji w pożywkach do współhodowli przenieść kawałki korzeni na przygotowane szalki Petriego o wymiarach 95 mm x 15 mm z pożywką do indukcji pędów stałych (SIM) (Tabela 1) z tymentyną (500 mg/l; patrz tabela materiałów) i odpowiednim doborem antybiotyków. W tym protokole użyliśmy kanamycyny (100 mg/L).
    UWAGA: Dno korzeni musi mieć pełny kontakt z podłożem. Korzenie, które nie dotykają powierzchni podłoża, są zbyt długie i muszą zostać przycięte, aby zapobiec wydostaniu się tkanki przed selekcją.
  2. Uszczelnij płytki dwiema warstwami przezroczystej folii z tworzywa sztucznego, a następnie uprawiaj pod światłem do uprawy przez 1 miesiąc (patrz krok 1.6, aby uzyskać odpowiednie warunki) lub do momentu, gdy zaczną pojawiać się pędy.
    UWAGA: Zazwyczaj inicjały pędów można zaobserwować po 2 tygodniach wzrostu, a pędy są zwykle widoczne po 1 miesiącu.
  3. Gdy sadzonki osiągną długość 1,5-2,0 cm (Rysunek 1D), przenieś je do przygotowanych sterylnych pudełek z solidną pożywką do indukcji korzeni (Tabela 1).
  4. Uprawiaj rośliny pod światłem do uprawy (patrz krok 1.6, aby zapoznać się z warunkami) przez kilka tygodni, aż uformują się korzenie. Korzenie można zazwyczaj zobaczyć po 1 tygodniu.
    UWAGA: Zaleca się, aby korzenie rosły przez kilka tygodni przed przeniesieniem do gleby, ponieważ rośliny o większych systemach korzeniowych mają zwykle wyższy wskaźnik przeżywalności w glebie.

7. Przenoszenie gleby

  1. Gdy systemy korzeniowe staną się wystarczająco duże, aby można je było przenieść (Rysunek 1E), zazwyczaj po 1 miesiącu wzrostu, przenieś rośliny do 3,5 w kwadratowych doniczkach zawierających wstępnie zwilżoną glebę uniwersalną (BM7). W tym protokole zastosowano mieszankę kory BM7 (patrz Tabela Materiałów).
    1. Usuń wszelkie podłoże, które przykleja się do korzeni, myjąc je delikatnie w wodzie.
      UWAGA: Rośliny mogą być uprawiane do dojrzałości w szklarni przy 800 do 1400 μmol fotonów m-2 s-2 przy użyciu lamp o wysokim ciśnieniu sodu 600 W (patrz Tabela Materiałów) lub w komorze wzrostowej w temperaturze pokojowej (22 °C) z chłodnym białym światłem o temperaturze 50 μmol m-2 s-1, 12 h dni.
  2. Przykryj rośliny plastikową osłoną doniczkową, a następnie przykryj je przezroczystą plastikową torbą. Ten krok pozwala roślinom pozostać w wilgotnym środowisku, gdy przystosowują się do gleby.
  3. Po około 3-5 dniach wyjmij plastikową torbę, a następnie powoli zdejmij pokrywkę, aby umożliwić aklimatyzację do środowiska zewnętrznego.
    UWAGA: W zależności od pory roku i środowiska, do którego rośliny są przenoszone, czas, w którym rośliny muszą się przystosować, może się różnić. Zaleca się codzienne sprawdzanie roślin i dolewanie wody do doniczek w razie potrzeby.
  4. Regularnie podlewaj rośliny i w razie potrzeby dodawaj nawóz. Rośliny można również przenosić do większych doniczek w celu dalszego wzrostu (Rysunek 1F).

8. Barwienie histochemiczne β-glukuronidazy (GUS)

  1. Przygotuj roztwór do barwienia β-glukuronidazy (GUS), zgodnie z opublikowanymi protokołami15.
  2. Gdy początki pędów osiągną około 0,5-1 cm długości, należy usunąć małą końcówkę młodego, w pełni rozwiniętego liścia (zwykle wystarcza <5 mm długości) i natychmiast przenieść do 0,5-1 ml roztworu barwiącego GUS w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 lub 2 ml. Roztwór powinien całkowicie pokryć tkankę roślinną.
  3. Otwarte probówki umieścić w eksykatorze próżniowym i odkurzać pod ciśnieniem 20-25 kPa przez 5-10 minut. Podczas procedury próżniowej w roztworze powinny być widoczne małe pęcherzyki. Dzięki temu roztwór może dostać się do komórek rośliny.
  4. Pozwól, aby powietrze przefiltrowało się z powrotem do eksykatora próżniowego. Zamknąć probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (12 godzin) lub do momentu, gdy pojawi się niebieski kolor.
    UWAGA: W tym badaniu aktywność GUS była zlokalizowana w łyku, co oznacza, że u roślin pozytywnie przekształconych niebieskie zabarwienie powinno być widoczne tylko w tkance łyka. Rośliny bez transgenu nie doświadczają barwienia (Rysunek 4).
  5. Aby lepiej uwidocznić plamę, przenieś rośliny do 100% etanolu, aby usunąć chlorofil. Aby zwiększyć skuteczność procesu usuwania chlorofilu, należy inkubować probówki w temperaturze 60 °C przez 10 min.
    UWAGA: Etanol może wymagać kilkukrotnej wymiany przed usunięciem całego chlorofilu, w zależności od wielkości barwionego liścia.

Wyniki

W niniejszym opracowaniu przedstawiono prosty protokół otrzymywania transgenicznych *P. lanceolata* wykorzystanie roślin A. tumefaciens-transformacja za pośrednictwem. Gen reporterowy GUS (kodowanie β-glukuronidaza) ulega transformacjipod kontrolą promotora wyrażanego w floemie AtPP2do 3-tygodniowych *P. lanceolata* przenikanie korzeni przez *A. tumefaciens* szczep GV3101 (Rysunek 2). Wybrano promotor specyficzny dla łyka, ponieważ głównym celem było stworzenie systemu dla genomiki funkcjonalnej tkanek przewodzących roślin, w szczególności łyka. Metodę przetestowano w eksperymencie wstępnym na tkance korzenia, liścia i ogonka liściowego. Choć w każdym z typów tkanek udało się indukować kalus, tylko tkanka korzenia wytworzyła primordia pędów (Rysunek 5A) po 1 miesiącu w SIM; liść i ogonek liściowy zbrązowiały i obumarły (Rysunek 5B). Doprowadziło to do wniosku, że tkanka korzenia jest optymalnym typem tkanki do zastosowania w metodzie transformacji. Korzenie inkubowano w przygotowanej zawiesinie bakterii w roztworze resuspensyjnym (SS) (Tabela 1) przez minimum 20 min, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej na stałych pożywkach SS przez maksymalnie 3 dni w ciemności (Rysunek 3E). Następnie korzenie przeniesiono na pożywkę do indukcji pędów (SIM) i utrzymywano pod lampą do wzrostu roślin, w warunkach wskazanych w protokole (krok 1.6). Rysunek 1 i Rycina 3 Przedstaw reprezentatywne obrazy każdego kroku protokołu w celu odniesienia.

Rysunek 6 przedstawia postęp powstawania inicjałów pędów wyłaniających się z przekształconej tkanki, od pierwszego dnia po umieszczeniu korzeni na podłożu SIM (Rysunek 6A) aż do momentu, gdy pędy były gotowe do ukorzenienia (Rysunek 6D). Po 1 tygodniu w tkance korzenia powstał kalus (Rysunek 6B) i można było zaobserwować pierwsze inicjały pędów (Rysunek 6B1). Pędy nadal wyłaniały się w drugim i trzecim tygodniu (Rysunek 6C), a po 4 tygodniach były gotowe do przeniesienia na podłoże indukujące ukorzenienie (Rysunek 6D).

Identyfikację domniemanych roślin transgenicznych przeprowadzono za pomocą histochemicznego testu β-glukuronidazy (GUS), wykorzystując fragmenty liści pobrane, gdy pędy osiągnęły długość około 0,5 cm. Pozytywne rośliny transgeniczne wykazywały oczekiwany wzór barwienia w tkankach zlokalizowanych w łyku, co przedstawiono na Rysunku 4. Pędy wybarwione pozytywnie na GUS przeniesiono na pożywkę indukującą korzenienie, na której po 4 tygodniach rozwinęły one silne systemy korzeniowe (Rysunek 1E). Ukorzenione rośliny przeniesiono następnie do gleby. Rysunek 4 przedstawia wynik barwienia w plantago wąskolistnym przekształconym promotorem AtPP2 i genem β-glukuronidazy (GUS), a dla porównania również roślinę typu dzikiego oraz plantago wąskolistne przekształcone promotorem AtPP2 . Wszystkie wyrosłe pędy potwierdzono jako transgeniczne. Wydajność transformacji określono na średnio 20%, przy czym z każdych 10 przekształconych korzeni wyrastały około dwa pędy. Potwierdzone rośliny transgeniczne przeniesiono do większych doniczek i hodowano przez 4–8 tygodni, aż osiągnęły stadium dorosłe (Rysunek 1F).

Oś czasu transformacji roślin; od sterylizacji nasion do testowania fenotypu; diagram; proces naukowy.
Rycina 1: Oś czasu transformacji Plantago lanceolata . Reprezentatywne obrazy każdego etapu protokołu. (A) Niewykiełkowane nasiona wysiane na pożywce MS. (B) Nasiona wykiełkowane po 1 tygodniu, gotowe do przeniesienia do pojemników magenta. (C) Rośliny w pojemnikach z pożywką MS po 3 tygodniach wzrostu. Korzenie są zielone i zdrowe, w idealnym stadium do transformacji. (D) Pędy w pożywce do indukcji pędów po 4 tygodniach są gotowe do przeniesienia do pożywki ukorzeniającej. Na tym etapie można przeprowadzić histochemiczne barwienie β-glukuronidazą (GUS), jeśli jest to właściwe. (E) Rośliny w pojemnikach z pożywką do indukcji korzeni, w których korzenie uformowały się po 4 tygodniach wzrostu. (F) Rośliny transgeniczne wyhodowane do pełnej długości po 4 tygodniach wzrostu w glebie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat mapy plazmidu pBI101; cechy obejmują gen GUS, ori, KanR, miejsca EcoRI; klonowanie genów.
Rysunek 2: Schemat plazmidu wektora binarnego pBI101 + β-glukuronidaza (GUS) z wstawionym promotorem specyficznym dla floemu AtPP2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przetwarzanie korzeni roślin: wycinanie, inkubacja bakteryjna, suszenie, przenoszenie na podłoże CIM, schemat owijania folią.
Rysunek 3: Etapy transformacji. Reprezentatywne obrazy każdego etapu transformacji. (A) Oddzielanie korzeni od pędów podczas transformacji. (B) Namaczanie korzeni w zawiesinie bakterii/SS. (C) Suszenie korzeni na ręcznikach papierowych w celu usunięcia nadmiaru bakterii. (D) Korzenie wysiane na podłożu do kokultury. (E) Szalki SS owinięte folią aluminiową. Rośliny inkubowano przez 2-3 dni przed przeniesieniem na podłoże do regeneracji pędów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza struktury żyłek liścia, obraz mikroskopowy przedstawiający trzy barwione próbki do badania naczyń.
Rysunek 4: Barwienie GUS. Wyniki barwienia β-glukuronidazą (GUS) segmentów liści plantago wąskolistnej. (A) Typ dziki. (B) Plantago wąskolistna przekształcona plazmidem zawierającym promotor AtPP2 (pusty wektor). (C) Plantago wąskolistna przekształcona plazmidem zawierającym promotor AtPP2 oraz gen β-glukuronidazy (GUS). Każdy liść został zabarwiony zgodnie z protokołem histochemicznego barwienia GUS, a następnie obrazowany za pomocą kamery mikroskopowej. Obrazy (B) i (C) nie wykazują wzoru barwienia ze względu na brak genu GUS. Prawy obraz pokazuje wyraźne niebieskie barwienie w obrębie żyłek, co potwierdza, że rośliny są transgeniczne. Pasek skali reprezentuje 1 mm, a każdy segment liścia ma długość około 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza wzrostu roślin; eksperyment na szalkach Petriego; rozwój korzeni; test oporności na kanamycynę.
Rysunek 5Porównanie wydajności transformacji różnych typów tkanek po >1-miesięczna inkubacja na pożywce do pędów. (A) Tkanki korzeniowe po ponad miesiącu wzrostu. W obrębie korzeni doszło do rozrostu kalusa i pojawiły się inicjały pędów. Nietransformowany kalus zaczął obumierać w wyniku selekcji antybiotykowej. (B) Tkanki liścia i ogonka liściowego po ponad miesiącu wzrostu. W tkankach zaobserwowano pewną ekspansję kalusa, który jednak wkrótce obumarł w odpowiedzi na działanie antybiotyku. Z żadnej z tkanek nie wyrosły pędy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Postęp wzrostu roślin w ciągu 4 tygodni; szalki Petriego, eksperyment regeneracji roślin, wyniki mikroskopowe.
Rysunek 6: Powstawanie kalusa i pędów na tkance transformowanej. Reprezentatywne obrazy tkanek umieszczonych na pożywce pędowej po różnych okresach inkubacji. (A) Tkanki korzenia bezpośrednio po wyłożeniu na pożywkę pędową. (B) Tkanki korzenia po 1 tygodniu na pożywce pędowej. Można zaobserwować ekspansję kalusa, a (B1) pierwsze prymasa pędów zaczęły się pojawiać. (C) Tkanki korzenia po 3 tygodniach na pożywce pędowej. Pojawiło się więcej prymasów pędów. (C1) Pęd, który wyłonił się z prymasa pędu B1. (D) Tkanki korzenia po 4 tygodniach inkubacji. Tkanka nietransformowana zaczęła czernieć/brązowieć i obumierać, a wyłaniające się pędy nadal rosną. Na tym etapie pędy są gotowe do przeniesienia na pożywkę ukorzeniającą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przepisy na przygotowanie pożywek. Opis sposobu przygotowania pożywek do transformacji. Ilość dodanych witamin oblicza się na podstawie wskazanego stężenia roztworu zapasowego. Sposób przygotowania roztworów zapasowych witamin przedstawiono w Tabeli 2. W przypadku wszystkich pożywek należy dodać odczynniki do 900 mL dwukrotnie destylowanej H2O, dostosować pH do wskazanego poziomu, a następnie uzupełnić wodą do końcowej objętości 1 000 mL. * = dodać po sterylizacji. ** = pH korygowane 1 M KOH. *** = pH korygowane 1 M NaOH. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Roztwory zapasowe witamin do pożywek Plantago. Wszystkie witaminy muszą zostać wysterylizowane przez filtr i precyzyjnie oznakowane przed przechowywaniem. W miejscach wskazanych, proszki należy najpierw rozpuścić w 1 N NaOH, a następnie dopełnić do pożądanego poziomu podwójnie destylowaną H2O. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Brak protokołu transformacji dla roślin z rodzaju Plantago ogranicza wykorzystanie tych roślin jako modeli, szczególnie gdy naukowcy są zainteresowani badaniem funkcji genów. P. lanceolata została wybrana do opracowania protokołu transformacji genetycznej, ponieważ jest to najczęściej badana roślina z rodzaju16. Opracowany protokół zostanie prawdopodobnie wykorzystany jako narzędzie do dalszych badań związanych z biologią naczyń krwionośnych, ekologią, interakcjami między roślinami a owadami i fizjologią stresu abiotycznego.

Przedstawiony protokół jasno określa kroki, które pozwalają użytkownikowi uzyskać rośliny transgeniczne. Oprócz zdolności P. lanceolata do rozwoju w środowisku hodowli tkankowej, do sukcesu naszej metody transformacji przyczyniło się wiele czynników. Po pierwsze, zaobserwowano znaczenie stosowania do transformacji wysokiej jakości, sterylnej tkanki korzeniowej roślin. Korzenie miały najwyższe tempo transformacji, gdy zostały pobrane z 3-4 tygodniowych roślin i wydawały się zielone lub bladobiałe. Korzenie pobrane z pudełek z jakąkolwiek ilością skażenia bakteryjnego lub grzybiczego często skutkowały skażonymi kulturami strzeleckimi, a starsze korzenie, które wydawały się brązowe, nie powodowały udanej transformacji. Tkanka korzeniowa była najbardziej efektywnym typem tkanki do transformacji przy użyciu obecnej metody, ponieważ tkanka liści i ogonków liściowych nie była w stanie rozwinąć pędów.

Innym ważnym spostrzeżeniem było to, że optymalną metodą pobierania tkanki korzeniowej do transformacji jest umieszczenie świeżo ściętego materiału korzeniowego w sterylnej wodzie. Ten krok skutecznie pozwolił na nawodnienie materiału korzeniowego, podczas gdy pozostała część tkanki została zebrana, ponieważ korzenie mają tendencję do szybkiego wysychania po wyjęciu z pojemników wzrostowych. Ten krok pomógł również zwiększyć wskaźnik powodzenia transformacji, ponieważ pozwolił na inkubację większej liczby korzeni w bakteriach w tym samym czasie.

Protokół ten można zmodyfikować poprzez skrócenie czasu inkubacji tkanki korzeniowej w pożywce do 2 dni. Zaobserwowano, że 2 lub 3 dniowy okres inkubacji jest wystarczający, aby umożliwić infekcję, która prowadzi do powstania inicjałów pędów. Nie zaleca się jednak dłuższego czasu inkubacji, ponieważ zaobserwowano, że brak inhibitora antybiotyku w pożywce często powoduje przerost A. tumefaciens , który może zabić powstającą tkankę.

Ograniczeniem tego badania jest brak dostępnych danych na temat skuteczności innych metod lub gatunków A. tumefaciens w transformacji P. lanceolata dla porównania. O ile nam wiadomo, protokół ten jest nowy. Podczas początkowych prób zauważono wysoką wydajność transformacji w przypadku A. tumefaciens GV3101, a my skupiliśmy się na udoskonaleniu techniki przy użyciu tego szczepu, zamiast eksperymentować z innymi szczepami. Nasza wydajność transformacji na poziomie 20% jest stosunkowo wysoka jak na transformację roślin - wiele konwencjonalnych metod uważa, że wszystko >1% jest skuteczne 26,27,28. Jednak użycie innego szczepu A. tumefaciens, takiego jak A. rhizogenes, znanego z zastosowania w transformacji korzeni u wielu gatunków 29,30,31, może skutkować jeszcze wyższym wskaźnikiem sukcesu. Potrzebne byłyby dalsze eksperymenty, aby ocenić wpływ stosowania innych szczepów w celu promowania zwiększonej wydajności transformacji u P. lanceolata.

Udana transformacja P. lanceolata prawdopodobnie przyniesie korzyści wielu dziedzinom nauki. Wysoka wydajność transformacji i szybki wzrost rośliny w pożywkach do hodowli tkankowych sprawiają, że P. lanceolata jest wykonalnym kandydatem do badań funkcji genów15.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 do C.Z. i Y.Z.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka z okrągłym dnem 14 mlA4A2:A34ThermoFisher Scientific150268
Kwas 1-naftylooctowyGold BiotechnologyN-780
3M Taśma chirurgiczna z mikroporamiThermoFisher Scientific19-027761
50 ml Probówki wirówkoweResearch Products International Corp.163227LC
600 Watt Wysokociśnieniowe lampy sodowePlantmaxPX-LU600
6-benzyloaminopuryna (6-BAP)Złoto BiotechnologiaB-110
Folia aluminiowa ThermoFisher Scientific01-213-100
Agar baktowy Thermofisher Scientific214010
Binarny plazmid pBI101Clontech, USA 
Cool White Grow Light Sylvania LLCHome Depot315952205
D-biotynaThermoFisher ScientificBP232-1
ddH2O
DH5a E. coli Invitrogen, Stany Zjednoczone 
Jednorazowe szalki Petriego, sterylne 150 x 16 mmTermoFisher ScientificFB0875712
Jednorazowe szalki Petriego, sterylne 95 x 15 mm
Leica Biosystems38DI12044
Etanol 200 ProofDecon Labs2705
Kwas foliowyFisher Naukowekleszcze BP2519-5
LeicaBiosystems38DI18031
GelriteResearch Products International Corp.G35020-1000
GlicerolThermoFisher Scientific17904
GlicynaSigma 
Inkubowana wytrząsarka orbitalnaThermoFisher ScientificSHKE420HP
Kwas indolo-3-octowy (IAA)BiotechnologyI-110
Kwas indolo-3-masłowy (IBA)Złoto Biotechnologia180
Monosiarczan kanamycynyZłoto BiotechnologiaK-120
Makrowirówka ThermoFisher Scientific75007210
Purpurowe pudełkaThermoFisher Scientific50255176
Końcówki do mikropipet 1000 i mikro; LCorning4140
Końcówki do mikropipet 200 i mikro; LCorning4138
Końcówki do mikropipet 10 i mikro; LCorning4135
Mikrowirówka ThermoFisher Scientific75002410
Mikropipet 0,5-10 & mikro; LCorning4071
Mikropipetor 100-1000 i mikro; LCorning4075
Mikropipetor 20-200 i mikro; LCorning4074
Mikropipetor 2-20 i mikro; LCorning4072
Murashige & Skooge Basal Medium z WitaminamiPhytoTechM519
Murashige & Skooge Basal Salt MixturePhytoTechM524
mio-inozytolGold BiotechnologyI-25
Kwas nikotynowySigmaN0761-100g
Parafilm (film parafinowy) ThermoFisher ScientificS37440
Wodorotlenek potasu (KOH)Research Products International Corp.P44000
Pirydoksyna HClSigmaP6280-10G
Rękojeść ostrza skalpelaLeica Biosystems38DI36419
Ostrza skalpelaLeica Biosystems3802181
Chlorek sodu, kryształ (NaCl)Mallinckrodt Chemicals7581-06
Wodorotlenek sodu (NaOH)Research Products International Corp.S24000
Podchloryn soduWalmart23263068401
Gleba-Kora MixBerger, USADoniczki kwadratowe BM7
(3,5 cala kwadratowego)Szklarnia MegastoreCN-TRK-1835
SacharozaResearch Products International Corp.S24060
TermocyklerThermoFisher ScientificA24811
Tiamina HClSigmaT4625-5G
Timentyna Tikarcylina/Klawulanian (15/1) (Tymentina)Złoto BiotechnologiaT-104
trans-zeatyna Rybozyd (ZR)Złoto BiotechnologiaZ-100
TryptonThermofisher Scientific211705
Dziki typ Plantago lanceolata seedsOutsidepride Seed Source, OR, USAF1296Outsidepride.com
Granulowany ekstrakt z drożdżyResearch Products International Corp.Y20025-1000 
63252218258012 Nożyczki preparacyjne ThermoFisher Scientific FB0875714G 241261Gold

Bibliografia

  1. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. The Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
  2. Bragg, J. N., Anderton, A., Nieu, R., Vogel, J. P. Brachypodium distachyon. Agrobacterium Protocols. , Springer. New York, NY. 17-33 (2015).
  3. Chang, C., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Field guide to plant model systems. Cell. 167 (2), 325-339 (2016).
  4. Müller, B., Grossniklaus, U. Model organisms-a historical perspective. Journal of Proteomics. 73 (11), 2054-2063 (2010).
  5. Ding, X., et al. Different fruit-specific promoters drive AtMYB12 expression to improve phenylpropanoid accumulation in tomato. Molecules. 27 (1), 317(2022).
  6. Niedbała, G., Niazian, M., Sabbatini, P. Modeling agrobacterium-mediated gene transformation of tobacco (Nicotiana tabacum)-a model plant for gene transformation studies. Frontiers in Plant Science. 12, 695110(2021).
  7. Kumari, D., Prasad, B., Dwivedi, P. Genome Editing Platforms in Rice (Oryza sativa L.): Basic methodology and troubleshooting. , (2022).
  8. Zhang, B. Agrobacterium-mediated transformation of cotton. Transgenic Cotton. , Humana Press. Totowa, NJ. 31-45 (2013).
  9. Tiwari, R., Singh, A. K., Rajam, M. V. Improved and reliable plant regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation in soybean (Glycine max L). Journal of Crop Science and Biotechnology. , 1-10 (2022).
  10. Bakhsh, A. Development of efficient, reproducible and stable Agrobacterium-mediated genetic transformation of five potato cultivars. Food Technology and Biotechnology. 58 (1), 57-63 (2020).
  11. Bates, R., Craze, M., Wallington, E. J. Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape (Brassica napus). Current Protocols in Plant Biology. 2 (4), 287-298 (2017).
  12. Hopp, H. E., Spangenberg, G., Herrera-Estrella, L. Plant transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 876671(2022).
  13. Abdelmuhsin, A. A., Alghamdi, A. A., Ibrahim, N. A. Assessing the phenotypic and genotypic variations of Plantago ciliata in Ha'il region, Saudi Arabia. Entomology and Applied Science Letters. (1), 14-22 (2021).
  14. Coleman, N. Plantago Lanceolata. Botanical Bulletin. 1 (11), 45(1876).
  15. Huang, J., et al. Tissue-specific transcriptomic profiling of Plantago major provides insights for the involvement of vasculature in phosphate deficiency responses. Molecular Genetics and Genomics. 294 (1), 159-175 (2019).
  16. Penczykowski, R. M., Sieg, R. D. Plantago spp. as models for studying the ecology and evolution of species interactions across environmental gradients. The American Naturalist. 198 (1), 158-176 (2021).
  17. Pommerrenig, B., et al. Common plantain. A collection of expressed sequence tags from vascular tissue and a simple and efficient transformation method. Plant Physiology. 142 (4), 1427-1441 (2006).
  18. Bergero, R., Levsen, N., Wolff, K., Charlesworth, D. Arms races with mitochondrial genome soft sweeps in a gynodioecious plant, Plantago lanceolata. Molecular Ecology. 28 (11), 2772-2785 (2019).
  19. Aalto, E. A., Koelewijn, H. P., Savolainen, O. Cytoplasmic male sterility contributes to hybrid incompatibility between subspecies of Arabidopsis lyrata. G3: Genes, Genomes, Genetics. 3 (10), 1727-1740 (2013).
  20. Bloch, K. D., Grossmann, B. Digestion of DNA with restriction endonucleases. Current Protocols in Molecular Biology. 3 (1), (1995).
  21. Du, C., et al. Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber. International Journal of Biological Macromolecules. 194, 395-401 (2022).
  22. Deshmukh, S. 22, Kulkarni, R., Bose, K. Transformation and protein expression. Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins. , Springer. Singapore. 83-114 (2022).
  23. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, Academic Press. 299-309 (2013).
  24. Broehan, G., Kroeger, T., Lorenzen, M., Merzendorfer, H. Functional analysis of the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene family of Tribolium castaneum. BMC Genomics. 14, 6(2013).
  25. Dong, Z., et al. Stable transformation of fluorescent proteins into Nosema bombycis by electroporation. Parasites & Vectors. 15 (1), 141(2022).
  26. Li, S., et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean. Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).
  27. Manimaran, P., et al. Infection of early and young callus tissues of indica rice BPT 5204 enhances regeneration and transformation efficiency. Rice Science. 20 (6), 415-426 (2013).
  28. Wang, J., Nie, J., Pattanaik, S., Yuan, L. Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Artemisia annua L. using young inflorescence. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 52 (2), 204-211 (2016).
  29. Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean. Plants. 11 (8), 1044(2022).
  30. Geng, S., et al. An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9-based analyses of shoot-root communication in cucurbit crops. Horticulture Research. 9, (2022).
  31. Xiao, Y., et al. Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation using cotyledons, hypocotyls and roots of 'Duli'(Pyrus betulifolia Bunge). Scientia Horticulturae. 296, 110906(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Plantago lanceolatatransformacja korzeniaindukowanie p d wselekcja antybiotykowatest reporterowy GUSro liny transgenicznehodowla tkanek
Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.