Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nabłonek jelitowy odgrywa istotną rolę w zdrowiu człowieka, stanowiąc barierę między gospodarzem a środowiskiem zewnętrznym. Ta wysoce dynamiczna warstwa komórkowa stanowi pierwszą linię obrony między populacjami drobnoustrojów i odporności oraz pomaga modulować jelitową odpowiedź immunologiczną. Przerwanie bariery nabłonkowej jest cechą charakterystyczną nieswoistego zapalenia jelit (IBD) i jest interesujące dla celów terapeutycznych. Trójwymiarowy system hodowli okrężnicy jest niezwykle przydatnym modelem in vitro do badania dynamiki jelitowych komórek macierzystych i fizjologii komórek nabłonkowych w patogenezie IBD. Idealnie byłoby, gdyby ustalenie kolonoidów z tkanki nabłonkowej zwierząt objętych stanem zapalnym było najbardziej korzystne w ocenie genetycznych i molekularnych wpływów na chorobę. Wykazaliśmy jednak, że zmiany nabłonkowe in vivo niekoniecznie są zatrzymywane w kolonoidach utworzonych od myszy z ostrym stanem zapalnym. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół leczenia kolonoidów za pomocą koktajlu mediatorów stanu zapalnego, które zwykle są podwyższone podczas IBD. Chociaż system ten może być stosowany powszechnie w różnych warunkach hodowli, protokół ten kładzie nacisk na leczenie zarówno zróżnicowanych kolonoidów, jak i dwuwymiarowych monowarstw pochodzących z ustalonych kolonoidów. W tradycyjnym środowisku hodowlanym kolonoidy są wzbogacane jelitowymi komórkami macierzystymi, co stanowi idealne środowisko do badania niszy komórek macierzystych. System ten nie pozwala jednak na analizę cech fizjologii jelit, takich jak funkcja bariery. Co więcej, tradycyjne kolonoidy nie dają możliwości badania odpowiedzi komórkowej terminalnie zróżnicowanych komórek nabłonka na bodźce prozapalne. Przedstawione tutaj metody stanowią alternatywne ramy eksperymentalne w celu rozwiązania tych ograniczeń. 2-wymiarowy system hodowli jednowarstwowej daje również możliwość terapeutycznych badań przesiewowych leków ex vivo. Ta spolaryzowana warstwa komórek może być leczona mediatorami stanu zapalnego po podstawowej stronie komórki i jednocześnie przypuszczalnymi terapiami wierzchołkowo w celu określenia ich przydatności w leczeniu IBD.
Wprowadzenie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z użyciem tkanek mysich zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie w Pittsburghu i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Komitet ds. Badań i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Pittsburghu oraz UPMC.
1. Przygotowanie do kultury
UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w sekcji Tabela materiałów, a wszystkie kompozycje roztworów można znaleźć w tabeli składu roztworu (Tabela 1).
- Przygotuj podłoże do mycia myszy zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przechowy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
System hodowli trójwymiarowych (3D) kolonoid jelitowych jest nieocenionym narzędziem do badania wewnętrznego wkładu nabłonka w homeostazę błony śluzowej jelit. Opisany protokół dostarcza szczegółowych instrukcji dotyczących izolacji krypt od myszy C57BL/6J (WT) w wieku 8 tygodni oraz ustanowienia długoterminowego systemu hodowli kolonoid, który może być modyfikowany w celu zastosowania w wielu dalszych badaniach. Po izolacji i wysianiu krypt w macierzy błony podstawnej, krypty w obrazowaniu za pomocą mikroskopii w świetl.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rozwój organoidów zrewolucjonizował sposób, w jaki społeczność naukowa bada układy narządów in vitro , dzięki zdolności do częściowego odtworzenia struktury i funkcji komórkowej zwierzęcia lub człowieka w naczyniu. Co więcej, systemy organoidowe pochodzące od ludzi z chorobami stanowią obiecujące narzędzie dla medycyny spersonalizowanej, które może pomóc w podejmowaniu decyzji terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji krypty, który działa dobrze i wprowadzamy kluczowe kroki, które pozwalają na u.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01DK120986 (do K.P.M.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,4-μ M przezroczyste transwell, 24-dołkowe | rurki stożkowe Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15 ml | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| Probówki stożkowe 50 ml | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μ Filtr siatkowy M | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Koncentracja zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x) |
| B-27 suplement | Invitrogen | 12587-010 | Koncentracja zapasów (50x); Stężenie końcowe (1x) |
| Pałeczki Zestaw elektrod do EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stężenie zapasu (100%); Stężenie końcowe (100%) |
| Ditiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stężenie zapasów (1 m); stężenie końcowe (1,5 mM); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta) |
| DMEM o wysokiej zawartości glukozy | Thermo Fisher | 11960-069 | Stężenie zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x) |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco bez wapnia i magnezu | Gibco | 14190-144 | Koncentracja zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x) |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stężenie podstawowe (0,5 m); Stężenie końcowe (30 mM) |
| Stężenie surowicy płodowej bydlęcej | Bio-Techne | S11150H | (100%); Stężenie końcowe (1%) |
| Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus, białe, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Stężenie końcowe (400 &mikro; g/&mikro; L) |
| Odczynnik gentamycyny | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stężenie podstawowe (50 mg / ml); Stężenie końcowe (250 μ g/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stężenie zapasów (100x); Stężenie końcowe (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stężenie zapasu (1 m); Stężenie końcowe (10 mM) |
| hIFNγ | R& D Systems | 285-IF | Stężenie zapasów (1000 ng/&mikro; L); Stężenie końcowe (10 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta) |
| hIL-1 i beta; | R& D Systems | 201-LB | Koncentracja zapasów (10 ng/&mikro; L); Stężenie końcowe (20 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta) |
| hTNF&alfa; | R& D Systems | 210-TA | Stężenie zapasów (10 ng/&mikro; L); Stężenie końcowe (40 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta) |
| Nadtlenek wodoru | Sigma | H1009 | (30%); stężenie końcowe (0,003%); Rozpuszczalnik (media do mycia myszy) |
| Hygromycyna B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Stężenie końcowe (400 &mikro; g/&mikro; L |
| ) L-WRN Linia komórkowa | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stężenie zapasów (0,5 i mikro; g/&mikro; L); Stężenie końcowe (50 ng/ml); Rozpuszczalnik (D-PBS + 1% BSA) |
| Suplement N-2 | Invitrogen | 17502-048 | Stężenie podstawowe (100x); Stężenie końcowe (1x) |
| N-acetylo-L-cysteina | Sigma | A9165-5G | Koncentracja zapasów (500 mM); stężenie końcowe (1 mM); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stężenie podstawowe (0,1 ng / & mikro; L); Stężenie końcowe (100 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta + 0,1% BSA) |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stężenie podstawowe (100x); Stężenie końcowe (1x) |
| Szalki Petriego (sterylizowane; 100 mm x 15 mm) Polystrene jednorazowe | VWR | 25384-342 | |
| Mikropłytki polistyrenowe, 24-dołkowe hodowle tkankowe, sterylne | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R& D Systems | 3474-RS-050 | Koncentracja zapasów (0,25 &mikro; g/&mikro; L); Stężenie końcowe (500 ng/ml); Rozpuszczalnik (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stężenie podstawowe (10x); Końcowa koncentracja (1x); Rozpuszczalnik (1 mM EDTA) |
| Ultraczysta woda | Invitrogen | 10977-023 | Koncentracja zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x) |
| Y-27632 dihyddrochlorek | Abcam | ab120129 | Koncentracja zapasów (10 mM); Stężenie końcowe (10 &mikro; M); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta) |
Bibliografia
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
