Artykuł metodologiczny

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

DOI:

10.3791/64804

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek jelitowy odgrywa istotną rolę w zdrowiu człowieka, stanowiąc barierę między gospodarzem a środowiskiem zewnętrznym. Ta wysoce dynamiczna warstwa komórkowa stanowi pierwszą linię obrony między populacjami drobnoustrojów i odporności oraz pomaga modulować jelitową odpowiedź immunologiczną. Przerwanie bariery nabłonkowej jest cechą charakterystyczną nieswoistego zapalenia jelit (IBD) i jest interesujące dla celów terapeutycznych. Trójwymiarowy system hodowli okrężnicy jest niezwykle przydatnym modelem in vitro do badania dynamiki jelitowych komórek macierzystych i fizjologii komórek nabłonkowych w patogenezie IBD. Idealnie byłoby, gdyby ustalenie kolonoidów z tkanki nabłonkowej zwierząt objętych stanem zapalnym było najbardziej korzystne w ocenie genetycznych i molekularnych wpływów na chorobę. Wykazaliśmy jednak, że zmiany nabłonkowe in vivo niekoniecznie są zatrzymywane w kolonoidach utworzonych od myszy z ostrym stanem zapalnym. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół leczenia kolonoidów za pomocą koktajlu mediatorów stanu zapalnego, które zwykle są podwyższone podczas IBD. Chociaż system ten może być stosowany powszechnie w różnych warunkach hodowli, protokół ten kładzie nacisk na leczenie zarówno zróżnicowanych kolonoidów, jak i dwuwymiarowych monowarstw pochodzących z ustalonych kolonoidów. W tradycyjnym środowisku hodowlanym kolonoidy są wzbogacane jelitowymi komórkami macierzystymi, co stanowi idealne środowisko do badania niszy komórek macierzystych. System ten nie pozwala jednak na analizę cech fizjologii jelit, takich jak funkcja bariery. Co więcej, tradycyjne kolonoidy nie dają możliwości badania odpowiedzi komórkowej terminalnie zróżnicowanych komórek nabłonka na bodźce prozapalne. Przedstawione tutaj metody stanowią alternatywne ramy eksperymentalne w celu rozwiązania tych ograniczeń. 2-wymiarowy system hodowli jednowarstwowej daje również możliwość terapeutycznych badań przesiewowych leków ex vivo. Ta spolaryzowana warstwa komórek może być leczona mediatorami stanu zapalnego po podstawowej stronie komórki i jednocześnie przypuszczalnymi terapiami wierzchołkowo w celu określenia ich przydatności w leczeniu IBD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1,2. Do podsumowania odpowiedzi nabłonkowej podczas IBD wykorzystano kilka modeli in vitro i in vivo, w tym hodowle komórkowe i mysie modele zapalenia3. Jednak wszystkie te systemy mają poważne wady, które ograniczają ich zdolność do rekapitulacji zmian nabłonkowych podczas IBD4. Większość linii komórkowych wykorzystywanych do badania IBD jest transformowana, ma zdolność do tworzenia monowarstwy i może różnicować się3, ale wewnętrznie rozprzestrzenia się inaczej niż nieprzekształcone komórki nabłonka jelitowego w gospodarzu. Do badania IBD wykorzystuje się kilka różnych mysich modeli zapalenia, z których niektóre obejmują modele nokautujące, modele zakaźne, chemiczne modele zapalne i modele transferu komórek T5,6,7,8. Chociaż każdy z nich może badać pewne aspekty etiologiczne IBD, takie jak predyspozycje genetyczne, dysfunkcja bariery pokarmowej, deregulacja immunologiczna i mikrobiom, mają ograniczoną zdolność do badania wieloczynnikowego charakteru choroby.

Organoidy jelitowe, w tym enteroidy i kolonoidy, zostały ustanowione w ciągu ostatniej dekady jako użyteczny model in vitro do badania nie tylko dynamiki jelitowych komórek macierzystych, ale także ich roli, integralności bariery i funkcji nabłonka jelitowego w homeostazie jelit i chorobie. Podmioty te znacząco przyczyniły się do naszego zrozumienia patogenezy IBD9 i otworzyły nowe możliwości dla medycyny spersonalizowanej. Kolononice, czyli samoorganizujące się kultury tkankowe z okrężnicy pochodzące z komórek macierzystych, zostały opracowane zarówno z tkanki mysjej, jak i ludzkiej w procesie, który umożliwia namnażanie się komórek macierzystych znajdujących się w kryptach jelitowych i utrzymywanie ich w nieskończoność10. Nisza komórek macierzystych in vivo opiera się na czynnikach zewnątrzkomórkowych wspierających jej wzrost, w szczególności na kanonicznych szlakach sygnałowych Wnt i morfogennych białek kostnych11. Dodanie tych czynników sprzyja zdrowiu i długowieczności kolonoidów, ale także prowadzi hodowlę w kierunku stanu podobnego do komórek macierzystych, który nie odzwierciedla architektury komórkowej nabłonka in vivo, która składa się zarówno z samoodnawiających się, jak i terminalnie zróżnicowanych komórek12,13. Podczas gdy funkcjonalność nabłonka jelitowego zależy od ciągłego przesłuchu między przedziałem komórek macierzystych a zróżnicowanymi komórkami, zdolność do posiadania obu tych elementów w systemie hodowli okrężnicy jest dość ograniczona. Pomimo tych ograniczeń, system hodowli organoidów pozostaje złotym standardem w badaniu wewnętrznych właściwości nabłonka ex vivo. Niemniej jednak może być konieczne rozważenie alternatywnych strategii kulturowych, aby odpowiedzieć na zadane pytanie naukowe.

Wykazano, że u myszy na ciągłym 7-dniowym schemacie siarczanu sodu dekstranu (DSS) rozwijają zarówno zapalenie nabłonka, jak i dysfunkcję bariery 14. Co więcej, niepowodzenie biogenezy mitochondriów i przeprogramowanie metaboliczne w nabłonku jelitowym, które, jak wykazano, są widoczne w ludzkim IBD, zostały również uchwycone w tym modelu DSS zapalenia jelita grubego15. Jednak nasze wstępne dane pokazują, że cechy niewydolności biogenezy mitochondriów nie są zachowane w kolonoidach pochodzących z krypt zwierząt leczonych DSS (rysunek uzupełniający 1). Dlatego przy badaniu, w jaki sposób stan zapalny napędza zmiany nabłonkowe podczas zapalenia jelit mysich, należy zastosować alternatywne metody hodowli. W tym miejscu przedstawiamy opracowany przez nas protokół, który opisuje: 1) jak wyizolować krypty z całej tkanki okrężnicy w celu ustanowienia mysich kolonoidów, 2) jak ostatecznie różnicować tę populację komórek, aby odzwierciedlić populację komórek tak, jak wygląda in vivo, oraz 3) jak wywołać stan zapalny w tym modelu in vitro. Aby zbadać interakcje leków w obrębie nabłonka objętego stanem zapalnym, opracowaliśmy protokół ustanawiania monowarstw 2-wymiarowych (2D) z mysich kolonoidów, które można zasadniczo leczyć mediatorami stanu zapalnego i leczyć wierzchołkowo terapiami lekowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z użyciem tkanek mysich zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie w Pittsburghu i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Komitet ds. Badań i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Pittsburghu oraz UPMC.

1. Przygotowanie do kultury

UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w sekcji Tabela materiałów, a wszystkie kompozycje roztworów można znaleźć w tabeli składu roztworu (Tabela 1).

  1. Przygotuj podłoże do mycia myszy zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przechowywać w temperaturze 4°C do 2 miesięcy.
  2. Przygotuj bufor izolacyjny krypty 1 (CIB1) zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przechowywać w temperaturze 4°C do 2 miesięcy.
    UWAGA: Ditiotreitol (DTT) jest uważany za niebezpieczny przez normę OSHA dotyczącą informowania o zagrożeniach ze względu na potencjalną ostrą toksyczność w przypadku spożycia oraz uszkodzenie skóry i oczu, jeśli te obszary są na niego narażone. Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną należy używać rękawic ochronnych, ochrony oczu i ochrony twarzy.
  3. Przygotuj bufor izolacyjny crypt 2 (CIB2) zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przechowywać w temperaturze 4°C do 2 miesięcy.
  4. Przygotuj pożywkę kondycjonowaną L-WRN zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem16.
  5. Przygotować kompletne podłoże z okrężnicy grubej zgodnie z opisem w Tabeli 1. Kompletna pożywka do okrężnicy może być przechowywana do 5 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.
  6. Przygotować pożywkę różnicującą zgodnie z opisem w tabeli 1. Ten protokół został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanego artykułu17. Pożywka różnicująca może być przechowywana do 5 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.
  7. Przygotować pożywkę mediatora stanu zapalnego zgodnie z opisem w Tabeli 1. Ten protokół został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanego artykułu18. Pożywka mediatora stanu zapalnego może być przechowywana do 5 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.
  8. Przygotuj mysie podłoże jednowarstwowe. Pomiń Y-27632 podczas prowokowania monowarstw czynnikami zapalnymi i/lub lekiem (lekami). Mysie podłoże jednowarstwowe może być przechowywane do 5 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.
  9. Przygotować jednowarstwowe podłoże mediatora stanu zapalnego. Jednowarstwowe podłoże mediatora stanu zapalnego może być przechowywane do 5 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.

2. Izolacja krypty z tkanki okrężnicy myszy

UWAGA: Przenieś tkankę na lód. Wyjmij odpowiednią ilość matrycy membrany podstawnej z przechowywania w temperaturze -20°C i rozmroź na lodzie. Każda 24-studzienka jest pokryta 15 μl matrycy membrany podstawnej. Przygotować pożywkę wzrostową kolonoidu CIB1, CIB2 i kompletną, jak opisano w sekcji 1.

  1. Poddaj eutanazji mysz C57BL/6J (w wieku 6-8 tygodni) zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i usuń dystalny koniec (około 5-7 cm) okrężnicy za pomocą czystej pęsety i nożyczek.
    UWAGA: W tym badaniu badani zostali poddani eutanazji za pomocą inkubacji w komorze dwutlenku węgla przez 2-3 minuty, a następnie zwichnięciu szyjki macicy.
    1. W tym celu umieść mysz na plecach, wykonaj poziome nacięcie tuż pod klatką piersiową, a następnie pionowe nacięcie od środka poziomego nacięcia w kierunku podstawy ogona, aby odsłonić jamę brzuszną.
    2. Za pomocą pęsety wysuń jelito cienkie z pola, zidentyfikuj okrężnicę i podążaj za nią w dół do podstawy ogona. Złam miednicę nożyczkami, aby w razie potrzeby całkowicie odsłonić dystalną okrężnicę. Użyj nożyczek, aby przeciąć najbardziej dystalne 5-7 cm okrężnicy.
  2. Umieść tkankę jelita grubego na czystej powierzchni. Usuń nadmiar tłuszczu surowiczego, który otacza okrężnicę. Usunąć kał, przepłukując luminalną zawartość jelita grubego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco za pomocą strzykawki podłączonej do igły 18 G 1 1/2. Następnie umieść okrężnicę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego DPBS i umieść ją na lodzie.
    UWAGA: Jeśli izolujesz okrężnicę od więcej niż jednego zwierzęcia, umieść tkankę na lodzie przed przejściem do następnego zwierzęcia.
  3. Przenieś tkankę jelita grubego na szalkę Petriego z 10 ml lodowatego DPBS i dwukrotnie przepłukaj światło DPBS za pomocą pipety P1,000.
  4. Otwórz okrężnicę wzdłużnie za pomocą nożyczek i delikatnie potrząsaj pęsetą przez ~30 s w DPBS, aby usunąć pozostałą zawartość kału.
  5. Przenieś tkankę na nową szalkę Petriego z 10 ml lodowatego DPBS i ponownie delikatnie wstrząśnij pęsetą, a następnie pokrój okrężnicę na 2 cm kawałki za pomocą nożyczek i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 7 ml lodowatego CIB1. Inkubować tkankę w CIB1 na lodzie przez 20 min.
    UWAGA: Pozostałe kroki wykonywane są w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  6. Przenieść tkankę za pomocą pęsety do wstępnie podgrzanej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 7 ml CIB2 i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 5 minut.
  7. Wyjmij CIB2 z probówki stożkowej o pojemności 50 ml, pozwalając chusteczce osiąść na dnie stożkowej probówki, a następnie odpipetuj CIB2. Następnie dodaj 10 ml lodowatego środka do mycia myszy do tej samej stożkowej probówki.
  8. Zaopatrz się w nową probówkę stożkową o pojemności 50 ml i umieść filtr o pojemności 70 μm na otwartej probówce.
  9. Trzymając rurkę z zawartością jelita grubego, obróć rękę o około 45°. Potrząsaj rurką w kołyszący i energiczny sposób przez 45 sekund, aby uwolnić krypty. Następnie przelać zawiesinę krypty przez sitko komórkowe o pojemności 70 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  10. Za pomocą pęsety umieść tkankę jelita grubego z powrotem w pustej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 10 ml lodowatego środka do mycia myszy. Zaopatrzyć się w nowe sitko o wielkości 70 μm i umieścić je na stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej poprzednio przefiltrowany roztwór.
  11. Ponownie podnieś probówkę o pojemności 50 ml zawierającą fragmenty krypty i potrząśnij nią w identyczny sposób, jak w kroku 2.9. Przefiltrować pożywkę przez sitko komórkowe 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby połączyć się z wcześniej przefiltrowanymi kryptami.
    UWAGA: Jeśli wydajność krypty jest niska, potrząśnij tkanką jelita grubego jeszcze raz, umieszczając tkankę w pustej stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 10 ml pożywki do mycia myszy. Potrząsaj tkanką przez 45-50 sekund, aby uwolnić krypty. Ponadto, jeśli wydajność krypty jest niska, zwiększ energiczność potrząsania. Wreszcie, jeśli ogólna wydajność krypty jest niska, zarówno pipety, jak i probówki można pokryć płodową surowicą bydlęcą (FBS), aby zapobiec przywieraniu tkanki do plastiku.
  12. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą przefiltrowane krypty o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
    UWAGA: Na dnie stożkowej probówki o pojemności 50 ml należy obserwować osad
    13. .
  13. Zdekantować pożywkę przez pipetowanie, ponownie zawiesić krypty, pipetując w górę i w dół 10 ml lodowatego roztworu do mycia myszy i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
  14. Aby uzyskać czystszy preparat, umyj krypty dodatkowymi 10 ml płynu do mycia myszy. Zdekantować poprzednią pożywkę i ponownie zawiesić krypty, pipetując w górę i w dół w 10 ml pożywki do mycia myszy. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C za pomocą stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas pipetowania pożywki, ponieważ czasami granulki nie są szczelnie odwirowane. Jeśli osad nie jest szczelny, odpipetuj większość pożywki, pozostawiając od 500 μl do 1 ml. Następnie ponownie zawiesić osad przez pipetowanie w 10 ml pożywki do mycia myszy i przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirowanie w mniejszej stożkowej probówce może poprawić szczelność granulatu.
  15. Zdekantować pożywkę i ponownie zawiesić krypty, pipetując w górę i w dół 10 ml lodowatego płynu do mycia myszy. Po ponownym zawieszeniu policz krypty pod mikroskopem w jasnym polu, natychmiast odpipetowując 10 μl pożywki na szkiełko podstawowe.
    1. Umieść dwie krople o pojemności 10 μl na oddzielnych końcach szkiełka i policz liczbę krypt w każdej kropli. Uśrednij liczby między dwiema kroplami, aby określić liczbę krypt na 10 μL. Pomnóż tę liczbę przez 100, aby uzyskać liczbę krypt w 1 mL.
      UWAGA: W celu dokładnego zliczenia, 10 μl zawiesiny krypty należy natychmiast usunąć po ponownym zawieszeniu. Jeśli nie, krypty spadną na dno tuby, co spowoduje niedokładne zliczenie.
  16. W celu posiewu 300-500 krypt na studzienkę, przenieś odpowiednią objętość krypt zawieszonych w pożywce do mycia myszy do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i doprowadź do 10 ml lodowatym środkiem do mycia myszy. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Na dnie rurki powinna być widoczna mała granulka.
  17. Usunąć supernatant za pomocą pipety elektrycznej. Użyj pipety P200, aby ostrożnie usunąć wszelkie resztki medium, pozostawiając tylko granulki.
  18. Zawiesić osad w odpowiedniej ilości lodowatej matrycy membrany podstawnej, powoli pipetując w górę iw dół. Uważaj, aby nie wprowadzić bąbelków podczas ponownego zawieszania kulki krypty. Płytka 300-500 krypt/15 μl matrycy błony podstawnej w każdym dołku płytki. Po posiewie odwróć płytkę do hodowli tkankowej i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37°C na 10-20 minut.
  19. Odwróć płytkę i dodaj 500 μl kompletnej pożywki dla kolonoidów myszy do każdej studzienki. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż będą gotowe do pasażu. Przechodzą przez kolonoidy co 3-5 dni.

3. Przejście przez koloidy

UWAGA: Każda studnia może być generalnie przepuszczona w stosunku 1:4 do 1:6 zgodnie z gęstością pierwotnej studni. Wyjmij odpowiednią ilość macierzy błony podstawnej z temperatury -20°C i umieść ją na lodzie do rozmrożenia. Kolonoidy mogą być używane do eksperymentów po dwóch przejściach. Podczas pasażowania kolonoidów kroki są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

  1. Usuń pożywkę z dołków, które mają być przepuszczone.
    1. Jeśli w matrycy membrany podstawnej znajdują się zanieczyszczenia, co może się zdarzyć podczas początkowej izolacji, do oczyszczenia zanieczyszczeń można zastosować następujący protokół:
      1. Dodać 1 ml lodowatej 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w DPBS bez Ca2+ lub Mg2+ do każdej studzienki. Pozostaw na 5 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      2. Pipetować w górę i w dół od trzech do siedmiu razy za pomocą pipety P1000, aby rozbić matrycę membrany podstawnej, a następnie zebrać zawartość studzienek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odwirować koloidy w sumie 5-10 ml 0,1% BSA w DPBS bez Ca2+ lub Mg2+. Uzupełnić do odpowiedniej objętości 0,1% masy ciała.
      3. Wirować przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C, aby osadzać koloidy, ale nie resztki.
      4. Zdekantować DPBS przez pipetowanie, pozostawiając osad. Dodaj 1 ml odczynnika do dysocjacji enzymatycznej o temperaturze pokojowej (RT) i pipetuj trzy do pięciu razy.
      5. Umieść stożkową probówkę o pojemności 15 ml z enzymatycznym odczynnikiem dysocjacyjnym i uszkodzonymi kolonoidami w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 3-4 minuty.
      6. Wyjmij probówkę z łaźni wodnej, pipetuj 3-5 razy, a następnie doprowadź do 10 ml roztworu do mycia myszy. Przejdź do kroku 3.6.
  2. Umieść 500 μl enzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego RT w każdym dołku i pozostaw go na około 1 minutę, a następnie pipetuj w górę iw dół trzy do siedmiu razy, aby rozbić matrycę błony podstawnej.
  3. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 3-4 minuty.
  4. Wyjąć płytkę z inkubatora i pipetować w górę i w dół trzy do siedmiu razy za pomocą pipety P1000 w celu dysocjacji okrężnicy.
  5. Przenieś zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i uzupełnij do 10 ml lodowatym środkiem do mycia myszy.
  6. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
  7. W razie potrzeby usunąć podłoże za pomocą pipety zasilającej i pipety P200, tak aby w stożkowej probówce pozostała tylko osadka.
  8. Ponownie zawiesić w odpowiedniej ilości lodowatej matrycy membrany podstawnej, delikatnie pipetując w górę iw dół, w zależności od liczby studzienek, które mają być pokryte. Nie należy wprowadzać pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. Umieść fragmenty colonoidu w 15 μl kropli matrycy błony podstawnej na studzienkę.
  9. Pokryć krypty płytkami, odwrócić płytkę do hodowli tkankowej, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C na 10-20 minut.
  10. Na koniec odwróć płytkę i dodaj 500 μl kompletnej pożywki dla kolonoidów myszy do każdego dołka. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż urosną wystarczająco duże, aby można je było ponownie przejść za około 3-5 dni.

4. Końcowe różnicowanie komórek okrężnicy

  1. Przepasuj kolonoidy jak powyżej i dodaj 500 μl kompletnej pożywki dla kolonoidów myszy do każdej studzienki.
  2. Co najmniej 48 godzin po pasażowaniu należy usunąć całą pożywkę z okrężnicy myszy i dodać 500 μl pożywki różnicującej do każdej studzienki (patrz sekcja 1).
  3. Inkubować koloidy z pożywkami różnicującymi przez 48 godzin, po czym można je wykorzystać w eksperymentach, w tym w zbieraniu RNA i białka.
    UWAGA: Kolonoidy można ocenić pod kątem różnicowania, zbierając RNA i oceniając ekspresję Lgr5 i Ki67, odpowiednio markera komórek macierzystych i markera proliferacji komórek, poprzez ilościową reakcję łańcuchową polimerazy odwrotnej transkryptazy (qPCR). Końcowo zróżnicowane komórki powinny mieć stosunkowo niską ekspresję Lgr5 i Ki67 w porównaniu z kolonoidami hodowanymi w tradycyjnym pożywce okrężnicy, gdzie komórki są bardziej podobne do łodygi. Czas potrzebny kolonodom na inkubację w pożywce różnicującej może wymagać optymalizacji dla każdego laboratorium z osobna. Patrz Tabela Uzupełniająca 1 w celu uzyskania wykazu starterów.

5. Wywoływanie stanu zapalnego w zróżnicowanych kolonoidach z mediatorami stanu zapalnego

  1. Po inkubacji kolonoidów przez 2-3 dni z podłożem różnicującym, usuń istniejące podłoże i dodaj 500 μl pożywki mediatora zapalenia do każdej studzienki.
  2. Pozostawić studzienki do inkubacji przez 24-72 godziny przed pobraniem RNA i białka (lub oceną innych dalszych parametrów). Zmieniaj podłoże codziennie.

6. Monowarstwy nabłonka jelitowego pochodzące z ustalonych mysich kolonoidów

UWAGA: Monowarstwy nabłonka jelitowego myszy pochodzą z mysich kolonoidów, które zostały przepasane co najmniej dwa razy. Aby umożliwić pomyślne uformowanie monowarstwy w ciągu 3-5 dni, konieczne jest, aby nie rozdzielać kolonoidów na pojedyncze komórki. Rozdrobnione organoidy, które zostały enzymatycznie zdysocjowane w klastry komórkowe, są idealne do wzrostu.

  1. Przygotuj wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie. Przygotuj mysie podłoże jednowarstwowe zgodnie z opisem w sekcji 1 . Rozcieńczyć rozmrożoną błonę podstawną w stosunku 1:20 zimnym mysim podłożem monowarstwowym. Trzymaj na lodzie.
  2. Użyj sterylnych kleszczyków, aby umieścić przezroczystą wkładkę do hodowli komórkowej o wielkości 0,4 μm w pojedynczym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (tabela materiałów). Chwyć narożny ząb wkładki i przenieś go do studni. Powtarzaj tę czynność, aż dostępna będzie odpowiednia liczba wkładek do hodowli komórkowych dla hodowli.
    UWAGA: Upewnij się, że dodatkowa studzienka kontrolna jest pokryta tylko matrycą membrany podstawnej. Ta wkładka do hodowli komórkowej zostanie wykorzystana do pomiaru odporności tła wkładki do hodowli komórkowej bez obecnych komórek, jak opisano w kolejnym kroku (krok 6.3).
  3. Za pomocą pipety P200 pokryć wierzchołkową (górną) powierzchnię każdej wkładki do hodowli komórkowej 150 μl rozcieńczonej matrycy błony podstawnej. Umieść końcówkę pipety na środku wkładki, nie dotykając membrany wkładki, a następnie delikatnie usuń roztwór. Umieścić płytkę w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37°C z 5% CO2 na co najmniej 1 godzinę.
  4. Przed użyciem delikatnie usuń matrycę błony podstawnej i pozostaw wkładki do hodowli komórkowych do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 10 minut.
    1. Aby usunąć matrycę membrany podstawnej, obróć 24-dołkową płytkę pod kątem 45°. Umieść pojedynczy palec na rogu bolca, aby ustabilizować wkładkę, a następnie za pomocą pipety P200 delikatnie umieść końcówkę pipety wzdłuż dolnej strony wkładki i wyjmij matrycę.
    2. Usunąć nadmiar pozostałości, myjąc każdą wkładkę do hodowli komórkowej 150 μl sterylnego DPBS bez Ca2+ lub Mg2+.
  5. Po 10 minutach suszenia dodaj 400 μl mysiej pożywki jednowarstwowej na dno wkładki do hodowli komórkowej i 75 μl na wierzch. Powtarzaj, aż wszystkie wkładki do hodowli komórkowych zostaną zanurzone. Pozostawić płytkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub umieścić ją z powrotem w inkubatorze, aż będzie potrzebna.
  6. Wyjąć 24-dołkową płytkę dojrzałych (organoidów w 3-5 dniu wzrostu) kolonoidów jelitowych z inkubatora o temperaturze 37°C, 5% CO2 i umieścić ją pod komorą bezpieczeństwa biologicznego. Usunąć pożywkę za pomocą sterylnych końcówek i umyć każdą studzienkę 1 ml sterylnego DPBS RT (bez Ca2+ lub Mg2+).
    UWAGA: Pojedyncza studzienka składająca się z 75-125 dojrzałych kolonoidów jest dzielona w stosunku 1:4.
  7. Usunąć DPBS bez Ca2+ lub Mg2+ za pomocą sterylnych końcówek i wytrawić każdą czopkę macierzy błony podstawnej, umieszczając 500 μl odczynnika dysocjacji enzymatycznej RT w każdym dołku, który ma być pasażowany.
  8. Pipetuj każdą studzienkę w górę i w dół około 6-10 razy, aby rozbić korek. Nie drap dolnej części płytki, aby wyjąć wtyczkę. Zamiast tego obróć 24-dołkową płytkę pod kątem 45°, umieść końcówkę pipety na krawędzi korka i delikatnie ją wysuń.
  9. Umieść 24-dołkową płytkę z powrotem w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO2 na 3-4 minuty.
  10. Wyjąć płytkę i odpipetować odczynnik dysocjacji enzymatycznej w górę i w dół pięć do siedmiu razy dla każdej studzienki pod komorą bezpieczeństwa biologicznego. Przenieś oddzielone kolonoidy z każdej studzienki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Uzupełnić do objętości 10 ml lodowatym płynem do mycia myszy.
  11. Odwirować częściowo strawione koloidy w temperaturze 300 x g w temperaturze 4°C przez 5 minut w wirówce z odchylanym wiadrem.
  12. Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego usunąć supernatant z osadu za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Usunąć pozostałe podłoże za pomocą pipety P200. Zawiesić osad kolonoidu w mysim podłożu jednowarstwowym. Dodać 75 μl pożywki na każdą wkładkę do hodowli komórkowej z rozdrobnionymi kolonoidami, które mają być powlekane.
  13. Dodać 75 μl zawiesiny kolonoidu do środka każdej wkładki do hodowli komórkowej. Przed dodaniem zawiesiny kolonoidu do każdej studzienki, delikatnie pipetować w górę i w dół raz lub dwa razy przed wyjęciem 75 μl, co pozwala na bardziej równomierne rozsiewanie.
  14. Umieść 24-dołkową płytkę z wkładkami do hodowli komórkowych na obrotowej platformie na 10 minut, aby umożliwić równomierne rozproszenie we wkładce do hodowli komórkowej.
  15. Umieść płytkę w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO2 .
  16. Następnego dnia (Dzień 1) należy usunąć nieprzyłączone fragmenty kolonoidu, pipetując pożywkę w górę i w dół trzy do pięciu razy za pomocą pipety P200. Delikatnie umieść końcówkę wzdłuż wnętrza wkładki do hodowli komórkowej, aby nie zakłócić przyczepionych komórek jelitowych. Nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza do podłoża, ponieważ uniemożliwia to usunięcie wszystkich nieprzyczepionych fragmentów.
  17. Natychmiast usunąć mieszaninę pożywki i okrężnicy. Powtarzaj, aż wszystkie wkładki do hodowli komórkowych zostaną oczyszczone.
  18. Delikatnie dodaj 150 μl wstępnie podgrzanej mysiej pożywki jednowarstwowej na wierzchołkową stronę każdej wkładki do hodowli komórkowej. Dodaj 400 μl podgrzanej monowarstwowej pożywki mysiej do każdego dołka nowej 24-dołkowej płytki. Przenieś wkładkę do hodowli komórkowej na nową płytkę, chwytając jej ząb za pomocą sterylnych kleszczy. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aż do zbiegu.
    UWAGA: Fragmenty kolonoidu powinny tworzyć zlewającą się monowarstwę 3-5 dni po posiewie.

7. Pomiar rezystancji netto monowarstw nabłonka za pomocą woltoomomierza w dniach 3 - 5 hodowli jednowarstwowej

UWAGA: Elektrody pałeczek przypominają kleszcze i mają asymetryczną długość. Dłuższe ramię sondy to elektroda podstawno-boczna, a krótsze ramię to elektroda wierzchołkowa. Sonda może być trudna do włożenia między wnętrze i zewnętrzną stronę wkładu do hodowli komórkowej. Umieszczenie sondy pod niewielkim kątem po włożeniu, a następnie pionowe wyprostowanie sondy, zapobiegnie zablokowaniu sondy. Upewnij się, że odczytujesz rezystancję netto każdej wkładki do hodowli komórkowej pod podobnym kątem, ponieważ może to mieć wpływ na wartości.

  1. Umieść woltoomomierz i wszystkie odczynniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Podłącz woltoomomierz do najbliższego gniazdka sieciowego i podłącz plastikowe złącze modułowe sondy elektrody do gniazda INPUT na przednim wyświetlaczu.
    2. Aby ustawić woltoomomierz pod kątem 45°, odchyl metalowe ramię z tyłu urządzenia, aż zablokuje się na swoim miejscu.
    3. Teraz włącz woltoomomierz, przesuwając przełącznik zasilania W GÓRĘ na przednim wyświetlaczu. Na koniec przestaw przełącznik w górę w kierunku OHMS, aby wyświetlić odczyt w tej metryce.
  2. Wyjąć 24-dołkową płytkę z inkubatora o temperaturze 37°C, 5% CO2 i położyć płytkę płasko w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przeznabłonkowy opór elektryczny (TEER) jest wrażliwy na temperaturę. Tabliczkę należy wyjmować tylko bezpośrednio przed odczytaniem TEER.
  3. Sterylizuj sondę elektrody we wstępnie podgrzanym 70% etanolu przez 30 s do 1 minuty. Wyjmij sondę, odwróć ją i przesuń ją jeden do dwóch razy, aby usunąć nadmiar etanolu. Pozostaw sondę do wyschnięcia na powietrzu przez około 30 sekund.
  4. Umyj pozostały etanol pozostawiony na sondzie wstępnie podgrzanym środkiem do mycia myszy.
    UWAGA: Nie pozwól, aby którakolwiek z pozostałych kropelek etanolu znajdujących się wyżej na sondzie wpadła do wkładki do hodowli komórkowej. Podczas zmywania etanolu pożywką nie należy pozwolić, aby pożywka znalazła się powyżej sterylnego pola etanolu. Może to spowodować przedostanie się zanieczyszczonej pożywki do wkładki do hodowli komórkowej.
  5. Trzymaj sondę prostopadle do wkładki do hodowli komórkowej. Umieść elektrodę podstawno-boczną (dłuższy koniec sondy) na zewnątrz wkładki do hodowli komórkowej, aż dotknie podstawy 24-dołkowej płytki. Wsuń elektrodę wierzchołkową (krótszy koniec sondy) do wkładki do hodowli komórek. Nie zmieniaj odległości dwóch elektrod od studni do studni. Będzie to miało wpływ na pomiar TEER.
  6. Sprawdź, czy elektroda wierzchołkowa nie dotyka podstawy wkładki do hodowli komórkowej przed odczytaniem TEER. Zacznij od wkładki do hodowli komórek kontrolnych w tle i zapisz wartość. Wartość zostanie automatycznie wyświetlona cyfrowo z przodu woltoomomierza.
  7. Powtórz kroki 7.5-7.6 dla każdej wkładki do hodowli komórkowej.
    UWAGA: Jeśli między wkładkami do hodowli komórkowych istnieją różne warunki eksperymentalne, wysterylizuj sondę między każdym nowym stanem. Zacznij od kroku 7.1 i postępuj numerycznie.
  8. Umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów TEER.
  9. Wartości netto przy 350 Ω lub więcej wskazują na tworzenie się monowarstw. Powtórz ponownie w kolejnych dniach, aż do uzyskania tworzenia monowarstwy.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wartości 1,000 Ω lub więcej mogą zostać przechwycone w dniu 3, ale z czasem wszystkie zbiegną się do niższej liczby około 350 Ω.

8. Obliczanie TEER na podstawie pomiarów rezystancji netto z woltoomomierza

UWAGA: Udane jednowarstwowe formowanie kolonoidów da pomiary TEER większe niż 115 Ω·cm2.

  1. Weź indywidualne wartości rezystancji netto i dobrze odejmij opór netto od tła. Wkładki do hodowli komórkowych pokryte membraną macierzy podstawnej dadzą odczyt netto około 100 Ω.
  2. Weź odjęte od tła pomiary rezystancji netto i pomnóż je przez pole wkładki do hodowli komórkowej. 24-dołkowa wkładka do hodowli komórkowej ma powierzchnię 0,33cm2.
  3. Jeżeli wartości wynoszą 115 Ω·cm2 lub więcej, należy przejść do dalszych prób doświadczalnych.

9. Wywoływanie stanu zapalnego w monowarstwach nabłonka za pomocą mediatorów stanu zapalnego

  1. Po utworzeniu udanych monowarstw dodaj mediatory stanu zapalnego do kultury po podstawowej stronie kultury. Przygotować jednowarstwowe podłoże mediatora stanu zapalnego, jak opisano w kroku 1.9, i dodać 400 μl do każdej studzienki na nowej 24-dołkowej płytce.
  2. Usuń pożywkę z wierzchołkowej strony wkładki do hodowli komórkowej i dodaj 150 μl mysiej pożywki jednowarstwowej bez Y-27632. Nie należy uzupełniać tej strony mediatorami stanu zapalnego. Jeśli jednak śmierć komórki wydaje się nadmierna, pozostaw Y-27632 na nośniku. Musi to zostać określone przez użytkownika końcowego.
  3. Przenieś wkładki do hodowli komórkowych na nową 24-dołkową płytkę i umieść je w studzienkach uzupełnionych monowarstwowym podłożem mediatora stanu zapalnego.
  4. Stymuluj monowarstwy mediatorami stanu zapalnego przez 24-72 godziny, w zależności od eksperymentu.
  5. Aby przetestować odpowiedzi na leki przy użyciu tego modelu zapalnego, należy uzupełnić jednowarstwowe podłoże po wierzchołkowej stronie wkładki do hodowli komórkowej wybranym lekiem. Lek może być dodawany w dowolnym momencie eksperymentu, w zależności od mechanizmu działania leku i dalszych parametrów, które mają być oceniane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System hodowli jelitowej okrężnicy 3D jest nieocenionym narzędziem do badania wewnętrznego wkładu nabłonka w homeostazę błony śluzowej jelit. Opisany protokół zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące izolowania krypt od myszy C57BL/6J (WT) w wieku 8 tygodni i ustanowienia długoterminowego systemu hodowli okrężnicy, którym można manipulować w wielu dalszych zastosowaniach. Po wyizolowaniu i poszyciu krypt w matrycy błony podstawnej, krypty wydają się gęste i wielokomórkowe w strukturze, gdy są wizualizowane za pomocą mikr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój organoidów zrewolucjonizował sposób, w jaki społeczność naukowa bada układy narządów in vitro , dzięki zdolności do częściowego odtworzenia struktury i funkcji komórkowej zwierzęcia lub człowieka w naczyniu. Co więcej, systemy organoidowe pochodzące od ludzi z chorobami stanowią obiecujące narzędzie dla medycyny spersonalizowanej, które może pomóc w podejmowaniu decyzji terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji krypty, który działa dobrze i wprowadzamy kluczowe kroki, które pozwalają na u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01DK120986 (do K.P.M.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4-μ M przezroczyste transwell, 24-dołkowerurki stożkowe Greiner Bio-one662-641
15 mlThermo Fisher 12-565-269
Probówki stożkowe 50 mlThermo Fisher 12-565-271
70-μ Filtr siatkowy MVWR76327-100
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010Koncentracja zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x)
B-27 suplement Invitrogen12587-010Koncentracja zapasów (50x); Stężenie końcowe (1x)
Pałeczki Zestaw elektrod do EVOWorld Precision InstrumentsSTX2
Corning Matrigel GFR Membrane MixCorning354-230Stężenie zapasu (100%); Stężenie końcowe (100%)
Ditiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-5GStężenie zapasów (1 m); stężenie końcowe (1,5 mM); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)
DMEM o wysokiej zawartości glukozyThermo Fisher11960-069Stężenie zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco bez wapnia i magnezuGibco 14190-144Koncentracja zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (ETDA)Sigma-AldrichE7889Stężenie podstawowe (0,5 m); Stężenie końcowe (30 mM)
Stężenie surowicy płodowej bydlęcejBio-TechneS11150H(100%); Stężenie końcowe (1%)
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus, białe, 25 x 75 mmThermo Fisher 12-550-15
G418InvivoGenant-ga-1Stężenie końcowe (400 &mikro; g/&mikro; L)
Odczynnik gentamycynyGibco/Fisher15750-060Stężenie podstawowe (50 mg / ml); Stężenie końcowe (250 μ g/mL)
GlutaMAX-1Fisher Scientific35050-061Stężenie zapasów (100x); Stężenie końcowe (1x)
HEPES 1 MGibco15630-080Stężenie zapasu (1 m); Stężenie końcowe (10 mM)
hIFNγR& D Systems285-IFStężenie zapasów (1000 ng/&mikro; L); Stężenie końcowe (10 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)
hIL-1 i beta;R& D Systems201-LBKoncentracja zapasów (10 ng/&mikro; L); Stężenie końcowe (20 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)
hTNF&alfa;R& D Systems210-TAStężenie zapasów (10 ng/&mikro; L); Stężenie końcowe (40 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)
Nadtlenek wodoru SigmaH1009(30%); stężenie końcowe (0,003%); Rozpuszczalnik (media do mycia myszy)
Hygromycyna B GoldInvivoGenant-hg-1Stężenie końcowe (400 &mikro; g/&mikro; L
) L-WRN Linia komórkowaATCCCRL-3276
mEGFNovusNBP2-35176Stężenie zapasów (0,5 i mikro; g/&mikro; L); Stężenie końcowe (50 ng/ml); Rozpuszczalnik (D-PBS + 1% BSA)
Suplement N-2Invitrogen17502-048Stężenie podstawowe (100x); Stężenie końcowe (1x)
N-acetylo-L-cysteinaSigma A9165-5GKoncentracja zapasów (500 mM); stężenie końcowe (1 mM); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)
NogginPeprotech250-38Stężenie podstawowe (0,1 ng / & mikro; L); Stężenie końcowe (100 ng/ml); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta + 0,1% BSA)
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher15140-122Stężenie podstawowe (100x); Stężenie końcowe (1x)
Szalki Petriego (sterylizowane; 100 mm x 15 mm) Polystrene jednorazoweVWR25384-342
Mikropłytki polistyrenowe, 24-dołkowe hodowle tkankowe, sterylneGreiner Bio-one5666-2160
R-SpondinR& D Systems3474-RS-050Koncentracja zapasów (0,25 &mikro; g/&mikro; L); Stężenie końcowe (500 ng/ml); Rozpuszczalnik (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE ExpressThermo Fisher12604-013Stężenie podstawowe (10x); Końcowa koncentracja (1x); Rozpuszczalnik (1 mM EDTA)
Ultraczysta woda Invitrogen10977-023Koncentracja zapasów (1x); Stężenie końcowe (1x)
Y-27632 dihyddrochlorek Abcamab120129Koncentracja zapasów (10 mM); Stężenie końcowe (10 &mikro; M); Rozpuszczalnik (woda ultraczysta)
stężenie akcji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
  3. Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
  4. Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222(2013).
  7. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
  8. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  9. Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
  12. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  13. Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102(2021).
  14. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678(2012).
  15. Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
  19. Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38(2019).
  20. Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
  21. Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202(2017).
  22. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
  23. Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054(2020).
  24. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  25. Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
  26. Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bariera nab onkowahodowla kolonoid wnieswoiste zapalne choroby jelitfunkcja barierowamediatory zapalnehodowla monowarstwynisza kom rek macierzystychprzesiewowe badanie lek w terapeutycznych

Powiązane artykuły