Artykuł metodologiczny

Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

DOI:

10.3791/64807

⸱

17 lutego 2023

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół opisujący, jak izolować ludzkie pęcherzyki jajnikowe z zamrożonej i rozmrożonej tkanki korowej w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jajnik jest niejednorodnym organem złożonym z różnych typów komórek. Aby zbadać mechanizmy molekularne zachodzące podczas folikulogenezy, lokalizację białek i ekspresję genów można przeprowadzić na tkance utrwalonej. Jednak, aby prawidłowo ocenić poziom ekspresji genów w ludzkim pęcherzyku, ta złożona i delikatna struktura musi zostać wyizolowana. W związku z tym opracowano dostosowany protokół opisany wcześniej przez laboratorium Woodruffa w celu oddzielenia pęcherzyków (oocytu i komórek ziarnistych) od otaczającego je środowiska. Tkanka korowa jajnika jest najpierw przetwarzana ręcznie w celu uzyskania małych fragmentów za pomocą dwóch narzędzi: krajalnicy do tkanek i rozdrabniacza tkanek. Tkanka jest następnie trawiona enzymatycznie z 0,2% kolagenazą i 0,02% DNazą przez co najmniej 40 minut. Ten etap mineralizacji odbywa się w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 i towarzyszy mu mechaniczne pipetowanie pożywki co 10 minut. Po inkubacji izolowane pęcherzyki pobiera się ręcznie za pomocą skalibrowanej pipety mikrokapilarnej pod mikroskopem. Jeśli mieszki włosowe są nadal obecne w kawałkach tkanki, zabieg kończy się ręczną mikrodypreparacją. Mieszki włosowe zbiera się na lodzie w pożywce hodowlanej i dwukrotnie przepłukuje się kropelkami roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami. Ta procedura trawienia musi być dokładnie kontrolowana, aby uniknąć pogorszenia stanu pęcherzyków. Gdy tylko struktura pęcherzyków wydaje się być uszkodzona lub po maksymalnie 90 minutach, reakcję zatrzymuje się roztworem blokującym o temperaturze 4 °C zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej. Należy pobrać co najmniej 20 izolowanych pęcherzyków (o wielkości poniżej 75 μm) w celu uzyskania odpowiedniej ilości całkowitego RNA po ekstrakcji RNA do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Po ekstrakcji kwantyfikacja całkowitego RNA z 20 pęcherzyków osiąga średnią wartość 5 ng/μL. Całkowite RNA jest następnie retrotranskrybowane do cDNA, a interesujące geny są dalej analizowane za pomocą RT-qPCR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jajnik to złożony organ złożony z funkcjonalnych i strukturalnych jednostek, w tym mieszków włosowych w korze i zrębu. Folikulogeneza, proces aktywacji, wzrostu i dojrzewania pęcherzyków włosowych od pierwotnego stanu spoczynku do dojrzałego pęcherzyka zdolnego do zapłodnienia i wspierania wczesnego rozwoju embrionalnego, jest szeroko badany w badaniach1. Odkrycie mechanizmów napędzających to zjawisko może poprawić opiekę nad płodnością kobiet2. Analizy utrwalonej tkanki ludzkiej pozwalają na ocenę ekspresji białek i lokalizacji genów w obrębie jednostek funkcjonalnych jajnika3,4. Potrzebne są jednak specjalne techniki dysocjacji pęcherzyków jajnikowych od otaczającej kory w celu dokładnej oceny poziomu ekspresji genów w pęcherzykach jajnikowych. W związku z tym, w poprzednim badaniu, opracowano technikę izolacji pęcherzyków, aby umożliwić analizę ekspresji genów bezpośrednio z jednostki funkcjonalnej jajnika5. Opracowano różne podejścia, takie jak trawienie enzymatyczne i/lub izolacja mechaniczna, a także mikrodysekcja wychwytywania laserowego, które umożliwiają izolację pęcherzyków w obrębie fragmentu tkanki6,7,8,9. Izolacja pęcherzyków jest szeroko stosowana, zarówno w ludzkiej tkance jajnika, jak i zwierzęcej, do oceny profili ekspresji genów pęcherzyków na wszystkich etapach rozwoju10,11,12. Jednak optymalna procedura izolacji powinna uwzględniać delikatną strukturę pęcherzyka w gęstej korze i dlatego powinna być wykonywana ostrożnie, aby uniknąć jakichkolwiek uszkodzeń7. Ten manuskrypt opisuje procedurę, zaadaptowaną z protokołu opisanego przez laboratorium Woodruffa, polegającą na izolowaniu ludzkich pęcherzyków z zamrożonej i rozmrożonej kory jajnika w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów13.

Pierwszym etapem izolacji pęcherzyków jajnikowych z zamrożonej tkanki ludzkiej jest procedura rozmrażania. Proces ten jest wykonywany w oparciu o protokół kliniczny stosowany do przeszczepiania kriokonserwowanej tkanki jajnika, jak opisano wcześniej14,15. Proces ten ma na celu usunięcie środków krioprotekcyjnych poprzez przepłukanie kory jajnika w zmniejszających się stężeniach pożywki. Następnie tkanka jest fragmentowana przed enzymatyczną i mechaniczną izolacją w celu pobrania mieszków włosowych. Mieszki włosowe w różnych stadiach można rozróżnić za pomocą mikroskopu stereoskopowego o dużym powiększeniu i dobrej jakości optyce, aby wyizolować te, które są interesujące. Każdy izolowany pęcherzyk jest mierzony za pomocą linijki zintegrowanej z mikroskopem, a pęcherzyki można łączyć zgodnie z ich etapem rozwoju: pęcherzyki pierwotne (30 μm), pęcherzyki pierwotne (60 μm), pęcherzyki wtórne (120-200 μm) i pęcherzyki antralne (>200 μm)16. Dalszą klasyfikację można przeprowadzić zgodnie z morfologią pęcherzyków: pęcherzyki pierwotne mają jedną warstwę spłaszczonych komórek ziarnistych (GC), pęcherzyki pierwotne mają jedną warstwę prostopadłościennych GC, pęcherzyki wtórne mają co najmniej dwie warstwy prostopadłościennych GC, a obecność wgłębienia wśród GC charakteryzuje stadium antralne. Po wybraniu interesujących nas pęcherzyków przeprowadza się ekstrakcję RNA. Ilość i jakość RNA są oceniane przed ilościową reakcją łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szpitala Erasme (Bruksela, Belgia). Pacjentka objęta tym protokołem została poddana kriokonserwacji tkanki jajnikowej (OTC) w celu zachowania płodności przed ekspozycją na chemioterapię w 2000 roku. Pacjentka podpisała świadomą pisemną zgodę na oddanie resztek zamrożonych tkanek do badań po zakończeniu okresu przechowywania.

1. Rozmrażanie kriokonserwowanej tkanki jajnika

  1. Przygotuj 6-dołkową płytkę zawierającą pięć roztworów do rozmrażania. Pierwsza studzienka zawiera 5 ml roztworu krioprotektantu składającego się z podłoża Leibovitz-15, sacharozy o sile 0,1 mol/l, dimetylosulfotlenku o stężeniu 1,5 mol/l (DMSO) i 1% albuminy surowicy ludzkiej (HSA). Kolejne studzienki zawierają 5 ml pożywki Leibovitz-15 o malejących stężeniach krioprotektantu: 1 mol/L, 0,5 mol/L i 2 x 0 mol/L DMSO,
    UWAGA: Roztwór krioprotektantu może się różnić w zależności od protokołu stosowanego w klinice leczenia niepłodności.
  2. Wyjąć fiolkę zawierającą fragment kory jajnika z ciekłego azotu zgodnie z zasadami bezpieczeństwa (rękawice kriogeniczne, okulary ochronne i zamknięte buty) i przechowywać probówkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 s.
  3. Zanurzyć fiolkę w podwójnie destylowanej wodzie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem, a następnie otworzyć fiolkę pod pionowym kapturem i bezpośrednio przenieść ją do pierwszego dołka płytki 6-dołkowej (na lodzie).
  4. Przenieść fragment kolejno do każdej studzienki 6-dołkowej płytki, z których każda zawiera zmniejszające się stężenie krioprotektantu w 5 ml pożywki Leibovitz-15. Delikatnie mieszaj tkankę w każdym podłożu przez 5 minut (na lodzie).

2. Izolacja mieszków włosowych

UWAGA: Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane przy użyciu materiałów wolnych od RNaz i pod pionowym kapturem.

  1. Przenieś rozmrożoną tkankę na kratkę Petriego o średnicy 2 mm wypełnioną 10 ml pożywki preparacyjnej (pożywka Leibovitz-15, pirogronian sodu [2 mmol/L], L-glutamina [2 mmol/L], HSA [0,3%], penicylina G [30 μg/ml] i streptomycyna [50 μg/ml]). W razie potrzeby dostosuj rozmiar tkanki za pomocą skalpela.
    UWAGA: W zależności od protokołu klinicznego rozmiar zamrożonej tkanki może wahać się od 8 mm x 4 mm x 1 mm do 4 mm x 2 mm x 1 mm. Do tego protokołu użyto dwóch pasków o wymiarach 4 mm x 2 mm x 1 mm.
  2. Ułóż trzy kawałki krajalnicy do tkanek, umieść fragment między dwoma blokami i przetnij fragment na pół za pomocą ostrza, przesuwając się po blokach, aby uzyskać dwa fragmenty o grubości 0,5 mm.
  3. Użyj rozdrabniacza do tkanek, aby pokroić fragment i uzyskać mniejsze kawałki. W razie potrzeby odetnij pozostałe kawałki ręcznie skalpelem, aż tkanka zostanie całkowicie rozbita.
  4. Przenieś rozdrobnioną tkankę na siatkowaną szalkę Petriego wypełnioną 7 ml pożywki trawiącej (pożywka hodowlana [pożywka McCoy's 5A, 3 mmol/L glutaminy, 0,1% HSA, 30 μg/ml penicyliny G, 50 μg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml transferyny, 4 ng/ml selenu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego] uzupełniona 0,2% kolagenazą i 0,02% DNazą).
  5. Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Co 10 minut wyjmować szalkę Petriego z inkubatora i przepłukiwać tkankę, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  6. Po 45 minutach inkubacji w pożywce wytrawiającej należy umieścić naczynie pod mikroskopem stereoskopowym o zakresie powiększenia 5x-6,3x, a pęcherzyki pobrać za pomocą pipety mikrokapilarnej. Wybierz interesujące Cię pęcherzyki i wyizoluj je, zasysając je pipetą doustną.
    UWAGA: Pipetowanie doustne należy wykonywać ostrożnie, aby uniknąć utraty materiału do rurki i zanieczyszczenia.
  7. Jeśli mieszki włosowe utknęły w kawałku kory mózgowej, należy je odizolować mechanicznie za pomocą dwóch strzykawek 27 G, odrywając korę końcówką strzykawek, aby uwolnić pęcherzyki ze zrębu.
    UWAGA: Nie dotykaj mieszków włosowych strzykawkami, aby uniknąć ich uszkodzenia.
  8. Przenieść mieszki włosowe z mikrokapilarą na 4-dołkową płytkę zawierającą krople 15 μl skalibrowanej pożywki hodowlanej pokrytej 500 μl kultury olejowej (1 do 10 pęcherzyków na kroplę). Ten krok utrzymuje żywotność mieszków włosowych podczas procesu pobierania. Pod koniec zabiegu przepłukać mieszki włosowe dwukrotnie przez 5 s za każdym razem do dwóch kropli po 15 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami (PBS) zalanego 500 μl kultury olejowej (na lodzie).
  9. Za pomocą pipety doustnej (maksymalnie 10 μl) zebrać 20 pęcherzyków z minimalną ilością PBS w pustej probówce i trzymać probówkę na lodzie.
    UWAGA: Dla stabilności RNA kluczowe jest wykonanie kroku 2.8 i kroku 2.9 na lodzie. Około 20 pęcherzyków (<75 μm) jest potrzebnych do uzyskania wystarczającej ilości RNA dla standardowego RT-qPCR (SYBR Green).
  10. Po maksymalnie 90 minutach inkubacji w pożywce wytrawiającej, zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając do płytki Petriego nadmiar zimnego (4 °C) roztworu blokującego (7,5 ml) złożonego z pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    UWAGA: Roztwór blokujący można dodać, gdy tylko eksperymentator zauważy mieszki włosowe przyklejające się do płytki lub uszkodzone pęcherzyki (asymetryczny kształt lub ciemniejsze pęcherzyki). Zaleca się wykonanie izolacji pęcherzyków w ciągu maksymalnie 2,5 godziny, aby uniknąć uszkodzenia pęcherzyków i wykonanie ekstrakcji RNA bezpośrednio po izolacji.

3. Ekstrakcja RNA

UWAGA: Ekstrakcja RNA odbywa się zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu do ekstrakcji RNA, dostosowując objętości elucji.

  1. Zawiesić izolowane pęcherzyki, dodając 100 μl roztworu do lizy dostarczonego z zestawem do ekstrakcji RNA do probówki zawierającej pęcherzyki pod kapturem chemicznym i wirować z dużą prędkością (2,500 obr./min), aby złamać strukturę pęcherzyków. Dodać 50 μl etanolu (100%) do probówki i krótko wirować z dużą prędkością.
    UWAGA: Ponieważ bufor do lizy zawiera 2-merkaptoetanol i kwas tiocyjanowy, ten krok należy wykonywać ostrożnie pod maską chemiczną.
  2. Przenieść całkowitą objętość probówki (około 160 μl) do zespołu wkładu mikrofiltra, składającego się z kolumny i probówki zbiorczej, i odwirować ją przez 10 s przy 16,363 x g w temperaturze 4 °C. Przemyć kolumnę 180 μl roztworu płuczącego 1, dostarczonego wraz z zestawem, i odwirować probówkę przez 10 s w temperaturze 16,363 x g w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 180 μl roztworu płuczącego 2/3, dostarczonego z zestawem, do kolumny i wirować przez 10 s przy 16,363 x g w temperaturze 4 °C. Wykonać ten krok dwukrotnie. Odwiruj probówkę po raz ostatni przez 1 minutę, aby wysuszyć filtr, i umieść nową probówkę zbiorczą pod wkładem.
  4. Przeprowadź elucję kwasów nukleinowych w dwóch etapach:
    1. Najpierw dodać 8 μl ciepłego roztworu elucyjnego (75 °C) do filtra, odczekać 1 minutę w temperaturze pokojowej i odwirować przez 30 s w temperaturze 16,363 x g w temperaturze 4 °C.
    2. Powtórz ten krok z 7 μl roztworu elucyjnego.
      UWAGA: Probówkę zawierającą wyluzowane kwasy nukleinowe należy przechowywać na lodzie. Aby uniknąć zanieczyszczenia DNA, zdecydowanie zaleca się dodatkowy etap degradacji DNA - krok 3.5.
  5. Inkubować probówkę z 2 j.m. DNazą i 1 buforem DNazy przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Blokować aktywność enzymatyczną za pomocą odczynnika do inaktywacji 1/10 DNazy przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Odwirować probówkę przez 1,5 minuty przy 16,363 x g w temperaturze 4 °C. Na koniec zbierz zawiesinę zawierającą RNA i przenieś ją do nowej probówki.
  7. Ocenić ilość RNA obecnego w próbce za pomocą spektrofotometru (oprogramowanie NanoDrop 2000 > Nucleic Acid > RNA). Użyj 1 μl roztworu elucyjnego jako ślepej próby i zmierz ilość RNA wyekstrahowanego z izolowanych pęcherzyków za pomocą 1 μl roztworu.
  8. Sprawdź stosunek 260/280 pod kątem czystości RNA (około 2,0). Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio dokonać jej transkrypcji retrokryminalnej w celu wykonania RT-qPCR.
    UWAGA: Aby ocenić integralność RNA, próbkę można przetworzyć za pomocą automatycznego systemu elektroforezy o wysokiej rozdzielczości przed lub po zamrożeniu w temperaturze -80 °C. W niniejszej pracy, po retrotranskrypcji, RT-qPCR wykonano w następującym cyklu:
    Utrzymaj scenę przez 20 s w 50 °C i 10 min w temperaturze 95 °C
    40 cykli PCR po 15 s w temperaturze 95 °C i 1 min w temperaturze 60 °C
    Etap krzywej topnienia trwający 15 s w temperaturze 95 °C, 1 min w temperaturze 60 °C, 30 s w temperaturze 95 °C i 15 s w temperaturze 60 °C

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tej procedury izolacji, eksperymentator może pobrać mieszki włosowe ze środowiska zrębu w celu przeprowadzenia określonych analiz ekspresji genów. Na podstawie wielkości i morfologii mieszków włosowych możliwe jest rozróżnienie różnych etapów folikulogenezy. Eksperymentator może wybrać interesujące go pęcherzyki w zależności od ich wielkości za pomocą dostosowanej pipety mikrokapilarnej. Dzięki zastosowaniu mikrokapilary o maksymalnej wielkości 75 μm możliwe jest odróżnienie pęcherzyków pierwotnych i pierwo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriokonserwacja tkanki jajnikowej jest obiecującym podejściem do zachowania płodności pacjentek z rakiem. W klinice rozmrożona tkanka korowa jest przeszczepiana z powrotem do pacjentki po remisji, co pozwala na wznowienie funkcji jajników i płodności19,20. Oprócz zastosowania klinicznego, resztkowe fragmenty jajników mogą być również przekazane do badań pod koniec okresu przechowywania w celu zbadania mechanizmów regulujących folikulogenezę. Co więcej, tkanka ta ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). I.D. jest pracownikiem naukowym w Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalka Petriego z siatką 2 mmCorning430196
2100 Narzędzie do bioanalizowaniaAgilentG2939BA
2100 Oprogramowanie ExpertAgilentwersja B.02.08.SI648
Płytka 4-dołkowaSigma AldrichD6789
Płytka 6-dołkowaCarl Roth  EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513
Kwas askorbinowySigma AldrichA4403
Zestawy probówek aspiratora do pipet mikrokapilarnychSigma AldrichA5177
WirówkaEppendorf5424R
Collagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
Odwrotna transkryptaza GoScriptPromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-GlutaminaSigma AldrichG7513
McCoy' s 5A + wodorowęglan + HepesLifeTechnologies12330-031
Rozdrabniacz do tkanek McIlwainStoelting51350
Mikrokapila RI EZ-Tips 200 &mikro; mCooperSurgical7-72-2200/1
Końcówki mikrokapilarne RI EZ-Tips 75 µ mOprogramowanie operacyjne CooperSurgical7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000cThermoFisherwersja 1.6
Spektrofotometr NanoDropThermoFisher2000/2000c
Penicylina GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR green master mixThermoFisherA46109
Podkłady: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Podkłady: HPRTF: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACACAGAGGGCTACAA
Podkłady: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
QPCR W CZASIE RZECZYWISTYM Quantstudio 3ThermoFisherA33779
Zestaw do izolacji RNAqueous-micro total RNAThermoFisherAM1931
SeleniumSigma AldrichS9133
Pirogronian soduSigma AldrichS8636
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ800
Siarczan streptomycynySigma AldrichS1277
SacharozaSigma AldrichS1888
Thermo Scientific Forma Series II  CO2  z płaszczem wodnym. inkubatoryThermoFisher3110
Krajalnica do tkanek Thomas Stadie-RiggsThomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
10652202001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
  3. Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
  4. Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31(2015).
  5. Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
  6. Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417(2011).
  7. Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71(2017).
  8. Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
  9. Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
  10. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
  11. McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423(2022).
  12. Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
  13. Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
  14. Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
  15. Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
  16. Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
  17. Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
  18. Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
  19. Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
  20. Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
  21. Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
  22. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
  23. Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
  24. Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
  25. Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
  26. Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
  27. Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
  28. Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
  29. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  30. Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
  31. Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
  32. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja mieszk wtkanka jajnikatrawienie enzymatycznekom rki granulosaekstrakcja RNART qPCRizolacja oocyt wfolikulogeneza

Powiązane artykuły