Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

Melody Devos; Joana Dias Nunes; Isabelle Demeestere

doi:10.3791/64807

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64807

⸱

17 lutego 2023

Melody Devos^*¹ , Joana Dias Nunes^*¹ , Isabelle Demeestere¹^,²

¹Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), ²Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół opisujący, jak izolować ludzkie pęcherzyki jajnikowe z zamrożonej i rozmrożonej tkanki korowej w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Streszczenie

Jajnik jest niejednorodnym organem złożonym z różnych typów komórek. Aby zbadać mechanizmy molekularne zachodzące podczas folikulogenezy, lokalizację białek i ekspresję genów można przeprowadzić na tkance utrwalonej. Jednak, aby prawidłowo ocenić poziom ekspresji genów w ludzkim pęcherzyku, ta złożona i delikatna struktura musi zostać wyizolowana. W związku z tym opracowano dostosowany protokół opisany wcześniej przez laboratorium Woodruffa w celu oddzielenia pęcherzyków (oocytu i komórek ziarnistych) od otaczającego je środowiska. Tkanka korowa jajnika jest najpierw przetwarzana ręcznie w celu uzyskania małych fragmentów za pomocą dwóch narzędzi: krajalnicy do tkanek i rozdrabniacza tkanek. Tkanka jest następnie trawiona enzymatycznie z 0,2% kolagenazą i 0,02% DNazą przez co najmniej 40 minut. Ten etap mineralizacji odbywa się w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂ i towarzyszy mu mechaniczne pipetowanie pożywki co 10 minut. Po inkubacji izolowane pęcherzyki pobiera się ręcznie za pomocą skalibrowanej pipety mikrokapilarnej pod mikroskopem. Jeśli mieszki włosowe są nadal obecne w kawałkach tkanki, zabieg kończy się ręczną mikrodypreparacją. Mieszki włosowe zbiera się na lodzie w pożywce hodowlanej i dwukrotnie przepłukuje się kropelkami roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami. Ta procedura trawienia musi być dokładnie kontrolowana, aby uniknąć pogorszenia stanu pęcherzyków. Gdy tylko struktura pęcherzyków wydaje się być uszkodzona lub po maksymalnie 90 minutach, reakcję zatrzymuje się roztworem blokującym o temperaturze 4 °C zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej. Należy pobrać co najmniej 20 izolowanych pęcherzyków (o wielkości poniżej 75 μm) w celu uzyskania odpowiedniej ilości całkowitego RNA po ekstrakcji RNA do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Po ekstrakcji kwantyfikacja całkowitego RNA z 20 pęcherzyków osiąga średnią wartość 5 ng/μL. Całkowite RNA jest następnie retrotranskrybowane do cDNA, a interesujące geny są dalej analizowane za pomocą RT-qPCR.

Wprowadzenie

Jajnik to złożony organ złożony z funkcjonalnych i strukturalnych jednostek, w tym mieszków włosowych w korze i zrębu. Folikulogeneza, proces aktywacji, wzrostu i dojrzewania pęcherzyków włosowych od pierwotnego stanu spoczynku do dojrzałego pęcherzyka zdolnego do zapłodnienia i wspierania wczesnego rozwoju embrionalnego, jest szeroko badany w badaniach¹. Odkrycie mechanizmów napędzających to zjawisko może poprawić opiekę nad płodnością kobiet². Analizy utrwalonej tkanki ludzkiej pozwalają na ocenę ekspresji białek i lokalizacji genów w obrębie jednostek funkcjonalnych jajnika³^,