Method Article

Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

DOI:

10.3791/64807

⸱

February 17th, 2023

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół opisujący, jak izolować ludzkie pęcherzyki jajnikowe z zamrożonej i rozmrożonej tkanki korowej w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jajnik jest niejednorodnym organem złożonym z różnych typów komórek. Aby zbadać mechanizmy molekularne zachodzące podczas folikulogenezy, lokalizację białek i ekspresję genów można przeprowadzić na tkance utrwalonej. Jednak, aby prawidłowo ocenić poziom ekspresji genów w ludzkim pęcherzyku, ta złożona i delikatna struktura musi zostać wyizolowana. W związku z tym opracowano dostosowany protokół opisany wcześniej przez laboratorium Woodruffa w celu oddzielenia pęcherzyków (oocytu i komórek ziarnistych) od otaczającego je środowiska. Tkanka korowa jajnika jest najpierw przetwarzana ręcznie w celu uzyskania małych fragmentów za pomocą dwóch narzędzi: krajalnicy do tkanek i rozdrabniacza tkanek. Tkanka jest następnie trawiona enzymatycznie z 0,2% kolagenazą i 0,02% DNazą przez co najmniej 40 minut. Ten etap mineralizacji odbywa się w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 i towarzyszy mu mechaniczne pipetowanie pożywki co 10 minut. Po inkubacji izolowane pęcherzyki pobiera się ręcznie za pomocą skalibrowanej pipety mikrokapilarnej pod mikroskopem. Jeśli mieszki włosowe są nadal obecne w kawałkach tkanki, zabieg kończy się ręczną mikrodypreparacją. Mieszki włosowe zbiera się na lodzie w pożywce hodowlanej i dwukrotnie przepłukuje się kropelkami roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami. Ta procedura trawienia musi być dokładnie kontrolowana, aby uniknąć pogorszenia stanu pęcherzyków. Gdy tylko struktura pęcherzyków wydaje się być uszkodzona lub po maksymalnie 90 minutach, reakcję zatrzymuje się roztworem blokującym o temperaturze 4 °C zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej. Należy pobrać co najmniej 20 izolowanych pęcherzyków (o wielkości poniżej 75 μm) w celu uzyskania odpowiedniej ilości całkowitego RNA po ekstrakcji RNA do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Po ekstrakcji kwantyfikacja całkowitego RNA z 20 pęcherzyków osiąga średnią wartość 5 ng/μL. Całkowite RNA jest następnie retrotranskrybowane do cDNA, a interesujące geny są dalej analizowane za pomocą RT-qPCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jajnik to złożony organ złożony z funkcjonalnych i strukturalnych jednostek, w tym mieszków włosowych w korze i zrębu. Folikulogeneza, proces aktywacji, wzrostu i dojrzewania pęcherzyków włosowych od pierwotnego stanu spoczynku do dojrzałego pęcherzyka zdolnego do zapłodnienia i wspierania wczesnego rozwoju embrionalnego, jest szeroko badany w badaniach1. Odkrycie mechanizmów napędzających to zjawisko może poprawić opiekę nad płodnością kobiet2. Analizy utrwalonej tkanki ludzkiej pozwalają na ocenę ekspresji białek i lokalizacji genów w obrębie jednostek funkcjonalnych jajnika3,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szpitala Erasme (Bruksela, Belgia). Pacjentka objęta tym protokołem została poddana kriokonserwacji tkanki jajnikowej (OTC) w celu zachowania płodności przed ekspozycją na chemioterapię w 2000 roku. Pacjentka podpisała świadomą pisemną zgodę na oddanie resztek zamrożonych tkanek do badań po zakończeniu okresu przechowywania.

1. Rozmrażanie kriokonserwowanej tkanki jajnika

  1. Przygotuj 6-dołkową płytkę zawierającą pięć roztworów do rozmrażania. Pierwsza studzienka zawiera 5 ml roztworu krioprotektantu składającego się z podłoża Leibovitz-15, sacharozy o sile 0,1 mo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tej procedury izolacji, eksperymentator może pobrać mieszki włosowe ze środowiska zrębu w celu przeprowadzenia określonych analiz ekspresji genów. Na podstawie wielkości i morfologii mieszków włosowych możliwe jest rozróżnienie różnych etapów folikulogenezy. Eksperymentator może wybrać interesujące go pęcherzyki w zależności od ich wielkości za pomocą dostosowanej pipety mikrokapilarnej. Dzięki zastosowaniu mikrokapilary o maksymalnej wielkości 75 μm możliwe jest odróżnienie pęcherzyków pierwotnych i pierwo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriokonserwacja tkanki jajnikowej jest obiecującym podejściem do zachowania płodności pacjentek z rakiem. W klinice rozmrożona tkanka korowa jest przeszczepiana z powrotem do pacjentki po remisji, co pozwala na wznowienie funkcji jajników i płodności19,20. Oprócz zastosowania klinicznego, resztkowe fragmenty jajników mogą być również przekazane do badań pod koniec okresu przechowywania w celu zbadania mechanizmów regulujących folikulogenezę. Co więcej, tkanka ta .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). I.D. jest pracownikiem naukowym w Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szalka Petriego z siatką 2 mmCorning430196
2100 Narzędzie do bioanalizowaniaAgilentG2939BA
2100 Oprogramowanie ExpertAgilentwersja B.02.08.SI648
Płytka 4-dołkowaSigma AldrichD6789
Płytka 6-dołkowaCarl Roth  EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513
Kwas askorbinowySigma AldrichA4403
Zestawy probówek aspiratora do pipet mikrokapilarnychSigma AldrichA5177
WirówkaEppendorf5424R
Collagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
Odwrotna transkryptaza GoScriptPromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-GlutaminaSigma AldrichG7513
McCoy' s 5A + wodorowęglan + HepesLifeTechnologies12330-031
Rozdrabniacz do tkanek McIlwainStoelting51350
Mikrokapila RI EZ-Tips 200 &mikro; mCooperSurgical7-72-2200/1
Końcówki mikrokapilarne RI EZ-Tips 75 µ mOprogramowanie operacyjne CooperSurgical7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000cThermoFisherwersja 1.6
Spektrofotometr NanoDropThermoFisher2000/2000c
Penicylina GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR green master mixThermoFisherA46109
Podkłady: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Podkłady: HPRTF: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACACAGAGGGCTACAA
Podkłady: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
QPCR W CZASIE RZECZYWISTYM Quantstudio 3ThermoFisherA33779
Zestaw do izolacji RNAqueous-micro total RNAThermoFisherAM1931
SeleniumSigma AldrichS9133
Pirogronian soduSigma AldrichS8636
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ800
Siarczan streptomycynySigma AldrichS1277
SacharozaSigma AldrichS1888
Thermo Scientific Forma Series II  CO2  z płaszczem wodnym. inkubatoryThermoFisher3110
Krajalnica do tkanek Thomas Stadie-RiggsThomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
10652202001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene ExpressionHuman FolliclesFollicle IsolationOvarian TissueEnzymatic DigestionGranulosa CellsRNA ExtractionRT qPCROocyte IsolationFolliculogenesis

Related Articles