Artykuł metodologiczny

Strategie badań przesiewowych małych cząsteczek od identyfikacji potencjalnych klientów do walidacji

DOI:

10.3791/64811

⸱

20 stycznia 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OMÓWIONE ARTYKUŁY:

Festa, F., Labaer, J. Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samodzielnie złożonych mikromacierzach białek ludzkich. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 152, E59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 148, E59928 (2019).

Gao, S. et al. Wysokoprzepustowy test do przewidywania toksyczności chemicznej za pomocą zautomatyzowanego profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 145, E59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 141, E58670 (2018).

Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy pojedynczego obrotu PCSK9. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 138, E58265 (2018).

Sullivan, C. et al. Wykorzystanie modeli zakażeń wirusem grypy A u ludzi do badania leków przeciwwirusowych i charakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 119, E55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Ocena odporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez matryce przeciwciał. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 139, E57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. Półwysokoprzepustowa adaptacja testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 150, E60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Rozwój inhibitorów oddziaływań białko-białko poprzez REPLACE: Zastosowanie do projektowania i rozwoju konkurencyjnych inhibitorów CDK non-ATP. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 104, E52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badanie przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 143, E58946 (2019).

Takakusagi, Y. Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy bioinformatycznej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 166, E61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. Wysokoprzepustowe profilowanie komórkowe ukierunkowanych związków degradacji białek przy użyciu linii komórkowych HiBiT CRISPR. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. 165, E61787 (2020).

Artykuł redakcyjny

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rewolucja genomiczna zaowocowała ogromną ilością wiedzy na temat związku między zaburzeniami genetycznymi a różnymi fenotypami choroby1. Doprowadziło to do oznaczenia wielu białek jako potencjalnych celów leków i pobudziło zainteresowanie odkryciem i rozwojem związków, które hamują te cele2. W tym kontekście pojawiły się różne strategie badań przesiewowych jako ważne podejścia do odkrywania związków trafionych, walidacji celu, pomiaru powinowactwa wiązania, selektywności, toksyczności i zaangażowania w komórkę docelową, a także reaktywności, stabilności i właściwości farmakokinetycznych związku. Niniejsza kolekcja przedstawia niektóre z postępów metodologicznych w tej dziedzinie, a jej celem jest zaprezentowanie wielu strategii, które można wykorzystać do badań przesiewowych i oceny biochemicznej i/lub biologicznej aktywności małych cząsteczek.

Kinazy białkowe reprezentują dużą rodzinę enzymów liczącą ponad 500 członków. Enzymy te są kluczowymi regulatorami wszystkich procesów komórkowych, a ich nieprawidłowe działanie wiąże się z licznymi chorobami3. W związku z tym stały się one przedmiotem intensywnego zainteresowania odkrywaniem leków, a co za tym idzie, opracowywaniem metodologii. W związku z tym cztery artykuły w tym zbiorze informują o postępach w tej dziedzinie. Festa i wsp. opisują platformę przesiewową do odkrywania inhibitorów kinaz, która wykorzystuje samoorganizujące się programowalne macierze białek kwasu nukleinowego (NAPPA)4. Macierze te wyświetlają pełnowymiarowe ludzkie kinazy i pozwalają na multipleksowane badania przesiewowe związków w dużej kolekcji kinaz, co pozwala nie tylko na identyfikację trafień, ale także na profilowanie selektywności. Tieman i wsp. opisują metodę opartą na mikromacierzy fosfoprzeciwciał opracowaną w celu badania przesiewowego zmian stanu fosforylacji w całej komórce jako odczytu aktywności inhibitora kinazy5. Może to prowadzić do wglądu w naturę szlaków, które stały się oporne na hamowanie, co jest ważnym parametrem istotnym dla zrozumienia odpowiedzi i skuteczności leku. Chen i wsp. opisują test cytometrii przepływowej do badania przesiewowego kolekcji inhibitorów kinaz w celu identyfikacji związków, które wpływają na sygnalizację receptora komórek T (TCR)6. Strategia ta doprowadziła do szybkiej identyfikacji kinaz zaangażowanych w sygnalizację TCR, wskazując na ich potencjał jako celów dla opracowywania leków immunoterapeutycznych. Wreszcie, aktywność wielu kinaz jest regulowana poprzez interakcje białko-białko (IPP), co sugeruje, że związki, które celują w te IPP, mogą być interesujące. Nandha Premnath i wsp. opisują metodę zwaną REPLACE (replacement with partial ligand alternatives using computational enrichment), która może być wykorzystana do opracowania konkurencyjnych IPP kinaz bez ATP poprzez przekształcenie cech spoiw peptydowych w małe cząsteczki, które angażują tę samą powierzchnię wiązania7.

Oprócz kinaz wiele innych enzymów odgrywa rolę w chorobach i jest poszukiwanych w procesie odkrywania leków. Dlatego interesujące są również metody zoptymalizowane pod kątem enzymów innych niż kinazy. Na przykład Stockman i in. opisują testy aktywności oparte na spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w celu odkrycia i oceny inhibitorów rybohydrolaz nukleozydowych pasożyta Trichomonas vaginalis8. Testy te mogą być również wykorzystywane do oznaczania wartości IC50 . Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem inhibitorów ATPazy, Radnai i in. opracowali metodę badań przesiewowych o półwysokiej przepustowości, która wykorzystuje sprzężony format testu enzymatycznego obejmujący dwa enzymy (kinazę pirogronianową i dehydrogenazę mleczanową), który ostatecznie przekłada aktywność ATPazy na wewnętrzną fluorescencję dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) w postaci odczytu9. W przeciwieństwie do wszystkich opisanych do tej pory enzymów, które są procesatywne i katalizują wiele etapów, konwertaza proproteinowa subtylizyna/keksyna typu 9 (PCSK9) jest proteazą jednoobrotową, która jest automatycznie hamowana przez swój substrat. To sprawia, że badania przesiewowe w kierunku inhibitorów PCSK9 są trudne, a Chorba i in. opisują wysokoprzepustową metodę opartą na komórkach, która łączy aktywność rozszczepienia PCSK9 z wydzielaną aktywnością lucyferazy jako odczyt, umożliwiając w ten sposób badania przesiewowe w kierunku inhibitorów10.

Oprócz znajdowania związków, które hamują aktywność różnych celów, dużym zainteresowaniem cieszą się również testy, które potwierdzają, że związek angażuje się w zamierzony cel w komórkach. Axelsson i wsp. opisują strategię walidacji zaangażowania celu w przylegających komórkach w oparciu o połączenie obrazowania o wysokiej zawartości za pomocą przeciwciał immunofluorescencyjnych i komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA)11. Test ten wykorzystuje izotermiczne wyzwanie cieplne do komórek potraktowanych dużą kolekcją związków w celu zidentyfikowania związków stabilizujących. Metoda, która może ocenić docelowe zaangażowanie i aktywność cząsteczek degradera, opracowana przez Richinga i wsp., wykorzystuje technologię znakowania HiBiT/LgBiT do produkcji białka luminescencyjnego i monitorowania parametrów degradacji poprzez spadek luminescencji12. Wreszcie, Takakusagi i wsp. opisują metodę walidacji interakcji białko-lek, która opiera się na wykorzystaniu wyświetlaczy peptydowych na bazie fagów do badań przesiewowych pod kątem wiązania między motywami peptydowymi wiążącymi lek a małymi cząsteczkami13. Ekran wyświetlania peptydów jest połączony z analizą bioinformatyczną w celu sprawdzenia wiązania docelowego.

Kolejną warstwą walidacji małych cząsteczek jest charakterystyka ich efektów w modelach zwierzęcych. Zbiór ten obejmuje dwie takie metody, jedną, która wykorzystuje modele zakażenia wirusem grypy A u ludzi (Danio rerio) do oceny skuteczności związków o działaniu przeciwwirusowym, a także odpowiedzi immunologicznej gospodarza14, a druga wykorzystuje Caenorhabditis elegans jako model do profilowania toksyczności związków15. Oba te badania podkreślają potrzebę zoptymalizowanych metod, które mogą ocenić skuteczność i toksyczność in vivo.

Podsumowując, odkrywanie i opracowywanie leków to potężne procesy z licznymi wąskimi gardłami, wyzwaniami i wysokim prawdopodobieństwem niepowodzenia. Ponadto ciągłe obciążenie chorobami, czy to w obszarze chorób zakaźnych, gdzie liczba patogenów lekoopornych rośnie w zastraszającym tempie, czy też w obszarach coraz częstszego występowania chorób przewlekłych i chorób związanych ze starzeniem się społeczeństwa, wymaga naszej ukierunkowanej uwagi i działań. W tym zbiorze przedstawiono kilka metod, które mają na celu przyspieszenie odkrywania, walidacji i charakterystyki leków. W przyszłości spodziewamy się dalszych innowacji w tej dziedzinie, zwłaszcza tych mających na celu poprawę przepustowości badań przesiewowych, zwiększenie różnorodności bibliotek chemicznych oraz opracowanie modeli in vivo kompatybilnych z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi (HTS). Co więcej, przepływy pracy, które zapewniają całościowy obraz siły działania, selektywności, swoistości, skuteczności i toksyczności na szybszą i mniejszą skalę, mogą być szczególnie pomocne.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.K. jest płatnym konsultantem dla Life Science Editors.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.K. jest częściowo wspierany przez NCI T32 CA236754.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Validation StrategiesKinase Inhibitor ScreeningNMR based Activity AssaysChemical Toxicity PredictionAutomated Phenotypic ProfilingHigh Content ImagingLuciferase AssayAntiviral Drug ScreeningProtein protein Interaction InhibitorsChemical Inhibitor LibrariesDrug protein InteractionsT cell Receptor Signaling

Powiązane artykuły