Fizjologiczna charakterystyka holobionta koralowca przy użyciu nowego narzędzia do mikrorespirometrii

Podsumowanie

Ten protokół opisuje budowę i działanie systemu mikro-respirometrii, który może być wykorzystany do zbadania fizjologicznych cech holobiontu koralowca.

Streszczenie

Aktywność metaboliczna, definiowana jako suma procesów organizmu związanych z energią, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji i ewolucji życia na Ziemi. Pomiar tempa metabolizmu organizmów jest zatem w centrum wyjaśniania stanów fizjologicznych organizmów, ich ról ekologicznych oraz wpływu zmian środowiskowych na gatunki w ekosystemach lądowych i wodnych. Na rafach koralowych pomiary metabolizmu wykorzystano do ilościowego określenia symbiozy funkcjonującej między koralowcami a ich obligatoryjnymi symbiontami glonów (Symbiodiniaceae), a także do oceny, w jaki sposób stresory środowiskowe, w tym zmiany klimatyczne, wpłyną na zdrowie koralowców. Pomimo tego znaczenia brakuje metod, a tym samym danych, odnoszących się do pomiarów tempa metabolizmu u potomstwa koralowców, prawdopodobnie ze względu na ich niewielkie rozmiary. Aby wypełnić tę lukę, badanie to miało na celu opracowanie niestandardowego zestawu do pomiaru oddychania w małych (zakres wielkości milimetrów) ekosystemach zwierząt morskich. Ten niski koszt i łatwa konfiguracja powinna pozwolić na lepszy pomiar tempa przemiany materii. Będzie to miało zasadnicze znaczenie dla stosowanych badań ekologicznych wykorzystujących produkcję płciową koralowców do odbudowy rafy.

Wprowadzenie

Oddychanie jest krytycznym pomiarem biologicznym, który sygnalizuje ogólną aktywność metaboliczną organizmu, ale podobnie jak inne krytyczne cechy (wzrost), jest trudny do zmierzenia w małych organizmach¹. Oddychanie można zdefiniować jako utlenianie cząsteczek organicznych za pomocą tlenu. Proces ten generuje energię chemiczną potrzebną do funkcjonowania komórek (tj. metabolizmu), która jest niezbędna do przetrwania organizmów. Alternatywnie, metabolizm beztlenowy powoduje dług tlenowy². Częstość oddechów można określić za pomocą optod, które mierzą zużycie (a tym samym spadek) stężenia tlenu w czasie w zamkniętej komorze, praktyka ogólnie znana jako respirometria³. Biorąc pod uwagę, że większość organizmów nie magazynuje tlenu, tempo metabolizmu można wywnioskować na podstawie bezpośredniej korelacji między oddychaniem a zużyciem węgla. Z tego powodu tempo oddychania może być przeliczone na dzienne zużycie węgla, co informuje o krytycznych funkcjach metabolicznych, takich jak wzrost, reprodukcja i zdolność do utrzymania homeostazy metabolicznej w czasach stresu środowiskowego^4,5, w tym warunki fali upałów, które zazwyczaj prowadzą do stresu lub blaknięcia koralowców.

Rafy koralowe kurczą się globalnie w coraz szybszym tempie. Zwierzę koralowe jest domem dla konsorcjum partnerów (w tym bruzdnic Symbiodiniaceae, grzybów, bakterii i wirusów), wspólnie określanych jako "holobiont"⁶. Wraz ze wzrostem temperatury oceanów, koralowce, a tym samym rafy koralowe, znajdują się pod coraz większą presją, aby przetrwać, ponieważ wysokie temperatury prowadzą do utraty bruzdnic Symbiodiniaceae (zwanych dalej symbiontami), zjawisko znane jako bleaching⁷. Wiele składników odżywczych jest w inny sposób niedostępnych dla koralowców w oligotroficznych wodach tropikalnych, w tym nieorganiczny azot i fosfor⁸. Aby sobie z tym poradzić, koralowce tworzą obowiązkową symbiozę żywieniową ze swoimi symbiontami bruzdnic (Symbiodiniaceae), które dostarczają większość składników odżywczych potrzebnych gospodarzowi koralowca do przetrwania i odkładania ich szkieletów z węglanu wapnia⁹. Funkcjonująca symbioza może charakteryzować się wysokim poziomem współdzielenia węgla między partnerami^10,11, a regulacja symbiozy obejmuje dynamiczną homeostazę¹².

Podczas stresu cieplnego, ta dynamiczna regulacja i komunikacja są zakłócane, co skutkuje dysbiozą i bieleniem (przejrzane w reference¹³). Pomiary metaboliczne, takie jak fotosynteza i oddychanie, mają zatem potencjał do wyjaśnienia zarówno zdrowych, jak i nieregulowanych, dysbiotycznych stanów koralowców, a dokładny pomiar tych procesów w całej ontogenezie ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcjonowania organizmu. Jest to szczególnie ważne, ponieważ częstotliwość i skala masowych zdarzeń bielenia rośnie, co może wpływać na zmiany w dzieleniu się składnikami odżywczymi z symbiontów, w przypadku których stwierdzono, że transfer węgla zmniejsza się wraz ze wzrostem temperatury¹⁴. Może to być spowodowane mechanizmami kierowanymi przez sekwestrację składników odżywczych przez symbiont lub z twardych fizjologicznych kompromisów (zwiększona tolerancja termiczna, ale spadek przeżywalności gospodarza^15,16,17). Zakłócenia w symbiozie mogą wynikać zarówno z symbiontu, jak i gospodarza, chociaż głównym czynnikiem jest prawdopodobnie nieprawidłowe działanie komórkowe symbiontu¹⁸. Jednak stres spowodowany wzrostem temperatury wody morskiej destabilizuje tę symbiozę; Udział węgla między symbiontem a gospodarzem jest zmniejszony^19,20, co może doprowadzić do głodu koralowców. Może to być odzwierciedlone w zmniejszonych zapasach lipidów i węglowodanów w koralowcach z powodu zwiększonego użycia gospodarza ("zwiększony katabolizm związanego węgla"), prawdopodobnie z powodu zmniejszonego udziału symbiontów¹¹. Wraz z wkładem fotosyntezy i oddychania symbiontów koralowców, oddychanie zwierzęcia koralowego jest ważną miarą zrozumienia zdrowia koralowców, wpływu bielenia i wymiany składników odżywczych między tymi partnerami oraz wzrostu holobiontu, fenotypu istotnego dla przetrwania zmian środowiskowych^8,21,22. Wreszcie, biorąc pod uwagę, że wiele koralowców jest symbiotycznych, zastosowanie respirometrii do scharakteryzowania fotosyntezy oprócz oddychania jest szczególnie przydatne do kontekstualizacji proporcji P:R i zrozumienia, czy symbioza jest stabilna, czy nie (np. reference²³).

Zmiany środowiskowe powodują zatem przesunięcia w budżetach energetycznych koralowca i jego symbiontów, prowadząc do różnic we wzroście¹⁴. Aby sobie z tym poradzić, gospodarz koralowca może zwiększyć oddychanie i zużycie lipidów, aby zaspokoić swoje wymagania metaboliczne; Stres cieplny może zmniejszyć produktywność netto o 60% z powodu zwiększonego oddychania¹⁴, mierzonego zmianą rozpuszczonego tlenu. Symbiodiniaceae mogą również zwiększać asymilację azotu i zatrzymywanie węgla^14,24, a następnie wykorzystać te rezerwy do przesunięcia energii w kierunku własnych mechanizmów naprawczych i ochronnych^25,26. Równowaga N i C jest ważna dla regulacji wzrostu, a w szczególności P²⁷, co może objawiać się dynamiczną regulacją obfitości symbiontów. Rzeczywiście, dowody zebrane od koralowców na dużych obszarach raf (>1000 km) sugerują, że gospodarze mają zdolność do ograniczania wzrostu symbiontów poprzez regulację P, chociaż różni się to w zależności od gatunku koralowca²⁷.

Podsumowując, badania te sugerują wzrost tolerancji na ciepło przy jednoczesnym spadku produkcji lub translokacji składników odżywczych (tj. skłonności do symbiozy) spowodowanym zmianami środowiskowymi. Skuteczne metody pojedynczego młodocianego osobnika, takie jak ilościowe określanie zużycia tlenu za pomocą mikrorespirometrii, powinny być zatem wykorzystywane do zrozumienia podstawowych mechanizmów związanych z metabolizmem, a następnie stosowane do kwestii ochrony, takich jak zrozumienie nabywania tolerancji na ciepło. Jest to tutaj przedstawione jako narzędzie mikrorespirometryczne do pomiarów fizjologicznych, mające na celu zbadanie relacji żywieniowych między młodocianymi koralowcami a ich symbiontami glonów, ale odpowiednie dla innych małych organizmów morskich.

Użycie lub produkcję tlenu przez organizmy można zmierzyć, umieszczając je w indywidualnych, hermetycznie zamkniętych komorach respirometrycznych lub 'respirometrach' (zwanych dalej komorami), gdzie zmiana tlenu jest mierzona za pomocą optodów³. Optody to sondy, które mierzą stężenie tlenu za pomocą impulsów świetlnych, a rejestrowanie pomiarów w czasie umożliwia obliczenie szybkości oddychania i/lub fotosyntezy. W praktyce pomiar oddychania jest podobny do pomiaru fotosyntezy u koralowców, z tą różnicą, że koralowce są inkubowane w całkowitej ciemności. Odjęcie całkowitego dziennego oddychania koralowców i symbiontów od całkowitej dziennej fotosyntezy daje różnicę tlenu (delta tlenu)^2,3. Ogólnie rzecz biorąc, organizmy zużywają więcej tlenu niż produkują, co powoduje deficyt. Można to przeliczyć na ekwiwalenty węgla, ponieważ tlen i węgiel są zużywane w stałym stosunku². Nadwyżka węgla może być wykorzystana przez koralowce do wzrostu, syntezy śluzu i rozmnażania oraz innych niezbędnych potrzeb metabolicznych¹².

Ten protokół opisuje metodę mikrooddychania (Rysunek 1), która została zastosowana do pomiaru szybkości oddychania (R) dla poszczególnych młodych koralowców przy użyciu specjalnie wykonanej szklanej komory o pojemności 1,5 ml (fiolka z gwintem GL25 i wysokością 20 mm, z wypukłością/grzbietem, płasko szlifowanym brzegiem i nakrętką z otworem; patrz Tabela Materiałów) wypełniona przefiltrowaną wodą morską o grubości 0,5 μm. Optody światłowodowe (patrz Tabela Materiałów) zostały włożone do każdej komory przez otwór z boku pokrywy. Każdy pojedynczy koralowiec został przymocowany nad platformą mieszadła przepływowego o twardej siatce nad mieszadłem magnetycznym, aby zapewnić odpowiednie mieszanie wody w komorze. W reprezentatywnym przykładzie tutaj dwie kontrole lub "ślepe próby" (komory, które były identyczne, z wyjątkiem obecności próbki) były mierzone równolegle z trzema komorami na próbki, ponieważ mieliśmy wiele kontrolerów działających jednocześnie. Jednak przykład konfiguracji (Rysunek 2) pokazuje użycie tylko czterech kanałów; Wartość tę można zwiększyć za pomocą wielu sterowników i wielu stanowisk przepływowych. Temperaturę można również kontrolować w tym systemie, zanurzając każdą komorę w specjalnie przygotowanej łaźni wodnej z zaprogramowanymi temperaturami wody (27 °C dla kontroli lub 31 °C dla stresu wysokiej temperatury w przykładowych danych tutaj) za pomocą systemu przepływu recyrkulacyjnego (ciągły, łagodny przepływ ustawiony na 75 l/h). Platforma płyty mieszadła i płyta mieszadła z kołami zębatymi mogą mieć dowolny rozmiar i mogą być tak duże lub tak małe, jak to wymagane, aby pomieścić liczbę szklanych komór. W tym przykładzie platforma i płyta miały wymiary około 34 cm x 26 cm x 3 cm (tabela materiałów). Kalibrację optody przeprowadzano przed każdym uruchomieniem przy użyciu dwóch roztworów wzorcowych reprezentujących 0% i 100% nasycenia tlenem przy odpowiedniej temperaturze wody i zasoleniu dla tego eksperymentalnego ustawienia.

Protokół

1. Ustawienie sprzętu i koralowców w komorach oddechowych

UWAGA: Gotowe do reprodukcji koralowce (tj. te, które miały różowawo zabarwione wiązki jaj/plemniki widoczne z rozdrobnionych gałęzi kolonii gatunku Acropora tenuis) zostały usunięte z rafy na Magnetic Island (19° 6.249'S; 146° 51.728'E) w dniu pełni księżyca w październiku 2018 roku (numer zezwolenia: G12/35236.1), zebrane, i przyniesiono do laboratorium w celu tarła koralowców, gdzie hodowano i hodowano młode koralowce.

1. W dniu pomiarów połączyć dwie płyty kąpieli wodnej za pomocą niebieskiej rurki polietylenowej i łączników (patrz Tabela materiałów; Rysunek 1 [5], Rysunek 2A,B). Będą one służyć jako inkubatory po podłączeniu niebieskiej rury polietylenowej do podgrzewacza wody/agregatu chłodniczego. Upewnij się, że płyta silnika jest wyraźnie widoczna przez przezroczyste płytki kąpieli wodnej, gdy komory respirometryczne nie są na swoim miejscu.
2. Podłącz dwa węże do podgrzewacza wody/agregatu chłodniczego (patrz tabela materiałów). Włączyć podgrzewacz wody/agregat chłodniczy, a następnie ustawić żądaną temperaturę eksperymentalną (27 °C lub 31 °C).
3. Podłącz podstawę łaźni wodnej (krok 1.1) do płyty silnika podstawy za pomocą kół zębatych magnetycznych (Rysunek 1 [6, 7] i Rysunek 3A), a następnie podłącz ten zespół do źródła zasilania (Rysunek 3B). Włącz źródło zasilania, aby aktywować koła zębate, które aktywują mieszadła w komorach.
4. Moduluj przepływ wody zgodnie z wymaganiami (np. ciągły, łagodny przepływ ustawiony na 75 l/h z powolnym mieszaniem przy 30 obr./min) za pomocą pokręteł łącznika zaworu (Rysunek 3C).
5. Aby zmontować komorę respirometryczną, dodaj kulkę magnetyczną (Rysunek 1 [1.5]) do szklanej komory (Rysunek 1 [1.6]), a następnie nieprzezroczystą plastikową podstawę stojaka przepływowego (Rysunek 1 [1.4]) do szklanej komory (Rysunek 4A). Wielkość komory i koralika magnetycznego będzie zależeć od organizmu i systemu badawczego, który Cię interesuje.
   UWAGA: W plastikowej podstawie znajdują się otwory, które umożliwiają przepływ i cyrkulację wody z ruchu koralika magnetycznego w dnie.
6. Przyklej koralowiec za pomocą kleju akwariowego (patrz Tabela materiałów) do czarnej opaski zaciskowej umieszczonej w plastikowej podstawie (Rysunek 4B-D). Aby to zrobić, najpierw przyklej młodocianego koralowca do kawałka czarnego plastiku, a następnie przyklej ten kawałek do plastikowej podstawy. Po bezpiecznym przymocowaniu koralowca (utwardzenie kleju jest prawie natychmiastowe), przykręć pokrywkę z O-ringiem (Rysunek 4A) do szklanej komory. Wykonaj te czynności pod wodą w oddzielnej misce, aby upewnić się, że w komorze respirometrycznej nie ma powietrza.
   UWAGA: Objętość wody w respirometrze (tj. objętość efektywna = 1,5 ml) została określona poprzez całkowite zanurzenie komory pod wodą. Zakłada się, że w stosunku do objętości wody, przemieszczenie od masy/gęstości bardzo małego koralowca jest znikome. Probówka do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml jest pokazana tutaj dla skali (Rysunek 4A).
7. Mocno umieść komory w łaźniach wodnych (Rysunek 5A). Upewnij się, że szklane komory mają kontakt z wodą o kontrolowanej temperaturze na czas eksperymentu.
8. Podłącz światłowodowe O₂ (patrz Tabela materiałów) tak, aby stykały się z punktami czujnika tlenu (zwanymi dalej punktami; patrz Tabela materiałów), wkładając je do otworu wywierconego z boku komór pokrywy. Te małe plamki są wrażliwe na tlen i wykrywają i przesyłają sygnał z wnętrza komory przez światłowodowy.
   1. Dodaj taśmę hydrauliczną (biała cienka taśma samouszczelniająca), aby dobrze przylegał i pozostał mocno w komorze wodnej. Upewnij się, że pojedynczy koral jest widoczny (jak widać na Rysunek 5B), z brązowymi mackami skierowanymi do góry, wewnątrz komory (Rysunek 5B, Wideo 1).
      UWAGA: Szacunkowe koszty elementów w aparacie przedstawiono w tabeli 1.

2. Standardowa procedura operacyjna pomiaru oddechu za pomocą systemu O₂

1. Otwórz oprogramowanie do pomiaru tlenu (patrz Tabela materiałów).
2. Zmierz temperaturę w pomieszczeniu, w którym zostanie przeprowadzona kalibracja. Będzie to potrzebne później na etapie kalibracji (krok 2.8).
3. Zamontuj czujniki optyczne i nasadki. Aby to zrobić, podłącz wszystkie światłowody do pasującego portu w module O₂. Upewnij się, że zaślepka 1 jest dopasowana do czujnika 1, zaślepka 2 do czujnika 2 i tak dalej.
4. Aby ustawić komory do kalibracji, najpierw zwilż kawałek czystej gąbki odrobiną wody z odwróconej osmozy (RO) i włóż go do każdej komory.
   UWAGA: Gąbka nie powinna kapać, tylko być wilgotna. Może kapać na miejsce światłowodu. Upewnij się, że miejsce nie jest mokre przed przejściem do następnego kroku.
5. Umieść komory do góry nogami za pomocą pasującego światłowodu (Rysunek 6). Pozwoli to na odkręcenie komory bez dotykania światłowodu i dodanie siarczynu sodu do kalibracji 0%.
6. Sprawdź sygnał każdego czujnika przed rozpoczęciem kalibracji. Przejrzyj wszystkie zakładki w interfejsie oprogramowania i sprawdź wartość sygnału (lewy górny róg) (Rysunek 7A), upewniając się, że nie różnią się one znacząco. Należy zapoznać się z instrukcją O₂ w celu uzyskania dopuszczalnych wartości dla stanowiska doświadczalnego (w zależności od organizmu i warunków będących przedmiotem zainteresowania). Dla tej konkretnej konfiguracji, w temperaturze pokojowej 25,3 °C, dopuszczalny jest FTC (punktowy przepływ tlenu przez normalny zakres komórki) wynoszący 20,59 przy sygnale 179,5.
7. Otwórz program i sprawdź ustawienia w oprogramowaniu, aby potwierdzić, że są poprawne, jak opisano poniżej. Jeśli wyskakujące okienko nie pojawi się natychmiast po otwarciu programu, można to zrobić, klikając przycisk Ustawienia w lewym dolnym rogu interfejsu oprogramowania.
8. Sprawdź, czy zewnętrzny czujnik temperatury jest włączony (Rysunek 7B). Zmień ustawienie na Stała temperatura (Rysunek 7C). Następnie dodaj wartość temperatury w pomieszczeniu i kliknij kopiuj ustawienie do wszystkich innych kanałów.
9. Zmień ustawienie na Zmniejsz dryft sygnału (Rysunek 7C). Następnie wybierz pozycję Ustawienia czujnika i wybierz poziom 2. W przeciwnym razie, jeśli używasz małych objętości, dryft będzie tak duży, że trudno będzie go skalibrować.
10. Sprawdź ogólne ustawienia kanałów. Naciśnij przycisk OK, jeśli jest odpowiedni. Kliknij opcję Kopiuj ustawienia do wszystkich kanałów, a następnie kliknij przycisk OK.
11. Skalibruj czujniki. Aby skalibrować kanał 1, przejdź do zakładki Kanał 1 i naciśnij przycisk Kalibruj. Wybierz 2-punktowy w wodzie lub wilgotnym powietrzu.
12. W celu kalibracji "powietrznej" zanurz kawałek pianki w wodzie, umieść go w komorze i poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje (patrz zdjęcia przed i po kalibracji powietrza). Gdy sytuacja się ustabilizuje, naciśnij "ustaw powietrze". Kliknij przycisk powietrza > Kalibruj > ustaw powietrze.
13. Ustaw kalibrację 0% i 100% (Rysunek 7D). Wyjmij komorę z nasadki i umieść ją w następnej nasadce, tak aby sygnał kalibracji powietrza był gotowy po zakończeniu kalibracji 0% w pierwszym czujniku. Użyj pipety transferowej i napełnij nakrętkę 2% siarczynem sodu. Poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje.
    UWAGA: Stabilizacja sygnału zwykle zajmuje więcej czasu w porównaniu z kalibracją powietrza. Jeśli pojawi się komunikat ostrzegawczy informujący, że "wartości są poza typowym zakresem", upewnij się, że siarczyn sodu jest świeży. Powtórz ten sam proces kalibracji dla wszystkich kanałów. Przygotuj siarczyn sodu, dodając 2 g do 100 ml wody RO.
14. Po zakończeniu kalibracji należy dobrze wypłukać komory oddechowe i osuszyć komory oraz nasadki. Upewnij się, że w otworze światłowodowym nie ma wody.
15. Umieść organizm (w tym przykładzie pojedyncze młode koralowce) w komorach oddechowych i zamknij pokrywkami. Zakładając pokrywy, upewnij się, że robisz to, gdy komory są całkowicie zanurzone i w środku nie ma absolutnie żadnego powietrza.
16. Umieść komory mocno w płytce mieszającej i podłącz światłowody.
17. Włącz zasilanie. Upewnij się, że woda w komorach jest całkowicie wymieszana. Ustaw temperaturę w chłodziarce/grzałce na wybrane temperatury eksperymentalne.
18. Włącz pompę i grzałkę (kroki 1.2 i 1.4).
19. Naciśnij log w interfejsie oprogramowania pomiarowego O₂, aby rozpocząć nagrywanie.

Wyniki

Przetwarzanie i analiza danych
Chociaż istnieje wiele metod przetwarzania surowych danych z eksperymentów respirometrycznych, zaleca się użycie pakietu R respR²⁸. Zgodnie z powyższymi protokołami, które opowiadają się za otwartą nauką i odtwarzalnością, pakiet ten umożliwia udostępnianie przetwarzania i analizy danych w łatwej do odtworzenia formie i został zaprojektowany z myślą o tym. Jest to bezpłatna platforma typu open source i niezależna od systemu sond, którą można łatwo zainstalować z CRAN lub GitHub. Pełny kod i przykłady dla respR są utrzymywane i można je znaleźć na stronie https://github.com/januarharianto/respR.

Pakiet respR posiada funkcje do importu, wizualizacji i kontroli jakości danych respirometrycznych, a także do obliczania częstości oddechów automatycznie lub z ręcznie wybranych regionów. Może również dostosować współczynniki oddychania w tle i współczynniki konwersji na powszechnie używane jednostki wyjściowe. Kroki przetwarzania danych z systemu mikrorespirometrii są szczegółowo opisane poniżej. W tym badaniu jako przykład wykorzystano dane z systemu respirometrii, ale pakiet akceptuje również dane wejściowe z większości dostępnych na rynku systemów sond tlenowych, a także ogólnych obiektów danych R. Więcej szczegółów na temat pakietu, w tym pełną dokumentację i samouczki, można znaleźć na stronie pakietu pod adresem https://januarharianto.github.io/respR/index.html.

Importowanie surowych danych
Importowany jest nieprzetworzony plik wyjściowy (.txt). respR rozpoznaje format i analizuje go do ogólnej ramki danych języka R, która może być używana w kolejnych funkcjach. Należy jednak pamiętać, że jest to opcjonalne; te pliki i praktycznie dowolne dane szeregów czasowych tlenu mogą być również importowane przy użyciu funkcji podstawowych (podanych poniżej) przez każdego, kto ma podstawową wiedzę na temat R.

#load respR
Biblioteka (respR)

#Import ---
Dane <- import_file("file.txt")
Wykryto plik #Firesting-Pryo

Inspekcja i wizualizacja danych
Istotną częścią każdego zadania analizy danych jest wykreślenie i sprawdzenie danych w celu wyszukania oczywistych anomalii lub wzorców, a nawet po prostu pomoc w ich zrozumieniu. Użyto tutaj funkcji inspect (Rysunek 8A), która sprawdza problemy typowe dla danych respirometrycznych, takie jak wartości nieliczbowe lub braki danych.

#inspect pojedynczą kolumnę tlenu
Insp <-inspect(dane, czas = 3, tlen = 8, szerokość = 0,2)

Ta funkcja również wykreśla szeregi czasowe tlenu i oblicza szybkość toczenia (dolny panel), aby pomóc wyjaśnić, jak ta szybkość może się zmieniać w trakcie eksperymentu. Te wykresy kroczących szybkości pomagają informować o tym, które obszary tych krzywych szybkości powinny zostać wyodrębnione. W przypadku standardowych lub rutynowych wskaźników przemiany materii pożądane regiony to te, w których tempo wykazuje stabilność (np. po około punkcie czasowym 3,000; Rysunek 8B).

Tutaj spadek tlenu staje się wykrywalny dopiero po około 200 rzędzie w pełnym panelu szeregów czasowych. Wzorce takie jak ten są bardzo powszechne w danych respirometrycznych; Często występuje wydłużony okres niestabilności na początku eksperymentu, gdy system stabilizuje się, a próbka aklimatyzuje się do warunków eksperymentalnych. Zaleca się, aby stawki były wyodrębniane z szeregów czasowych dopiero po tej początkowej niestabilności, co również podkreśla znaczenie wizualizacji.

Extract rates
respR ma dwie funkcje do wyodrębniania częstości oddechów. Pierwszą z nich jest funkcja calc_rate(), która umożliwia ręczne wyodrębnienie szybkości poprzez określenie regionu czasu, wiersza lub poziomu tlenu. Jest to bardzo powszechne w analizach respirometrycznych i jest całkowicie akceptowalną metodą określania wskaźnika, o ile kryteria wyboru są ustalane i konsekwentnie stosowane²⁸.

Bardziej solidnym i obiektywnym sposobem jest użycie funkcji auto_rate(), która identyfikuje liniowe obszary danych. Są to regiony o stale utrzymującym się tempie oddychania, przypisywanym automatycznie za pomocą uczenia maszynowego. Funkcja ta jest również przydatna do wykrywania słabych sygnałów (jak w próbkach wykorzystanych w obecnym badaniu, ze względu na niską biomasę w tym wieku). Ta funkcja pozwala na identyfikację najbardziej liniowych, minimalnych i maksymalnych stawek przy użyciu niezależnych, obiektywnych i statystycznie solidnych metod²⁸. W tym przykładzie zidentyfikowano obszar liniowy występujący od około 3 000 do 5 000 punktów czasowych. Należy zauważyć, że można zidentyfikować wiele regionów liniowych, ale ta sekcja jest regionem o najwyższej randze lub najbardziej liniowym (Rysunek 8C).

#Determine najbardziej liniowa (tj. stała) stawka
Oceń <-auto_rate(insp)

Regulacja tła
Współczynniki tła z eksperymentów kontrolnych można wyznaczyć w podobny sposób jak w powyższym przykładzie i można je wykorzystać do dostosowania szybkości próbek za pomocą funkcji adjust_rate() (Rysunek 9A; zauważ, że pełna analiza nie jest tutaj pokazana, a jedynie korekta). Pełne przykłady są szczegółowo opisane na stronie internetowej respR.

#Adjust stawka za tło
rate_adj <-adjust_rate(rate, by = bg) #saved bg obiekt
Wydrukować(rate_adj)

Przelicz stawki
Ostatnim krokiem jest przeliczenie szybkości na pożądane jednostki wyjściowe, przy użyciu oryginalnych jednostek surowych danych, efektywnej objętości respirometru i innych danych eksperymentalnych, w tym normalizacji do ślepych pomiarów (Rysunek 9B). Wyjściem może być bezwzględna częstość oddychania, czyli cała próbka, lub szybkość specyficzna dla masy lub powierzchni. Współczynnik specyficzny dla powierzchni był wynikiem użytym tutaj, który w szczególności jest szybkością bezwzględną podzieloną przez pole powierzchni próbki (Rysunek 9C).

Jak omówiono powyżej, ten system został opracowany do pomiaru bardzo małych próbek. W związku z tym spodziewaliśmy się niskich wartości i potencjalnego pokrywania się z pomiarami ślepymi. Oczekuje się pewnego poziomu sygnału w ślepych próbach, a po zbadaniu wartości te mieszczą się w oczekiwanym zakresie ogólnego szumu eksperymentalnego, prawdopodobnie z powodu dryfu sondy, niewielkich zmian temperatury lub pęcherzyków na sondach. Ze względu na konstrukcję i ze względu na mały rozmiar próbki, a tym samym małą użytą objętość efektywną, zastosowanie półfabrykatów jest tutaj szczególnie ważne, zwłaszcza dla każdego cyklu. Reprezentatywne wartości zostały tutaj uwzględnione jako przykład (Rysunek 10). Biorąc pod uwagę mały rozmiar próbki, zalecamy stosowanie półfabrykatów w każdym cyklu w celu standaryzacji pomiarów w każdym cyklu.

Te puste wartości są następnie używane do standaryzacji wartości pomiarów leczenia. Biorąc pod uwagę, że koralowce oddychają oprócz produkcji tlenu, tempo przemiany materii może wahać się od wartości ujemnych do dodatnich. Przykład reprezentatywnych wyników zakresu wartości oddechowych wykrytych za pomocą narzędzia do mikrooddychania znajduje się tutaj. Wyniki te zostały ustalone na podstawie udanego eksperymentu na pojedynczych młodych koralowcach (Ryc. 10). Ogólnie rzecz biorąc, spodziewano się, że oddychanie będzie trudne do wykrycia w tym przykładowym zestawie danych (zgodnie z projektem), biorąc pod uwagę mały rozmiar próbek; Podkreśla to wartość tej metody w uchwyceniu tego niskiego progu sygnału. Te reprezentatywne wyniki wskazują na oddychanie w ciemności przy najmniejszych badanych próbkach, co podkreśla minimalny próg wykrywalności tego systemu. Mierzyliśmy również w dwóch warunkach (kontrola i stres związany z wysoką temperaturą). Po standaryzacji do ślepych prób mierzonych na serię, wartości wahały się od bliskiej zeru (kontrola) do mediany ~-^5e-5 dla leczenia stresu. Zgodnie z oczekiwaniami oddech był niski. Wyniki te wyraźnie pokazują reprezentatywne wartości dla ślepych prób, a także porównanie kontroli i wysokiej temperatury dla tych bardzo małych próbek.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie nowego narzędzia mikrorespirometrycznego do fizjologicznej charakterystyki holobiontu koralowca (zwierzę koralowe + symbionty) lub dowolnego małego organizmu (<1 mm). Wykonano niestandardowe komory respirometryczne (numery 1; 1.1-1.6). Należą do nich pokrywki (1.1) z plamkami czujnika tlenu (1.2), a osobnika młodocianego (1.3) umieszcza się na stojaku przepływowym (1.4) umieszczonym na mieszadle magnetycznym (1.5), z których wszystkie mieszczą się w szklanej komorze (1.6). Sterownik (2) jest przymocowany do miejsca za pomocą światłowodowego, który pasuje do pokrywy (1) i podłączony do komputera (3). Nagrzewnica/agregat chłodniczy (4) łączy się z płytą respirometryczną (5) z przepływającą wodą (oznaczoną strzałkami w jodełkę wskazującą kierunek), która znajduje się na górze płyty mieszadła (6) z kołami zębatymi (7), zasilaną przez silnik (8) i zasilacz (9). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja mikrorespirometrii. Dostępnych jest wiele opcji, w tym (A) jedna płytka respirometryczna lub (B) podłączona do wielu płytek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Specjalnie zbudowana płyta mieszadła magnetycznego na górze płytki respirometrycznej. Każda komora ma (A) mieszadło magnetyczne pod spodem, (B) napędzane silnikiem, z (C) płytką respirometryczną połączoną rurką z grzałką/agregatem chłodniczym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Niestandardowa konfiguracja komory respirometrycznej. (A) Komponenty (od lewej do prawej: pokrywka, szklana fiolka, podstawka, probówka 1,5 ml na wagę i mieszadło). (B) Indywidualny stojak przepływowy, w którym znajduje się próbka. (C) Widok z góry na stanowisko przepływowe. (D) i ze stojakiem umieszczonym wewnątrz szklanej fiolki z zakręconą pokrywką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Szklane fiolki umieszczone w płycie mieszadła. (A) Specjalnie zbudowana płyta mieszadła z (B) zbliżeniem kompletnej szklanej fiolki z pokrywką. Młodocianego koralowca można zobaczyć przez pokrywę (brązowa kropka), na górze opaski zaciskowej, ze światłowodem umieszczonym w otworze pokrywy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Komory odwrócone do góry nogami, gotowe do kalibracji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Kluczowe kroki w oprogramowaniu do pomiaru tlenu. (A) Sprawdź sygnał każdego czujnika. Optymalny sygnał dla tego badania i czujników jest pokazany w plamce czujnika tlenu FTC (normalny zakres). (B) Sprawdź dryft sygnału. (C) Ustaw i sprawdź temperatury zabiegu. (D) Ustaw i sprawdź kalibracje 0% i 100%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: kroki wyjściowe analizy respR I. (A) Sprawdź polecenie i wyjście. (B) Sprawdź stabilność kursu. (C) Określ najbardziej liniową stawkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Etapy wyjściowe analizy respR II. (A) Dostosuj szybkość tła, (B) Przelicz i (C) sprawdź stawki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą narzędzia do mikrorespirometrii. Mediana oddychania (O₂ ± błąd standardowy) powtórzonych osobników młodocianych koralowców, w tym wartości ślepej próby, a także oddychanie osobników pod kontrolą i warunki stresu o wysokiej temperaturze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Widok z góry na komorę respirometryczną z młodocianymi koralowcami w środku podczas sesji pomiarowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Tabela 1: Szacunkowe koszty komponentów aparatu do respirometrii. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Praca ta przedstawia konstrukcję niestandardowego zestawu do mikrorespirometrii, który może być wykorzystany do ilościowego określenia ilości tlenu zużywanego i wytwarzanego przez małe osiadłe organizmy wodne. Krytyczne elementy tego protokołu obejmują konfigurację komór, w tym miejsc, oraz kalibrację niskiego sygnału za pomocą pakietu respR , w którym niski sygnał można zdefiniować jako szybkości typowe dla płytkich lub hałaśliwych zboczy. Niestandardowa komora i jej konfiguracja pozwala na wykrywanie nawet słabych sygnałów, podczas gdy zastosowanie pakietu R pomaga zabezpieczyć się przed problemami, w których występowanie płytkich lub hałaśliwych nachyleń może prowadzić do błędnej interpretacji wyników (np. wyniki fałszywie dodatnie).

Potencjalne modyfikacje, które będą potrzebne dla innych użytkowników, obejmują m.in. zabezpieczenie interesującego nas organizmu w specjalnie wykonanej komorze. W tym przypadku użyto małej, sztywnej opaski zaciskowej i kleju akwariowego, aby przymocować pojedynczego młodego osobnika do plastikowej podstawy, która następnie została przyklejona do krawata. Należy zauważyć, że w tym eksperymencie młode koralowce umieszczono na czarnej folii plastikowej. Plastik ten pozwolił na łatwe usunięcie młodocianych koralowców, które skutecznie zsuwały się z plastiku, aby nie wyrządzić im fizycznej szkody podczas usuwania. Młodociane koralowce przyczepiają się do podłoża, na którym się osiadają, dlatego zaleca się osadzenie ich na podobnym materiale z tworzywa sztucznego, przy użyciu sztucznego peptydu¹⁶ , aby ułatwić ich usunięcie w procesie klejenia. Aby jeszcze bardziej zminimalizować stres związany z obsługą i wpływ na reakcję oddechową, zaleca się, aby koralowce zamontowane na opaskach zaciskowych aklimatyzowały się przez 1-2 tygodnie, jak to ma miejsce w wielu eksperymentach ze stresem u dorosłych koralowców. Mogą być potrzebne inne modyfikacje, aby zabezpieczyć organizm powyżej miejsca w pokrywie i umożliwić cyrkulację wody. Innym kluczowym krokiem rozwiązywania problemów jest wykrywanie sygnału, w szczególności na nachyleniu szeregu czasowego tlenu, w którym należy określić dawki. Ostatecznie sprowadza się to do połączenia zdrowego osądu w celu wykluczenia ewidentnie niestabilnych danych oraz funkcji w ramach respR , które umożliwiają wyodrębnianie wskaźników ze spójnie wybranych regionów lub automatycznie poprzez identyfikację liniowych regionów danych. Więcej informacji na temat tego, jak to zrobić, można znaleźć na stronie internetowej firmy .

Metoda ta została opracowana w celu rozszerzenia pomiarów dolnej granicy oddychania na niezwykle małe, siedzące bezkręgowce morskie. Oczywistym ograniczeniem jest to, że protokół ten może być bardziej podatny na fałszywe alarmy w porównaniu z protokołami zaprojektowanymi dla większych biomas. Biorąc jednak pod uwagę, że taki był cel projektu - aby zmierzyć te dolne limity - zostało to uwzględnione w projekcie, a procedura może być stosowana z pakietem respR , aby lepiej chronić przed fałszywie dodatnimi wynikami. Ważne jest również, aby przyznać, że istnieją inne systemy do pomiaru oddechu³⁰ i pomiaru małych organizmów, w tym respirometrii na pojedynczych widłonogach³¹ w mniejszych objętościach niż ta (~0,5-1 ml), ale są albo drogie, albo brakuje im określonych składników (zdolność mieszania). Jest to jednak system typu open source i stosunkowo niski koszt w porównaniu z systemami komercyjnymi (np. system Core Microplate). System ten uwzględnia również kluczowe względy metodologiczne, takie jak mieszanie, których innym systemom może brakować. Funkcja wewnętrznego mieszadła jest niezbędna do odtworzenia naturalnego mieszania wody przez wiele organizmów morskich (np. widłonogów poprzez pływanie), co często nie jest możliwe i może sprawić, że dane będą w dużej mierze bezużyteczne. W przeciwieństwie do tego, inne dostępne metody mieszania polegają na umieszczeniu całego respirometru na gigantycznej ławce bujanej, co wymaga dodatkowego wyposażenia i ma ograniczoną skuteczność w mieszaniu, lub mieszanie za pomocą wibracji, co może powodować zakłócenia w organizmie. Z tego powodu jest to jedyny system, który może wykonywać respirometrię na młodocianych koralowcach lub innych bardzo małych organizmach siedzących. Dla porównania, zakres wielkości uwzględnionych tutaj próbek wahał się od 2,1 do 3,6 polipów (co odpowiada zaledwie kilkumiesięcznemu wiekowi), przy czym średnia powierzchnia od minimalnej do maksymalnej wynosiła od 1,3 do 4,5 mm².

Respirometria jest podstawowym środkiem w badaniach ekologicznych i istnieje wiele metod służących do tego celu. Większość z tych istniejących metod jest jednak ukierunkowana na próbki o wysokiej biomasie, w tym całe ryby, fragmenty koralowców lub trawy morskie 32,33,34. Ta metoda jest pierwszą, w której wykorzystuje się indywidualne młode koralowce. Ponadto istnieje wiele potencjalnych zastosowań tej metody, ponieważ dostarcza ona kluczowych informacji fizjologicznych na temat funkcjonowania organizmu. Może to być ważne w przypadku badań, które mają na celu scharakteryzowanie podstawowych szacunków zdrowotnych³⁵, zrozumienie roli ostrego lub długotrwałego stresu podczas ontogenezy koralowców, takiej jak stres cieplny³⁶, lub określenie progów, które menedżerowie mogą ustalić, aby pomóc w ochronie i poprawie zdrowia raf koralowych³⁷. Biorąc pod uwagę, że koralowiec jest holobiontem, a społeczność symbiontów jest stosunkowo elastyczna na tym etapie i przez cały pierwszy rok życia³⁸, interesujące byłoby powiązanie danych respirometrycznych ze zmianami w społecznościach w czasie, aby w pełni skontekstualizować funkcjonowanie organizmu jako całości. Co ważne, metoda ta przyczynia się do rozwoju technik "otwartej nauki", które pomagają zapewnić zarys tworzenia niestandardowych konfiguracji eksperymentalnych, które można udostępniać, ulepszać i standaryzować w sposób otwarty.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
			Koszt
(1.1 – 1.6) Niestandardowe komory respirometryczne	LabGlass Party Ldt.	1,5 ml	$407.26
1.1 pokrywki warsztatowe	AIMS	Fiolka GL25 gwint	~ $10
1.2 plamki światłowodowe (optody światłowodowe FireStingO2 II)	PyroScience	Plamki czujnika tlenu, 125 i mikro; m folia PET, & Oslash; 5 mm, z izolacją optyczną, SN: 183801947	$41.25 AUD za
1.3 indywidualny organizm	NA		NA
1.4 Stojak przepływowy	Warsztat AIMS	Custom	w punktach 5 i 6 cena (warsztat dał mi szacunkową wartość pokrywek, stanowiska z kołami zębatymi, silnika, przepływu inkubacji przez
mieszadło magnetyczne 1,5	Każdy producent jest odpowiedni	na	~ 2 USD?
1.6 szklana komora (fiolka GL25 gwint x 20 mm wysokości, z wypukłością/grzbietem, płasko szlifowana krawędź, zakrętka z otworem, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD)	Labglass Pty Ltd, Stafford QLD	Vial GL25 gwint x 20 mm wysokości, z wypukłością/grzbietem, płasko szlifowana krawędź, zakrętka z otworem	$50.9 AUD
2 Kontroler FireSting (2)	PyroSciences	NA	4 czujniki to 4000 euro. 8 używanych tutaj czujników.
3 komputer	NA
NA 4 nagrzewnica	VWR International	NA	Małe modele około $4,000 AUD 5 platforma
z płytą respirometryczną	AIMS warsztat	34 cm x 26 cm x 3 cm (chociaż wszelkie wymiary są odpowiednie do dopasowania żądanej liczby komór)	$1250 AUD
6 mieszadeł z kołami zębatymi (7)	Warsztat AIMS	34 cm x 26 cm x 3 cm	$1250 AUD
8 Zasilany silnikiem	Warsztat AIMS	Niestandardowy	$700 AUD
9 zasilacz	Niespecyficzny	NA	~$300 AUD
Klej akwariowy	Seachem Klej rafowy	20g	$14
Oprogramowanie do rejestratora tlenu	PyroScience	NA	NA
Polypipe i złącza	John Guest	NA	$20
Siarczyn sodu	Sigma	S0505-250G (numer CAS 7757-83-7)	$54