Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym wpływu TnpB związanego z rodziną IS200/IS605 na aktywność transpozonów

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64825

⸱

20 stycznia 2023

 ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Microbiology Program, University of California, 3Biophysics Program, University of California

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół A jest opisany do wykonywania obrazowania na żywo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia, jak białko pomocnicze TnpB wpływa na dynamikę transpozycji w poszczególnych żywych komórkach Escherichia coli.

Streszczenie

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania na żywo w czasie rzeczywistym obrazowania aktywności elementów transpozycyjnych w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą zestawu fluorescencyjnych reporterów sprzężonych z transpozycją. W szczególności pokazano, w jaki sposób obrazowanie w czasie rzeczywistym może być wykorzystane do oceny wpływu białka pomocniczego TnpB na aktywność elementu transpozycyjnego IS608, należącego do rodziny elementów transpozycyjnych IS200/IS605. Rodzina elementów transpozycyjnych IS200/IS605 to liczne elementy ruchome związane z jednym z najbardziej niezliczonych genów występujących w przyrodzie, tnpB. Homologie sekwencji sugerują, że białko TnpB może być ewolucyjnym prekursorem systemów CRISPR/Cas9. Ponadto TnpB spotkał się z ponownym zainteresowaniem, ponieważ wykazano, że działa jako endonukleaza DNA sterowana RNA podobna do Cas. Wpływ TnpB na szybkość transpozycji IS608 jest określony ilościowo i wykazano, że ekspresja TnpB IS608 powoduje ~5-krotnie zwiększoną aktywność transpozonów w porównaniu z komórkami pozbawionymi ekspresji TnpB.

Wprowadzenie

Elementy transpozycyjne (TE) to elementy genetyczne, które mobilizują się w genomach gospodarza poprzez wycinanie lub katalizowanie kopiowania, po którym następuje reintegracja genomu. TE występują we wszystkich dziedzinach życia, a transpozycja restrukturyzuje genom gospodarza, mutując regiony kodujące i kontrolne1. Generuje to mutacje i różnorodność, które odgrywają ważną rolę w ewolucji2,3, development4,5 i kilku chorobach ludzkich6, w tym cancer7.

Korzystając z nowatorskich konstruktów genetycznych, które łączą aspekty aktywności transpozycyjnej z fluorescencyjnymi reporterami, nasza poprzednia praca opisała rozwój eksperymentalnego systemu opartego na bakteryjnym TE IS608, przedstawicielu szeroko rozpowszechnionej rodziny TE IS200/IS605, który pozwala na wizualizację transpozycji w czasie rzeczywistym w pojedynczych żywych komórkach8 (Rysunek 1). System TE jest wyświetlany w Rysunek 1A. TE składa się z sekwencji kodującej transpozazę, tnpA, otoczonej niedoskonałymi powtórzeniami palindromicznymi (IP) lewego końca (LE) i prawego końca (RE), które są miejscami rozpoznawania i wycinania TnpA. tnpA ulega ekspresji za pomocą promotora PLTetO1, który jest tłumiony przez represor tet i jest indukowany za pomocą anhydrotetracykliny (aTc)9. TE rozdziela sekwencje -10 i -35 konstytutywnego promotora PlacIQ1 10 dla niebieskiego reportera mCerulean311. Jak pokazano w Rysunek 1C, gdy produkcja tnpA jest indukowana, TE może zostać wycięty, co prowadzi do rekonstytucji promotora. Wyprodukowana komórka ulega ekspresji mCerulean3 i fluoryzuje na niebiesko. N-koniec TnpA jest połączony z żółtym reporterem Venus12, co umożliwia pomiar poziomów TnpA za pomocą żółtej fluorescencji.

IS608 i inni członkowie rodziny transpozonów IS200/IS605 zazwyczaj kodują również drugi gen nieznanej dotąd funkcji, tnpB13. Białka TnpB są niezwykle liczną, ale niedoskonale scharakteryzowaną rodziną nukleaz kodowaną przez kilka bakteryjnych i archeonów TEs14,15, które często składają się tylko z tnpB16. Co więcej, ostatnie badania odnowiły zainteresowanie TnpB, stwierdzając, że TnpB działa jako programowalna endonukleaza sterowana RNA podobna do CRISPR/Cas, która w różnych warunkach spowoduje pęknięcia dsDNA lub ssDNA17,18. Nie jest jednak jasne, jaką rolę TnpB może odgrywać w regulowaniu transpozycji. Aby przeprowadzić wizualizację w czasie rzeczywistym wpływu TnpB na transpozycję IS608, stworzono wersję transpozonu, w tym region kodujący TnpB z N-końcową fuzją z czerwonym białkiem fluorescencyjnym mCherry.

Uzupełniając bardziej szczegółowe badania na poziomie masowym przeprowadzone przez klasę Kuhlman lab19, pokazano tutaj, jak obrazowanie aktywności transpozonów w czasie rzeczywistym może ilościowo ujawnić wpływ TnpB lub innych białek pomocniczych na dynamikę transpozycji. Poprzez fuzję TnpB z mCherry, poszczególne zdarzenia transpozycyjne są identyfikowane za pomocą niebieskiej fluorescencji i korelowane z poziomami ekspresji TnpA (żółta fluorescencja) i TnpB (czerwona fluorescencja).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie kultur bakteryjnych

  1. Hoduj szczep E. coli MG1655 z konstruktami transpozonów plazmidowych (wcześniej opisanymi w Kim et al.8) przez noc w LB z odpowiednimi antybiotykami (25 μg/ml kanamycyny, patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Sekwencje użytych konstrukcji i powiązane sekwencje są dostępne jako GenBank20 numerów dostępu OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 i OP717085.
  2. Aby osiągnąć wykładniczy wzrost w stanie ustalonym, należy rozcieńczyć kultury ≥100 razy do pożywki M63 (100 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,8 μM FeSO4, 15 mM [NH4]2SO4, 0,5 μg/ml tiaminy [witamina B1]) uzupełnione źródłem węgla (tutaj 0,5% w/v glukozy) i odpowiednimi antybiotykami (patrz Tabela materiałów).
  3. Hodować kultury w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie ~0,2. Kultury są gotowe do użycia.

2. Przygotowanie slajdów

  1. Przygotuj szkiełko, gotując M63 z 0,5% w/v glukozy i 1,5% w/v agarozy w kuchence mikrofalowej, aby stopić agarozę i upewnić się, że jest całkowicie stopiona i dobrze wymieszana.
  2. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do ~55 °C przed dodaniem antybiotyków i induktorów (25 μg/ml Kanamycyny i 10 ng/μL anhydrotetracykliny [aTc], patrz tabela materiałów).
  3. Umieść szkiełko mikroskopowe na stole warsztatowym. Ułóż dwie kolejne szkiełka prostopadle do pierwszej i umieść kolejną na górze, równolegle do dolnej prowadnicy. Upewnij się, że między dolną a górną prowadnicą jest szczelina równa jednej grubości prowadnicy. Powoli odpipetować ~1 ml mieszaniny agarozy M63 do tej szczeliny między szkiełkami, aby utworzyć mały żelowy kwadrat.
  4. Gdy żel zastygnie (~10-15 min), przesuń górny szkiełko, aby je usunąć. Przytnij podkładkę agarozową żyletką lub nożem. Następnie odpipetować pipetą 2,5 μl kultury (krok 1.3) i nałożyć szkiełko nakrywkowe na wierzch.
  5. Uszczelnij przestrzeń między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym żywicą epoksydową (patrz tabela materiałów). Pozostawić żywicę epoksydową do wyschnięcia, a komórki osiądą na poduszce agarozowej przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

3. Timelapse mikroskopia fluorescencyjna

  1. Umieścić przygotowaną próbkę (krok 1.3) pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz tabela materiałów) w środowisku ogrzewanym i utrzymywanym w temperaturze 37 °C.
    1. Ustaw czasy naświetlania odpowiednie dla aparatu używanego do robienia zdjęć. Dostosuj intensywność oświetlenia, aby zminimalizować fotowybielanie.
      UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano czas ekspozycji wynoszący 2 s dla każdej długości fali.
    2. Dla każdej długości fali znajdź pole widzenia (FOV) zawierające minimalną fluorescencję. Zdobądź obrazy do wykorzystania podczas analizy w celu odejmowania tła.
  2. Skonfiguruj protokół, aby rejestrować obrazy w siatce na różnych długościach fal i w regularnych odstępach czasu.
    1. Zakoduj fotografię poklatkową w protokole. Ustaw częstotliwość akwizycji na żądany przedział czasu (tutaj 20 minut), a całkowity czas trwania timelapse na żądaną długość (24 h).
    2. Zakoduj odpowiednie długości fal w protokole (w zależności od użytej konstrukcji).
      UWAGA: Szczyt wzbudzenia mCherry przypada na 587 nm, a pik emisji na 610 nm21; mVenus znajduje się w odległości 515 nm i 527 nm12, podczas gdy mCerulean3 jest w odległości 433 nm i 475 nm11.
    3. Ustaw rozmiar siatki, aby przechwycić żądaną liczbę FOV.
      UWAGA: W przedstawionych tutaj reprezentatywnych danych użyto pól widzenia 8 x 8.

4. Analiza obrazu

  1. Wykonaj odejmowanie tła na każdym kanale koloru, używając odpowiednich obrazów tła uzyskanych w kroku 3.1.2. Do wszystkich etapów analizy używamy standardowych modułów na platformie open-source Fiji22 (patrz Tabela materiałów).
  2. Przybliż całkowitą populację w każdym momencie, progując kanał mCerulean i dzieląc obszar progowy przez średni obszar komórki.
  3. Aby policzyć unikalne zdarzenia wycinania, weź pochodną czasu kanału mCerulean3. Wykonaj to poprzez odjęcie kolejnych obrazów w kanale mCerulean3. Zdarzenia wycinania zostaną wykryte w pochodnej czasowej jako jasny błysk fluorescencji.
    1. Próg stosu zdarzeń wycinania w celu wyeliminowania niepożądanej fluorescencji. Należy pamiętać, że ten proces spowoduje wykluczenie części samych wycięć. Aby rozwiązać ten problem, rozszerz obrazy, aby przywrócić wycięcia do ich oryginalnych rozmiarów.
      UWAGA: Analizy przy użyciu podobnych technik progowania i analizy obrazu można przeprowadzić również na innych kanałach fluorescencyjnych (np. skorelować zdarzenia wycinania z poziomami transpozazy TnpA [żółta fluorescencja Wenus] i TnpB [czerwona fluorescencja mCherry].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ta metoda wizualizacji aktywności transpozonów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, mimo niższej przepustowości niż w przypadku pomiarów fluorescencji zbiorczej, umożliwia bezpośrednią obserwację aktywności transpozonów w pojedynczych żywych komórkach. Zdarzenia wycięcia transpozonu prowadzą do rekonstytucji promotora dla mCerulean3 (Rysunek 1), co pozwala na identyfikację komórek wykazujących aktywność transpozonów poprzez jasną niebieską fluorescencję (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj unikalna metoda obrazowania w czasie rzeczywistym aktywności pierwiastków transpozycyjnych w żywych komórkach jest czułym testem, który może bezpośrednio wykrywać transpozycję w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym oraz korelować tę aktywność z ekspresją białek pomocniczych. Chociaż przepustowość jest niższa niż można osiągnąć metodami masowymi, metoda ta pozwala na szczegółowe pomiary aktywności TE i ekspresji białek w poszczególnych żywych komórkach.

Różnorodne narzęd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Wsparcie finansowe dla tych badań zostało zapewnione przez fundusze startowe z Uniwersytetu Kalifornijskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 Ton Clear EpoxyDevcon31345
AgarozaSigma-Aldrich5066
Siarczan amonuSigma-AldrichAX1385-1
Chlorowodorek anhydrotetracyklinySigma-Aldrich37919
Argon LaserMelles Griot35-IMA-840-015
Niebieska kostka filtracyjnaChromaPrzykład: Z457/10X, EM: ET485/30M
D(+)GlukozaSigma-AldrichG7021
Eclipse Ti-E MikroskopNikonwycofany
z produkcji Eppendorf epTIPS Pudełka i tacki uzupełniające, objętość: 0,1 do 10 i mikro; L, Długość: 3,4 cm, 1,33 cala, PP (polipropylen)Eppendorf North America Biotools22491504
Eppendorf epTIPS Pudełka i tacki uzupełniające, Pojemność: 50 do 1000 i mikro; L, Długość: 7,1 cm, 2,79 cala, PP (Polipropylen)Eppendorf Ameryka Północna Biotools22491555
Siarczan żelaza Acs 500 gFisher Scientific706834
FidżiFidżi (imagej.net)
Odczynniki Fisher Rosół LB, Miller (granulowany)Fisher ScientificBP9723-2 
Prowadnica szklanaFisher Scientific12-542B 
Siarczan KanamycynySigma-Aldrich1355006
Siarczan magnezu Cert AcFisher ScientificXXM63SP3KG
Grzałka mikroskopuWorld Precision Instruments96810-1
Fosforan potasu jednozasadowyFisher Scientific17001H
ProScan III EtapPoprzedni
Czerwona kostka filtraChromaEx: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laserowakoherentna
, mikroskopFisher Scientific125535B
Chlorowodorek tiaminySigma-Aldrich (SIAL)T1270-100G
Ti-LU4 Laser LaunchNikon
Yellow Filter CubeChromaPrzykład: Z514/10X, Em: ET535/30M
szkiełko 1170412

Bibliografia

  1. Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
  2. Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
  3. Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
  4. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
  5. Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
  6. Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).
  7. Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11(2014).
  8. Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
  9. Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
  10. Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
  11. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896(2011).
  12. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  13. Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
  14. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  15. Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).
  16. Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
  17. Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
  18. Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
  19. Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
  20. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
  24. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bia ko TnpBobrazowanie w czasie rzeczywistymreportery fluorescencyjnekom rki bakteryjnewycinanie transpozonuanaliza pojedynczych kom rekmikroskopia fluorescencyjnareporter mCerulean3
Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym wpływu TnpB związanego z rodziną IS200/IS605 na aktywność transpozonów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.