Protokół A jest opisany do wykonywania obrazowania na żywo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia, jak białko pomocnicze TnpB wpływa na dynamikę transpozycji w poszczególnych żywych komórkach Escherichia coli.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym wpływu TnpB związanego z rodziną IS200/IS605 na aktywność transpozonów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania na żywo w czasie rzeczywistym obrazowania aktywności elementów transpozycyjnych w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą zestawu fluorescencyjnych reporterów sprzężonych z transpozycją. W szczególności pokazano, w jaki sposób obrazowanie w czasie rzeczywistym może być wykorzystane do oceny wpływu białka pomocniczego TnpB na aktywność elementu transpozycyjnego IS608, należącego do rodziny elementów transpozycyjnych IS200/IS605. Rodzina elementów transpozycyjnych IS200/IS605 to liczne elementy ruchome związane z jednym z najbardziej niezliczonych genów występujących w przyrodzie, tnpB. Homologie sekwencji sugerują, że białko TnpB może być ewolucyjnym prekursorem systemów CRISPR/Cas9. Ponadto TnpB spotkał się z ponownym zainteresowaniem, ponieważ wykazano, że działa jako endonukleaza DNA sterowana RNA podobna do Cas. Wpływ TnpB na szybkość transpozycji IS608 jest określony ilościowo i wykazano, że ekspresja TnpB IS608 powoduje ~5-krotnie zwiększoną aktywność transpozonów w porównaniu z komórkami pozbawionymi ekspresji TnpB.
Wprowadzenie
Elementy transpozycyjne (TE) to elementy genetyczne, które mobilizują się w genomach gospodarza poprzez wycinanie lub katalizowanie kopiowania, po którym następuje reintegracja genomu. TE występują we wszystkich dziedzinach życia, a transpozycja restrukturyzuje genom gospodarza, mutując regiony kodujące i kontrolne1. Generuje to mutacje i różnorodność, które odgrywają ważną rolę w ewolucji2,3, development4,5 i kilku chorobach ludzkich6, w tym cancer7.
Ko....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie kultur bakteryjnych
- Hoduj szczep E. coli MG1655 z konstruktami transpozonów plazmidowych (wcześniej opisanymi w Kim et al.8) przez noc w LB z odpowiednimi antybiotykami (25 μg/ml kanamycyny, patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Sekwencje użytych konstrukcji i powiązane sekwencje są dostępne jako GenBank20 numerów dostępu OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 i OP717085. - Aby osiągnąć wykładniczy wzrost w stanie ustalonym, należy rozcieńczyć kultury ≥100 razy do pożywki M63 (100 mM KH2PO4, 1 mM M....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ta metoda wizualizacji aktywności transpozonów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, mimo niższej przepustowości niż w przypadku pomiarów fluorescencji zbiorczej, umożliwia bezpośrednią obserwację aktywności transpozonów w pojedynczych żywych komórkach. Zdarzenia wycięcia transpozonu prowadzą do rekonstytucji promotora dla mCerulean3 (Rysunek 1), co pozwala na identyfikację komórek wykazujących aktywność transpozonów poprzez jasną niebieską fluorescencję (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj unikalna metoda obrazowania w czasie rzeczywistym aktywności pierwiastków transpozycyjnych w żywych komórkach jest czułym testem, który może bezpośrednio wykrywać transpozycję w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym oraz korelować tę aktywność z ekspresją białek pomocniczych. Chociaż przepustowość jest niższa niż można osiągnąć metodami masowymi, metoda ta pozwala na szczegółowe pomiary aktywności TE i ekspresji białek w poszczególnych żywych komórkach.
Różnorodne narzęd.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Wsparcie finansowe dla tych badań zostało zapewnione przez fundusze startowe z Uniwersytetu Kalifornijskiego.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agaroza | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Siarczan amonu | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Chlorowodorek anhydrotetracykliny | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Niebieska kostka filtracyjna | Chroma | Przykład: Z457/10X, EM: ET485/30M | |
| D(+)Glukoza | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Mikroskop | Nikon | wycofany | |
| z produkcji Eppendorf epTIPS Pudełka i tacki uzupełniające, objętość: 0,1 do 10 i mikro; L, Długość: 3,4 cm, 1,33 cala, PP (polipropylen) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Pudełka i tacki uzupełniające, Pojemność: 50 do 1000 i mikro; L, Długość: 7,1 cm, 2,79 cala, PP (Polipropylen) | Eppendorf Ameryka Północna Biotools | 22491555 | |
| Siarczan żelaza Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fidżi | Fidżi (imagej.net) | ||
| Odczynniki Fisher Rosół LB, Miller (granulowany) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Prowadnica szklana | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Siarczan Kanamycyny | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Siarczan magnezu Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Grzałka mikroskopu | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Etap | Poprzedni | ||
| Czerwona kostka filtra | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laserowa | koherentna | ||
| , mikroskop | Fisher Scientific | 125535B | |
| Chlorowodorek tiaminy | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Przykład: Z514/10X, Em: ET535/30M |
Bibliografia
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Micro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
